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Methodenartikel

Vagusnervstimulation als Instrument zur Plastizität in Pathways Relevant für Extinction Learning herbei

23.7K Aufrufe

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DOI:

10.3791/53032

⸱

21. August 2015

 ,  ,  , 
1School of Behavioral and Brain Sciences, The University of Texas at Dallas

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Vagusnervstimulation (VNS) hat sich als Instrument zur zielgerichteten synaptischen Plastizität im Vorderhirn zu veranlassen, eine Reihe von Verhaltensweisen ändern entstanden. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Umsetzung VNS, um die Konsolidierung der Angst Aussterben Speicher zu erleichtern.

Zusammenfassung

Extinction beschreibt den Prozess der Abschwächung von Verhaltensreaktionen auf neutrale Reize, wenn sie nicht mehr die Verstärkung bieten, die das Verhalten aufrechterhalten hat. Es besteht eine enge Korrelation zwischen Angst und menschlicher Angst, und daher könnten Studien zum Extinktionslernen Einblicke in die biologische Natur von angstbedingten Störungen wie der posttraumatischen Belastungsstörung geben und helfen, Strategien zu ihrer Behandlung zu entwickeln. Die präklinische Forschung zielt darauf ab, das Extinktionslernen zu unterstützen und gezielte Plastizität in Extinktionsschaltkreisen zu induzieren, um das neu gebildete Gedächtnis zu festigen. Die Vagusnervstimulation (VNS) ist ein leistungsfähiger Ansatz, der eine enge zeitliche und schaltkreisspezifische Freisetzung von Neurotransmittern ermöglicht, was zu einer Modulation neuronaler Netzwerke führt, die an einer fortlaufenden Aufgabe beteiligt sind. VNS verbessert die Gedächtniskonsolidierung sowohl bei Ratten als auch bei Menschen, und die Kombination von VNS mit der Exposition gegenüber konditionierten Hinweisen verbessert die Konsolidierung des Extinktionslernens bei Ratten. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von Sonderanfertigungen und die chirurgischen Eingriffe zur Verfügung, die für VNS bei Ratten erforderlich sind. Anhand dieses Protokolls zeigen wir, wie VNS das Auslöschen von konditionierten Angstreaktionen in einer auditiven Angstkonditionierungsaufgabe erleichtern kann. Darüber hinaus liefern wir Hinweise darauf, dass VNS die synaptische Plastizität im Signalweg zwischen dem infralimbischen (IL) medialen präfrontalen Kortex und dem basolateralen Komplex der Amygdala (BLA) moduliert, der an der Expression und Modulation des Extinktionsgedächtnisses beteiligt ist.

Einleitung

Klassische Angstkonditionierung stellt eine weit verbreitete Tiermodell, um die biologischen Grundlagen von Angststörungen zu untersuchen. Während der Furchtkonditionierung, ein aversiven Reiz (der unbedingten Reiz, USA, zum Beispiel ein Fuß-Schock) wird in Verbindung mit einem neutralen Reiz, wie eine Ton und / oder einem Kontext (; CS der bedingten Reiz) präsentiert. Während der Furchtkonditionierung, Verbände zwischen der CS und den USA ausgebildet. Schließlich wird die Präsentation des CS allein löst eine Angstreaktion (die konditionierte Reaktion; CR). In Furchtextinktion wird der CS wiederholt in der Abwesenheit der USA dargestellt, wodurch die CR allmählich verringern 1. So ist vom Aussterben konditionierter Angst ein aktiver Prozess, bei dem ängstlichen Verhaltensreaktionen auf neutrale Reize gedämpft werden, wenn sie nicht mehr aversive Ergebnisse vorherzusagen. Extinction konditionierter Reaktionen erfordert Konsolidierung neuer Erinnerungen, die mit gelernt Verbände konkurrieren. Ein Markenzeichen von Angststörungen ist impaired Aussterben 2-4. Somit dient Extinktion konditionierter Furcht in Tiermodellen als wichtiges Paradigma sowohl inhibitorische Lernen und als Verhaltensmodell für die menschliche Therapie von Angststörungen 5,6.

Da gibt es enge Korrespondenz zwischen Angst und menschliche Angst, wird angenommen, dass diese Studien können Einblick in die biologische Natur der Angst-Erkrankungen wie posttraumatische Belastungsstörung liefern und helfen, Strategien zu entwickeln, um sie zu behandeln. Ein wichtiges Ziel der präklinischen Forschung ist zum Aussterben Lernen zu unterstützen und um zielgerichtete Plastizität in Aussterben Schaltungen zu veranlassen, vom Aussterben Lernen zu festigen. Vagusnervstimulation (VNS) ist eine minimal-invasive neuroprothetischer Ansatz, der verwendet werden könnte, um enge zeitliche und Kreislauf-spezifische Modulation von Gehirnbereichen und Synapsen in fortlaufende Aufgabe beschäftigt ist. Eine Reihe von aktuellen Studien von Michael Kilgard Gruppe an der University of Texas at Dallas habengezeigt, dass die Paarung VNS mit diskreten sensorische oder motorische Reize (zB ein Ton oder ein Hebel ziehen) ist hoch wirksam bei der Förderung der kortikale Plastizität zur Behandlung von Tinnitus 7 oder motorische Defizite zu überwinden, nach Schlaganfall 8-10. Darüber hinaus Nicht-Kontingent VNS, die innerhalb eines kurzen Zeitfenster nach dem Lernen erfolgt in ähnlicher Weise fördert die kortikale Plastizität und verbessert die Gedächtniskonsolidierung bei Ratten und beim Menschen 11-13.

In Anbetracht der Rolle des Vagus in der parasympathischen Weges, ist es nicht verwunderlich, dass es bei der Modulation der Erinnerungen und der synaptischen Plastizität zu beteiligen. Hoch emotionalen Ereignisse neigen dazu, stärker Erinnerungen als Nicht-emotionalen Erinnerungen zu produzieren. Dies ist durch den Einfluss von Stresshormonen auf die Gedächtniskonsolidierung wahrscheinlich. Posttraining Verwaltung des Stresshormons Adrenalin erhöht die Speicherkonsolidierung in menschlichen und nicht-menschlichen Tieren, aber Adrenalin nicht die Blut-Hirn-Schranke 14, 15 kreuzen . Daher muss spannungsinduzierte Adrenalinausschüttung das Gehirn indirekt Einfluss auf die Gedächtniskonsolidierung zu verbessern. Starke Hinweise darauf, dass der Vagus kann die Verbindung zwischen zirkulierenden Adrenalin und dem Gehirn. Miyashita und Williams 16 festgestellt, dass die systemische Verabreichung von Adrenalin erhöht Vagusnerv Brennen, und erhöhte Noradrenalin in der Amygdala 17. Die systemische Verabreichung von Adrenalin nicht verbessern Gedächtniskonsolidierung, wenn β-adrenergen Rezeptoren in der Amygdala 18 was darauf hindeutet, dass der Vagus spielt eine Rolle bei der Bahn, die emotional erregende Erfahrungen verwandelt sich in Langzeitgedächtnis blockiert.

So Paarung VNS mit Ausbildung hat das Potenzial, um die Veränderungen im Gehirn, die Gedächtniskonsolidierung und der Exposition gegenAnlage Cues unterstützt in der Abwesenheit von Verstärkung erhöht die Konsolidierung des Aussterbens Lernen bei Ratten 19,20 verbessern. Hier beschreiben wir die Verwendung von VNS asa-Tool, um kortikale Plastizität fördern und Erlöschen einer konditionierten Angstreaktion zu erleichtern.

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Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren werden nach dem NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, und sie wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität von Texas in Dallas genehmigt.

1. Konstruktion des VNS Cuffs

  1. Erstellen Sie ein Bohrwerkzeug durch Absägen das scharfe Ende einer 22 ½ G Nadel.
  2. Führen Sie das jetzt stumpfen Ende der 22 ½ G Nadel über einem Metall Datei mehrmals, um sie zu glätten. Halten Sie die Nadel in einem Winkel von 45 ° auf die Datei und führen Sie es mehrmals über die Datei, während Drehen. Dies führt dazu, dass das Metall dünner und furl nach innen zu werden. ACHTUNG: Führen Sie die Spitze des Skalpells in den Schnitt Ende der Nadel und drehen Sie mit etwas Kraft nach unten, um das Metall zu entfalten.
  3. Verwenden Vergrößerungsfernglas für die verbleibenden Schritte in Abschnitt 1.
  4. Mit einem Skalpell (10 oder 15 Messer) geschnitten 4 mm Segmente der Schläuche.
  5. Legen Sie eine 4 mm-Segment mehr als einkleine Bohrer oder anderen ähnlich geformten Werkzeug. Dies ist, um den Schlauch in Position zu halten, während er betätigt wird.
  6. 4 Löcher in das Rohr (1A). Löcher sollten die vier Punkte von einer 2 mm um 2 mm im Quadrat zu machen und sollte sauber ohne Ecken und Kanten sein.
    HINWEIS: Das Bohrwerkzeug muss nachgeschärft werden (Schritt 1.2) alle 2 oder 3 Löcher. Schwierigkeit bei diesem Schritt ist nahezu sicher auf ein Bohrwerkzeug, die nicht scharf genug ist.
  7. Mit dem Schlauch noch am Bohrer, mit einem Skalpell, um den Schlauch in Längsrichtung zwischen den Öffnungen geschnitten, so dass zwei Löcher am Ende auf beiden Seiten des Schnitts (1B).
  8. Unter Verwendung einer Nähnadel und Faden, übergeben Naht durch die Löcher, um die Takelage für die ultimative Platzierung der Manschette um den Vagusnerv erstellen. Beginnen Sie mit der Nadel in der Manschette und führt es durch eines der Löcher, dann gehen Sie zurück durch den angrenzenden Loch von außen (Abbildung 1c). Binden Sie die thread zusammen ~ 2 cm aus dem Kunststoff, so daß der Schlauch und Faden bilden ein Dreieck. Lassen Sie ~ 8 cm Faden nach dem Knoten und trimmen. Wiederholen des Prozesses für die Löcher auf der gegenüberliegenden Seite des Ausschnitts. Der Schlauch ist nun bereit, verdrahtet werden.
  9. Bereiten Drähte für Manschetten.
    1. Schneiden Sie Platin-Iridium-Draht in 70 mm Segmente.
    2. Mit den besten Tipp für die Schmuck Fackel, erstellen Sie eine scharfe Flamme mit blauem Zentrum, das als raffinierte wie möglich ist, und es verwenden, um Streifen ~ 1 cm der Kunststoffbeschichtung von dem Draht. Übernehmen Sie die blaue Mitte der Flamme auf abisolierte Ende des Drahtes, um einen kleinen Ball zu erstellen. Übernehmen Sie die blaue Mitte der Flamme auf einige Punkte des abisolierten Teil, um die sieben Stränge miteinander zu verschmelzen. Der Draht in dieser Flecken erscheinen zu knicken.
    3. Am gegenüberliegenden Ende des Drahtes, gelten die blaue Mitte der Flamme an das Ende, um eine kleine Kugel zu schaffen. Minimieren Strippen der Kunststoff an diesem Ende.
  10. Verdrahten Sie die Manschette (1D).
    HINWEIS: Steps in Abschnitt 1.10 müssen unter Vergrößerungsfernglas durchgeführt werden.
    1. Kleben Sie die Manschette nach unten mit den Themen, so dass es mit der Schnitt horizontal verlaufausgerichtet ist. Ziehen Sie die Fäden fest, damit die Manschette aufgezogen und dann kleben Sie unten die Fäden.
    2. Fassen Sie die geballt Ende des abisolierten Seite des vorbereiteten Draht mit # 5 Zange und schieben Sie durch die untere rechte Loch. Ziehen die Zange aus dem Loch, so dass das Ende des Drahtes in der Mitte der Manschette.
    3. Re-greifen die geballt Ende des abisolierten Draht (jetzt in der Mitte der Manschette) und drücken Sie sie durch die obere rechte Loch. Ziehen Sie die Zange aus dem Loch, so dass der Draht vollständig durch die Manschette und lose auf der Oberseite der Manschette übergeben.
    4. Re-greifen die geballt Ende des abisolierten Draht (jetzt außerhalb der Manschette auf der Oberseite) und drücken Sie sie durch die obere rechte Loch von innen Rücken. Auch weiterhin tun, bis der Draht richtig an seinem Platz: Test durch Ziehen am anderen Ende des Drahtes.
      HINWEIS:Während dieses Prozesses ist es wichtig, die abisolierten / isolierter Abschnitte des Drahts zu unterscheiden. Der Draht, der schließlich in den "Trog" der Manschette positioniert ist, muss entfernt werden, aber alles unterhalb der Löcher (außerhalb der Manschette am unteren Ende) zu isolieren. Dies stellt sicher, Lieferung von Strom nur zu den Vagusnerv.
    5. Fassen Sie die geballt Ende des isolierten Seite und schieben Sie es durch die untere rechte Loch von der Innenseite der Manschette, um einmal looping es.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 1.10.2 - 1.10.5 auf der linken Seite der Manschette, so dass zwei Drähte enden an den Schlauch, eine auf der rechten Seite und einer auf der linken Seite befestigt.
    7. Legen Sie eine goldene Nadel in den Arm des helfende Hand mit dem Loch nach oben zeigt. Füllen Sie das Loch mit einem Flussmittel.
    8. Löten Sie die isolierten Ende des Drahtes (jetzt an der Manschette angebracht ist) in den Stift.
    9. Ermöglichen das Lot abkühlen und dann in der Schmelze wieder. Dies gewährleistet eine gute Verbindung zwischen dem Ende des Drahts und der inside des Stiftes. Bewerben mehr Lot, wenn nötig. Wiederholen Sie für die zweite Leitung.
    10. Mit den Leitungen laufen nach rechts, markieren Sie die Spitze der Manschette mit Permanentmarker. Markieren Sie außerdem die Goldstift an die Spitze führen befestigt.

2. Konstruktion Kopfhaube für VNS Eingang Website

  1. Schneiden Sie 30 mm Segmente 26 AWG Kupferdraht. Streifen einen kleinen Teil an jedem Ende.
  2. Schneiden Sie das schmale Ende off losen gold Stifte und löten Sie das abisolierte Ende des Kabels an das abgeschnittene Ende des Gold-Pin. Erstellen Sie zwei Draht / Stift-Verbindungen für jede gewünschte Eingangs Website. Legen Sie einen Stecker in die helfenden Hände und löten den Draht Ende eines Drahtes / pin-Verbindung zu der jeder der beiden gefluxte Zähne des Verbinders (2G).
  3. Mark einer der Drähte mit Filzstift. Während der Operation, positionieren Sie das Implantat mit dem gekennzeichneten Adern rostral zum freistehenden Draht.

3. VNS Surgery

  1. Schaffen Sie kundenspezifische Glaswerkzeuge für die Bearbeitung von Vagus Nerven während der Operation.
    1. Verwenden Borosilikatglas zu einer Mikropipette zu ziehen, so dass es eine lange konische Spitze. Wenn keine Pipettenzieher zur Verfügung steht, zu brechen das Glas, um eine längere Kante zu schaffen.
    2. Halten Sie den nicht verjüngten Ende der Pipette in ein dickes Tuch (um Verbrennungen zu vermeiden) und drücken Sie die verjüngende / gebrochen Ende zu einem glatten feuerfesten Oberfläche beim Auftragen der blauen Flamme von der Schmuck-Fackel, um das verjüngte Ende. Das Glas zu biegen, wie es in die Oberfläche gedrückt wird. Bewerben Flamme, bis einem Haken oder J-Form bildet.
  2. VNS chirurgischen Eingriffen
    1. Zu sammeln und zu sterilisieren alle Werkzeuge. Bereiten Sie eine Sanitär, beheizte Operationsgebiet.
    2. Betäuben Tieres mit Ketamin / Xylazin (85 mg / kg, 5 mg / kg, IP). Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose Ebene durch Überwachung Lautäußerungen des Tieres und Rücknahme-Reflexen in Reaktion auf die Zehen und / oder Schwanz Kneifen.
    3. Rasieren Sie die Spitze des Kopfes und linker Halsseite Tieres. Augen des Tieres zu schützen mit mineral Öl oder Augensalbe. Bewerben Jod Reinigungslösung mit Gaze und dann Alkohol mit Gaze auf die rasierte Bereichen. Wiederholen Sie einmal.
    4. Injizieren 0,05 ml Marcain subkutan auf der Oberseite des Kopfes und lassen Sie den Bolus zu zerstreuen, während, indem das Tier in den stereotaktischen Instrument.
    5. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Einschnitt in die Haut am Schädel sowohl Lambda und Bregma aussetzen zu machen. Vorbereitung eines Pfades für die Manschette mithilfe stumpfen Pinzette tunneln subkutan aus der Inzisionsstelle auf der linken Seite vor dem Ohr an der linken Seite des Halses.
    6. Ziehen Sie die Inzisionsstelle mit Gefäßklemmen geöffnet. Verwendung Wattestäbchen, gelten Wasserstoffperoxid zu der exponierten Schädels, um jegliches verbleibende Gewebe zu entfernen.
    7. Mit einem Skalpell, bohren Sie zwei flache Starter Löcher in den Schädel, um Ankerschrauben zu platzieren. Sie sollten weit genug voneinander entfernt, um Platz für das Implantat ermöglichen gesetzt werden, aber nicht zu nahe an dem umgebenden Gewebe. Vermeiden Sie es, Schrauben direkt an der Mittellinie.
      1. Mit Kraftps und Schraubenzieher, fahren eine Knochenschraube in beide Löcher. Die Schrauben sollten dicht sein in den Löchern, mit den Kappen 2 - 3 mm über der Oberfläche des Schädels, um Platz für Acryl erlauben, unter und um die Schrauben füllen.
    8. Füllen den Raum unter, um und zwischen den Schrauben mit einer kleinen Menge der Acrylsäure, die Vermeidung der umgebenden Gewebe. Dann einen größeren Menge Acryl in der Mitte des Schädels zwischen den beiden Schrauben.
    9. Schnappen Sie sich das Implantat, so dass die markierte Ader ist mit dem nicht markierten Draht orientiert rostral und schnell das Implantat in der Acryl, dabei nicht zu Acryl in die Gold-Pins, der Verschluss-Bereich, oder der Eingangsstelle auf Spitze. Nach der Positionierung zu ermöglichen, ~ 5 min, bis sie trocken gesetzt. Dies kann auch mit dem Arm des stereotaktischen Unterstützung durchgeführt werden. Füllen Sie Risse oder Lücken zwischen dem Implantat und Schädel mit einer niedrigen Viskosität Mischung aus Acryl. Trocknen lassen.
    10. Verwenden Vergrößerungsfernglas für die verbleibenden Schritte in Abschnitt 3.2.
    11. Entfernen the Tier aus der stereotaktischen Instrument. Legen Sie das Tier auf der rechten Seite, rotierende es leicht in die Bauchlage.
    12. Machen Sie einen kleinen Schnitt in etwa über die linke Halsschlagader. Der Kieferknochen und Schlüsselbein sollte etwa gleich weit in die Einschnittstelle sein. Erweitern Sie den Schnitt mit stumpf, bis der Muskelschicht erreicht ist. Die M. sternocleidomastoideus, M. sternohyoideus und M. omohyoideus Muskeln sichtbar sein soll. Verwenden Muskelwundhaken, um die Website offen zu halten.
    13. Weiter stumpfes Sezieren entlang der natürlichen Furchen zwischen den Muskeln. Achten Sie auf das Pulsieren der Halsschlagader. Überschrift durch den Muskel zu dem pulsierenden die Halsschlagader zu offenbaren. Ziehen Sie die Muskeln wieder mit dem Rückziehmuskel. Die Hülle, die die Halsschlagader enthält auch den Vagusnerv. Vorsichtig stumpf sezieren die Hülle mit der Schere.
    14. Identifizieren Sie den Vagusnerv. Es ist die größte Nerv im Karotisscheide und ist normalerweise zur linken Seite der Arterie des Tieressondern kann auf jeder Seite. Wechseln Sie in das benutzerdefinierte Glaswerkzeuge und trennen den Vagusnerv aus der Halsschlagader. Der Nerv sollte mindestens 5 mm frei von anderem Zellgewebe.
    15. Von dem Einschnitt auf dem Kopf, mit den Themen auf der Seite der Manschette gegenüber den Zuleitungen, ziehen Sie die Manschette über den zuvor gemachten subkutanen Tunnel mit einer Pinzette oder kleinen Gefäßklemmen. Schieben Sie es durch das Gewebe in die Einschnittstelle auf den Hals.
    16. Heben Sie die Nerven, das mit den Glaswerkzeuge und schieben Sie die Fäden auf der Seite der Manschette gegenüber den Leitungen unter dem Nerv. Ziehen Sie die Fäden den ganzen Weg durch, dabei nicht gegen die Nerven reiben. Die Manschette sollte unmittelbar neben dem Nerv.
    17. Stellen Sie sicher, die Manschette mit der Aufschrift "top" Seite überlegen orientiert. Löschen Sie die Nerven in die Mitte der Manschette. Der Nerv sollte nun über beide Leitungen liegen in der Mulde der Manschette (2B). Binden Sie die Fäden zusammen, um die Manschette zu schließen.
    18. Auf der Kopfhaube, stecken Sie die Stifte an der Manschette in die Gold-Pins auf der Stimulation Eingangsstelle angebracht. Stecken Sie das markierte Stift in die Goldstift zu den Frontzahn auf der Simulation Eingangsstelle angebracht.
    19. Zu überprüfen, dass die Manschette richtig stimuliert die Vagusnerv, führen Sie einen Atemstill Test verbindet den Stimulator an die Stimulationseingabestelle auf dem headcap Laufen Stimulation (0.2 mA, 60 Hz, bis zu 10 sec). Die Atmung sollte kurz stoppen und Herzfrequenz sollte fallen, die Überprüfung der Manschette Funktion.
    20. Sichern Sie sich die Pins auf der Stimulation Eingang Website mit Acryl. Decken Sie die Kabel und stellen Sie sicher, dass freiliegende Stifte und Drähte nicht zu Kurzschlüssen führen. Verwenden Acryl zu glätten keine Beulen oder in irgendwelchen Lücken zu füllen. Trocknen lassen.
    21. Naht verschlossen beide Inzisionsstellen. Injizieren 0,05 ml Marcain subkutan in der Nähe des Halses Einschnittstelle. Gelten antibiotische Salbe auf Websites Einschnitt. Optional lassen einen Stecker in Stelle auf der Stimulation Eingang Website zuSchutz vor Beschädigungen und Verstopfung während des Heilungsprozesses.
    22. Behandeln Sie mit Antibiotikum und folgen standard post-operative Betreuung einschließlich angemessenen Schmerzmitteln. Rückgabe Tiere Tierhaltung Anlage, nachdem sie die Mobilität wieder zu erlangen. Lassen Sie 5 Tage für Erholung. Um eine maximale Lebensdauer und Funktion der Kopfhaube, Haustieren einzeln für den Rest des Experiments zu gewährleisten.
      HINWEIS: Sham-VNS-Ratten durchlaufen die gleichen Operationen, aber die Schaltung ist mit kurzen auf der Ebene des Kopfhaube (dh ein headcap implantiert und die Vagusnerv aus der Halsschlagader getrennt, aber keine Elektrode Manschette um die angeordnet entworfen Nerv).

4. Auditory Angst Anlage

HINWEIS: Diese Angst Anlage Protokoll ist intensiver als die meisten 21, weil das Ziel dieser Versuche ist es, vom Aussterben zu verbessern. Mit milden Angstkonditionierung, die leicht ausgelöscht wird, kann ein Bodeneffekt dieser Erweiterung zu verschleiern.

  1. Haustieren auf einem 12 h Hell / Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser. Griff Tiere täglich während der Erholung von der Operation.
  2. Einrichten des Anlage und Prüfvorrichtung, bestehend aus einer operanten Feld in einer schallgedämpften Kammer (2C) untergebracht ist. Die operante Feld hat klare Kunststoffwände, 20 x 20 x 20 cm und verfügt über eine Edelstahl-Gitterboden, der zu einem Fuß-Schock-Generator angeschlossen ist. Verwenden Sie ein weißes Haus-Licht, um die Kammer für die Videoaufzeichnung zu beleuchten. Verwenden Sie einen 9 kHz, 85 dB SPL Ton als konditionierter Reiz.
  3. Nehmen Sie das Verhalten mit einer Digitalkamera in der Kammer, über der operanten Feld. Sehen und die Sitzung auf einem Computer außerhalb des Verhaltens Raum befinden überwachen. Speichern Sie Videos für die spätere Analyse.
  4. Wisch Kammern mit 70% Ethanol vor und nach jeder Sitzung olfaktorischen Signale zu eliminieren.
  5. Angst konditionieren die Ratten für 2 Tage (3A). Bestätigen Sie, dass die Ratten nicht innierend Angst vor der Ton durch die Vorlage 5 Töne (9 kHz, 85 dB, 30 sec) am ersten Tag. Stellen Sie sicher, dass das Einfrieren Ebenen vernachlässigbar sind.
    1. Folgen Sie den ursprünglichen Ton Präsentationen mit 8 Ton-Fuß-Schock (1 sec, 0,5 mA) Paarungen auf jeder der 2 aufeinanderfolgenden Tagen. Wiederholen Sie die Ton-Fußschock Paarungen wieder am zweiten Tag. Variieren Sie die Inter-Stimulus-Intervall (ISI) zwischen 2 und 4 min mit durchschnittlich 3 min für jede Studie. Zufälliger Punkt, an dem während der Ton der Schock auftritt.
  6. Am dritten Tag, testen Sie die Stärke der Ton / Schock Vereins. Wiedergabe 4 Tönen mit einem ISI von 3, 4, oder 5 min (4 min Durchschnitt) in der Abwesenheit von Fußschocks und notieren Einfrieren Verhalten der Tiere während der Ton-Präsentationen und in den Inter-Stimulus-Intervalle als Maßnahmen der konditionierten Angstreaktion (CFR).
  7. Am Tag 4 beginnt Aussterben Training mit VNS oder Sham VNS.
    1. Stecken Sie die Ratten in den Stimulator, indem Sie die Stecker aus der StimulatoR in den Stimulationseingabestelle. Ort Tiere in die Kammer (2A, 2C). Stellen Sie den Stimulator auf 0,4 mA, 500 & mgr; s Pulsbreite bei 30 Hz. Stellen Stimulation zu einer Gesamtlaufzeit von 30,15 sec, ab 150 msec vor dem Einsetzen des Tons. Spielen Tieren 4 Töne (wie in Schritt 4.6) und koppeln jeden Ton-Präsentation mit VNS oder Sham VNS.
  8. Von Zeit zu Zeit testen Sie die elektrische Integrität der Manschette und Eingangs Website mit einem Oszilloskop.
    1. Stecker das Tier in als normal und spalten die Ausgabe von dem Stimulator zum Oszilloskop.
    2. Stellen Sie den Bereich auf dem Oszilloskop als -20 V bis +20 V und führen Stimulation. Die Wellenform des 30 Hz Stimulation sollte auf dem Oszilloskop angezeigt werden. Stimulationen von mehr als 10 V in Größe zeigen mit hoher Impedanz und einem nicht korrekt funktionierenden Manschette oder Verbindung an der Stimulation Eingang Website.
  9. Um die Wirkung der VNS am Aussterben Training testen führen Sie einen zweiten CFR Test (wie in Schritt 4.6)am Tag 5 Nehmen Sie die Zeit, das Einfrieren während Ton Präsentationen und zu vergleichen, um Grundlinien Einfrieren während des ersten Test CFR (Schritt 4.6) aufgezeichnet.
  10. Analysieren Sie die Videos mit Hilfe eines unabhängigen Beobachter, der blind für die Behandlungsbedingungen ist. Messen Sie Zeit damit verbracht, das Einfrieren bei Ton-Präsentationen mit einer Stoppuhr. Einfrieren ist als komplette Immobilität, während der der Ratte zeigt schnelle Atmung, gesenktem Kopf definiert und verteilt Pfoten 22. Analyse von Gefrierverhalten kann in zwei Phasen unterteilt werden: während der Ton-Präsentation und während der Inter-Stimulus-Intervall.

5. In vivo-Recordings der evozierte Feldpotentiale

Anmerkung: Dieser Schritt ist optional. Evozierte Feldpotentiale (EFP) in Isofluran-narkotisierten Ratten in einem stereotaktischen Apparat montiert ist, nach Standardverfahren aufgezeichneten 23,24 24 Stunden nach Tests der Wiedereinstellung (Tag 5).

  1. Zu sammeln und zu sterilisieren alle Werkzeuge.
  2. Induzieren Narkose mit Isofluran (5% in 100% Sauerstoff, Durchfluss 1l / min) in einem durchsichtigen Kunststoff-Kammer. Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose Ebene durch Überwachung Lautäußerungen des Tieres und Rücknahme-Reflexen in Reaktion auf die Zehen und / oder Schwanz Kneifen. Verwenden Mineralöl oder Augensalbe die Augen zu schützen.
  3. Injizieren 0,05 ml Marcain subkutan auf der Oberseite des Kopfes und lassen Sie den Bolus zu zerstreuen. Verwenden Sie ein Skalpell und Gefäßklemmen, um die Kopfhaube aus dem Schädel zu entfernen. Verwenden Sie so wenig Kraft wie möglich zu verschleiern Bregma.
  4. Legen Sie das Tier in der stereotaktischen Instrument. Verwenden Sie ein Skalpell, um den Einschnitt sowohl Lambda und Bregma aussetzen erweitern. Aufrechtzuerhalten Narkose Ebene mit Isofluran (3% in 100% Sauerstoff, Durchfluss 1 l / min) über einen Nasenkonus.
  5. Die Bohrungen in den Schädel über dem infralimbischen präfrontalen Kortex (IL) und der basolateralen Amygdala (BLA). Senken einer Glasmikroelektroden (2 M KCl; 1-2 MOhm Widerstand) in die BLA (D / V: 7,2, A / P: 2,7, M / L: 4,9 von Bregma) und eine stimulatIonenelektrode in die IL Bereich des medialen präfrontalen Kortex (D / V: 4,6 A / P: 3,0, M / L: 0,7 vom Bregma) (4A).
  6. Stimulieren die IL auf EFPs in der BLA evozieren. In Figur 4 gezeigten Daten wurden mit den folgenden Einstellungen erfasst: ein Stimulationsimpuls von 0,3 ms Dauer, mit einer Stimulationsintensität, die auf 40% der minimalen Stromstärke, der eine maximale Feldantwort hervorgerufen entsprach (auf Grundlage eines Eingangs-Ausgangs-Kurve vor fest Sammlung von Basisdaten) lieferte alle 15 sec.
  7. Sammeln Ausgangsdaten für ein Minimum von 10 bis 15 min vor der Induktion der synaptischen Plastizität.
    HINWEIS: Die zur synaptischen Plastizität hervorzurufen wird den Anforderungen der Experimente variieren und müssen sorgfältig von jedem Experimentator gewählt werden Protokoll. Daten in 4C zeigt Veränderungen in der EFP folgenden 3 Ausbrüche von 100 Pulse bei 50 Hz (2 sec), mit 20 sec Inter-Burst-Intervalle bei der minimalen Stromstärke, die evozierend die maximale Feld Antwort.
  8. Messen der Amplitude des EFP als die Differenz zwischen dem Mittelwert einer 5 msec Fenster, bevor der Stimulationsartefakt und der Mittelwert von 5 msec Fenster um 20 bis 25 ms nach dem Stimulationsartefakt, entsprechend dem negativen Spitzenwert des Feldpotentials. Normalisieren Daten zu den Ausgangswerten und den Durchschnitt von 10 Minuten Grundlinie als 100%. Mit den gemittelten EFP Amplituden weitere 10 Minuten Zeit nach Plastizität Induktion (zB 40 - 50 min nach Induktion), um langfristige Veränderungen in EFP Amplitude zu bewerten.
  9. Nach dem Ende der Aufnahme zu enthaupten die narkotisierten Tier und extrahieren das Gehirn. Bereiten Gewebe zur histologischen Überprüfung der Elektrodenplatzierung.

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Ergebnisse

In diesem Abschnitt werden Beispiele für Ergebnisse, die durch die Verwendung VNS in Kombination mit vom Aussterben Lernen, um die Expression des konditionierten Angstreaktion in Ratten zu verringern gewonnen werden können. Für den Tagen 1 und 2 (Auditory Angst Anlage) wurden die Ratten auf einem Gehörfurchtkonditionierung Aufgabe, in der Fußschocks wurden mit einem Ton, gepaart geschult. Am Tag 3 (Pre-Behandlung Test), wurden Töne in der Abwesenheit von Fußschocks, um ein Einfrieren zu messen und zu schließen Anlage An...

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Diskussion

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, das verwendet wird, um vom Aussterben konditionierter Angst während einer einzigen Sitzung der Exposition gegenüber konditionierten Signale 19 zu erleichtern und die Plastizität in den Weg zwischen dem infralimbischen Kortex und der basolateralen Amygdala, die vermitteln können Aussterben Lernen 20 zu modulieren. Ein entscheidender Schritt für den Erfolg dieses Protokolls ist die ordnungsgemäße Lieferung der VNS bei Aussterben Ausbildung. Daher sollte besondere...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen oder Konflikte.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom National Institute of Mental Health MH 086960-01A1 (Christa K. McIntyre) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alkohol
AtropinFisherA0132-5G
BetadineHenry Schein69066950
Wasserstoffperoxid CVS209478
KetaminHenry Schein 1129300
MarcainHenry Schein6312615
MineralölCVS152355
NeosporinCVS629451
SauerstoffHome Depot304179
PennicillinFisherPENNA-10MU
PropanHome Depot304182
XylazinHenry Schein4019308
Werkzeuge
Schmuck FackelSmith Ausrüstung23-1001D
NähnadelWalgreens441831
#5 Pinzette (2)Fine Science Tools11254-20
LötkolbenHome Depot 
AmScope SM-4TX-144A 3,5X-45X Leiterplattenausleger Stereomikroskop + 144 LEDAmScopeSM-4TX-144A
Helfende HändeA-M Systems 726200
SkalpellklingenhalterFine Science Tools10003-12
MetallfeileHome Depot6601
LinealHome Deopt202035324
gebogene Hämostaten Fine Science Tools130009-12
Feine SchereFine Science Tools14058-09
SpatelFine Science Tools
Kleiner SchraubendreherHome Depot646507
Magnetfixator RückzugssystemFine Science Tools18200-04, 18200-01, 18200-05
HeizkissenWalgreens30294
ClippersWalgreens277966
SharpieStaples125328
Ring PinzettenFine Science Tools11103-09
Custom Mikropipette Glaswerkzeuge (J-Form und gerade) - BorosilikatglasSutter InstrumentB150-110-10
Adson PinzetteFine Science Tools11006-12
Manschetten
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5k Ohm PotentiomterAlpha ElectronicsB00CTWDHIO
Extech 407730 40 bis 130 Dezibel Digitaler SchallpegelmesserExtech InstrumentsB000EWY67W
DSCK-C Dual Output, verschlüsselt SchockerKinder Scientific Co
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