Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen ( Microcystis aeruginosa) Mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Mikrobenpopulationen enthalten, die wesentliche Zellheterogenität, das allgemeine Verhalten diktieren können. Molekulare Sonde Analyse durch Durchflusszytometrie können physiologische Zustände von Zellen zu bestimmen, aber ihre Anwendung variiert zwischen den Arten. Diese Studie liefert ein Protokoll, um genau zu bestimmen, Zellmortalität innerhalb von einem Cyanobakterium Bevölkerung, ohne zu unterschätzen oder Aufzeichnungs falsch positiven Ergebnissen.

Zusammenfassung

Mikrobielle Subpopulationen in Feld- und Laborstudien haben gezeigt, dass hohe Heterogenität in der morphologischen und physiologischen Parametern. Bestimmen der Echtzeitzustand einer mikrobiellen Zelle geht über lebenden oder toten Kategorien, wie Mikroben in einem Ruhezustand, wobei die Zellteilung und metabolische Aktivität vermindert existieren. Da es notwendig ist für die Detektion und Quantifizierung von Mikroorganismen, Durchflusszytometrie (FCM) mit molekularer Sonden stellt ein schnelles und genaues Verfahren, um festzustellen Gesamtpopulation Lebensfähigkeit. Durch die Verwendung von SYTOX Grüne und orange SYTOX im Modell Cyanobakterien Microcystis aeruginosa, um die Integrität der Membran zu erkennen, entwickeln wir eine übertragbare Methode für die schnelle Anzeige der einzelnen Zelle Sterblichkeit. Die molekulare Sonden in dieser Zeitschrift verwendet wird als grün oder orange Nukleinsäure-Sonden bezeichnet werden (obwohl es auch andere Produkte mit ähnlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen, die eine vergleichbare Formen der actio habenn, die wir ausdrücklich auf die vorderen erwähnten Sonden). Protokolle mit molekularen Sonden variieren zwischen den Arten, die sich hauptsächlich in der Konzentration und Inkubationszeiten. Nach diesem Protokoll auf Microcystis aeruginosa setzen die grüne Nucleinsäuresonde wurde bei Konzentrationen von 0,5 & mgr; M nach 30-minütiger Inkubation und die orange Nucleinsäuresonde bei 1 uM nach 10 min optimiert. In beiden Sonden Konzentrationen von weniger als der angegebenen optimalen Rahmen Berichterstattung von Zellen mit Membranschäden führten zu einem. Umgekehrt, 5 uM Konzentrationen und höher in beiden Proben zeigte eine Art von nicht-spezifischer Färbung, wobei "live" Zellen erzeugt einen Ziel Fluoreszenz, was zu einer überproportionalen Anteil "abgetötet" Zellzahlen. Die positiven Kontrollen (durch Hitze abgetöteten) vorgesehen testbare tote Biomasse, auch wenn die Angemessenheit der Steuerungsgeneration bleibt umstritten. Durch den Nachweis einer logischen Sequenz von Schritten für die Optimierung der grün und orange Nucleinsäuresonden wir demonstrate, wie ein Protokoll, das verwendet werden kann, um Cyanobakterien physiologischen Zustand effektiv zu analysieren erstellen.

Einleitung

Die Zelle ist ein komplexes System, das ständig reagiert auf die Umwelt durch die Beeinflussung der physiologischen Parameter und ihre Funktion zu verändern. Die Populationsdynamik von isogenen mikrobiellen Populationen sowohl in der Natur und das Labor werden durch die Entwicklung von Unterpopulationen betroffen sind, auftreten, auch unter relativ konstanten Umgebungsbedingungen ^1-3. Die Variabilität der natürlichen mikrobiellen entsteht durch die hohe Variabilität der Umweltbedingungen. Diese manchmal stochastische Prozesse anschließend produzieren Subpopulationen, die sehr unterschiedlich zu dem Bevölkerungsdurchschnitt liegen. Neu....

Protokoll

1. Vorbereitung der Molecular Probe und Durchflusszytometer

1. Verdünnte Lösungen der Nukleinsäure-Sonden, die als eine 5 mM Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) geliefert werden Aliquots der erforderlichen Konzentrationen in ultrareinem _H 2 O. gefilterten
2. Bewahren Sie die Nukleinsäuresonden in dunkler Umgebung zwischen -5 ^{° C und} - ²⁵ ° C bis zur Verwendung.
3. Schalten Sie das Durchflusszytometer und Last-Software-Paket (siehe Tabelle der Werkstoffe / Ausrüstung für die FCM-Spezifikationen).
4. Stellen Sie eine leere Hämolyse Rohr (12 x 75 mm) an der Probeninjektionssonde (SIP), klicken Sie auf Sprünge z....

Ergebnisse

Vorwärtslichtstreuung (FSC) und Seitenlichtstreuung (SSC) Ausgänge von einer Microcystis aeruginosa Batch-Kultur in exponentiellen Phase liefert Informationen über Zellgröße (Durchmesser) und interne Granularität bzw. (Abbildung 1A). FSC können Zellen, die zu groß und / oder klein sein Microcystis aeruginosa sind, diskriminieren. Diese Diskriminierung oder Gating durch Raffination von Daten zwischen bestimmten Punkten eines FSC-Ausgang (1C)

Diskussion

Die erhöhte Anzahl von Publikationen mit molekularen Sonden zeigt an, dass verlässliche und aussagekräftige Daten erhalten ^5,6,8 werden ^{- 15,19,22,23.} Als der noch gibt es keine perfekte Färbung für die Lebensfähigkeit der Zellen, die wirksam sein kann für alle Arten mit der gleichen Konzentration und Inkubationszeit ^6,10. Sogar die gleiche Art von Sonden mit veränderten Fluoreszenzemissionen zeigt die Notwendigkeit, die richtige Konzentration und Inkubationszeit (Tabe.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Konzentrierte Süßwasserlösung (50x Verdünnung)
Dekontaminationsflüssigkeit	BD Biosciences	653155	Laufen Sie 2 Minuten lang, wenn die Ausgänge mehr als 12 Ereignisse pro Sekunde bei schnell oder einer Durchflussrate von 66 & Mikro betragen; l/min.  Gefolgt von 2 min Hülle H2O.
Durchflusszytometer	BD Biosciences	auf Anfrage	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nukleinsäurefärbung – 5 mM Lösung in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nukleinsäurefärbung – 5 mM Lösung in DMSO