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Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

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DOI:

10.3791/53057

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23. Juli 2015

 ,  , 
1Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 2Proteomics Platform, Broad Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Anreicherung von EZM-Proteinen aus Geweben oder Tumoren und zur Deglykosylierung und Verdauung der mit EZM angereicherten Präparate zu Peptiden, um ihre Proteinzusammensetzung durch Massenspektrometrie zu analysieren.

Zusammenfassung

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Geflecht von vernetzten Proteinen, die biophysikalische und biochemische Signale, die wichtigsten Regulatoren der Zellproliferation, Überleben, Migration, etc. sind die ECM spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung und in diverse Pathologien einschließlich Herz-Kreislauf bietet und Muskel-Skelett-Erkrankungen, Fibrose und Krebs. Somit charakterisieren die Zusammensetzung ECMs von normalen und erkrankten Geweben könnte zur Identifizierung neuer prognostische und diagnostische Biomarker und potentielle neue therapeutische Targets führen. Allerdings hat die Natur des ECM-Proteine ​​(groß, vernetzt und kovalent gebunden, stark glykosyliert) biochemische Analysen der ECMs anspruchs gerendert. Um diese Herausforderung zu meistern, eine Methode, um ECMs von frischem oder gefrorenem Gewebe und Tumoren, die Vorteile der Unlöslichkeit von ECM-Proteinen führt zu bereichern entwickelten wir. Wir beschreiben hier im Detail die Dezellularisierung Prozedur, die von aufeinanderfolgenden i bestehtncubations in Puffern mit verschiedenen pH und Salz und Detergens-Konzentrationen und die Ergebnisse in 1) die Extraktion von intrazellulären (cytosolische, Kernmembran und Zytoskelett) Proteine, und 2) die Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen. Wir beschreiben nun, wie deglycosylieren verdauen ECM angereicherte Proteinzubereitungen in Peptide für die anschließende Analyse durch Massenspektrometrie.

Einleitung

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Geflecht aus vernetztem und glycosylierte Proteine, die architektonische Unterstützung und Ankerplatz für Zellen und definiert bietet, zum Teil, Gewebe 'biomechanischen Eigenschaften 1,2. ECM-Proteine ​​Signale auch auf den Zellen entweder direkt durch ihre Rezeptoren (zB Integrinen Syndecane usw.) oder durch Modulieren Wachstumsfaktor-Signalisierungs 3. Das ECM stellt somit biophysikalische und biochemische Signale, die wichtigsten Regulatoren der zellulären Prozessen wie Proliferation, Überleben, Polarisation, Differenzierung, Migration, etc. sind

Das ECM spielt eine Schlüsselrolle in der Physiologie, Entwicklung und Alterung 4. Darüber hinaus sind mehrere Pathologien wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Fibrose, Muskel-Skelett-Erkrankungen, Krebserkrankungen, hervorgerufen durch oder führen, ECM Veränderungen. Außerdem trägt die ECM für die Aufrechterhaltung der Stammzellnischen und die Identifizierung von wichtigen ECM-Moleküle thUnterstützung bei stemness haben direkten Anwendung im Tissue Engineering und der regenerativen Medizin 5. Trotz seiner Bedeutung hat die ECM blieb bis vor kurzem underexplored 6.

In-silico-Analyse ergab, daß das matrisome, definiert als die Gesamtheit der ECM und ECM-assoziierten Proteinen umfasst, die Produkte von mehreren hundert Genen sowohl in der Human- und Maus-Genom 1,7,8. Allerdings hat die Unlöslichkeit ECM Proteine ​​die systematische Charakterisierung der Zusammensetzung der in vivo extrazellulären Matrizen von normalen und pathologischen Proben behindert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass diese Unlöslichkeit könnte wandte sich vorteilhaft eingesetzt werden und verwendet werden, um ECM-Proteine ​​bereichern 8 - 10. Wir und andere weiter gezeigt, daß die Massenspektrometrie ein Verfahren der Wahl, um die Zusammensetzung zu charakterisieren ECMs 8 - 10, 13.

Wirbeschreiben hier eine Dezellularisierung Prozedur, die von aufeinanderfolgenden Inkubationen in Puffern unterschiedlicher pH-Wert und Salzkonzentrationen und Reinigungsmittel besteht. Dieses Verfahren resultiert in der Extraktion (oder Verarmung) cytosolischer, Kernmembran und Zytoskelettproteine ​​und die Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen. Wir beschreiben nun, wie ECM-angereicherten Proteinzubereitungen in Peptide für die anschließende Analyse durch Massenspektrometrie verdauen.

Unter Verwendung der Verfahren detailliert und hier dargestellt, haben wir erfolgreich angereichert und durch Massenspektrometrie die extrazelluläre Matrix aus zehn verschiedenen Geweben und Tumorarten: normal Mäuselunge 8, humanen und murinen Colon 8,9, menschliche Leber 9, menschlichen kolorektalen Tumoren und abgeleiteten Leber-Metastasen 9, Melanom Xenotransplantate 8, Mammatumor-Xenotransplantaten 10. murine Pankreasinseln und murine Insulinom (Nabas et al., unveröffentlicht). Der Vergleich der verschiedenen matrisomes ergab gewebe- und tumorspezifischen ECM Signaturen weiterhin als mögliche diagnostische oder prognostische Biomarker verwendet werden könnten.

Wir glauben, daß dieses Verfahren auch für andere Proben ohne oder mit nur relativ geringfügigen Modifikationen angewandt werden.

Protokoll

HINWEIS: Das Verfahren kann auf frisch oder schockgefroren Gewebe durchgeführt werden. Wir empfehlen Perfusion stark vaskularisierten Gewebe mit PBS bei der Präparation zu beseitigen roten Blutzellen und Plasmaproteine. Wir empfehlen nicht, die Durchführung der Verfahren auf festen Geweben Fixierung (dh chemische Vernetzung) stört Dezellularisierung und kann auch nachfolgende Massenspektrometrie-Analyse erheblich beeinträchtigen. Für das gesamte Verfahren, empfehlen wir den Einsatz von Low-Haltegefäße und Pipettenspitzen, um Protein- und Peptid-Erholung zu maximieren.

1. Dezellularisierung von Geweben oder Tumoren

Hinweis: Bevor Sie beginnen, bereiten Sie die Reagenzien und fügen Sie Protease-Inhibitoren (mit dem Compartment Protein Extraction Kit enthalten) auf die gewünschte Lautstärke der einzelnen Puffer. Alle Puffer und Proben sollten für die Dauer des Experiments, außer dem Puffer CS, die bei Raumtemperatur gehalten werden, um zu verhindern, muss SDS Werte auf Eis gehalten werden,itation.
ANMERKUNG: Das Protokoll verwendet eine Reihe von Inkubation in Puffern verschiedener pH-Wert und die unterschiedliche Menge an Salzen und Detergentien zu extrahieren intrazelluläre Proteine ​​sequentiell und bereichern unlösliche ECM Proteine ​​(Figur 1, Tabelle 1, siehe auch Beiträge zu Alternativen für die Verwendung des kommerziellen Kit hier beschrieben). Die Volumina der Reagenzien unten sind für 100 mg von Geweben oder Tumoren (siehe Tabelle 1) und müssen entsprechend angepasst werden.

  1. Homogenisieren 100 mg Gewebe in 500 ul Puffer C, der Protease-Inhibitoren unter Verwendung eines Gewebe-Homogenisators bis das Gewebe vollständig unterbrochen und eine homogene Suspension erhalten wird.
    HINWEIS: In Deoxyribonuclease I (Endkonzentration: 200 & mgr; g / ml, entsprechend den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert) und Ribonuklease A (Endkonzentration: 20 ug / ml, entsprechend den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert) anBuffer N.
  2. Sequentiellen Extraktion von intrazellulären löslichen Proteinen
    1. Die Extraktion der cytosolischen Proteine. Inkubieren des Homogenats auf einem Schwenker 20 min bei 4 ° C. Speichern Sie ein kleines Aliquot (10 ul bis 20 ul) des Homogenisats für die anschließende Western Blot-Analyse (siehe Abschnitt Erwartete Ergebnisse und Abbildung 2).
    2. Zentrifugieren des Homogenats bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Röhrchen, wird dies die cytosolische (C) Bruchteil der Western Blot-Analyse darstellen. Blitzeis diese Fraktion und bei -80 ° C.
    3. Zum Waschen, das Pellet in 400 ul Puffer B, enthaltend Proteaseinhibitoren und inkubieren der Probe auf einem Schwenker 20 min bei 4 ° C. Zentrifugieren des Homogenats bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen.
    4. Zu extrahieren, Kernproteinen, das Pellet in 150 ul Puffer N Proteaseinhibitoren enthielt, deoxyribonuclease I und Ribonuclease A und Inkubieren der Probe auf einem Schwenker 30 min bei 4 ° C.
    5. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 × g für 30 min bei 4 ° C und sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal: nach dem Zentrifugieren der Probe zum zweiten Mal, fügen Sie den Überstand zur vorherigen Überstand: dies wird die Kern (N) Bruchteil der Western Blot-Analyse dar. Blitzeis diese Fraktion und bei -80 ° C. Führen Sie dann die Waschlösungen gemäß Schritt 1.2.3.
    6. Membranproteine ​​zu extrahieren, das Pellet in 100 ul Puffer M enthaltend Proteaseinhibitoren und inkubieren der Probe auf einem Schwenker 30 min bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 × g für 30 min bei 4 ° C
    7. Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Röhrchen: dies wird die Membran (M) Bruchteil der Western Blot-Analyse dar. Blitzeis diese Fraktion und bei -80 ° C.
    8. Zu Cytoskelettproteine ​​extrahieren das Pellet in 200 ul Puffer CS Proteaseinhibitoren enthielt und inkubieren der Probe auf einem Schwenker 30 min bei RT.
      Man beachte, dass das Pellet nicht vollständig lösen. Wir schlagen vor, Störung der Pellet durch Auf- und Abpipettieren, bis die Beobachtung Störung des Pellets.
    9. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 × g für 30 min bei RT. Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Röhrchen. Beachten Sie an dieser Stelle eine weitere deutliche Verringerung der Größe des Pellets (siehe Video).
    10. Das Pellet in 150 ul Puffer C, der Proteaseinhibitoren und inkubieren der Probe auf einem Schwenker 20 min bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C.
    11. Sammeln des Überstandes, und es zum vorherigen Überstand hinzu: dies wird die Zytoskelett (CS) Bruchteil der Western Blot-Analyse darstellen. Blitzeis diese Fraktion und bei -80 ° C.
    12. Führen Sie zusätzliche Wäschen. Das Pellet in 500 ul PBS, enthaltend Protease-Inhibitoren einnd inkubieren der Probe auf einem Schwenker 5 min bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
      Hinweis: alle Spuren von Detergentien müssen durch extensive Waschungen vor der Spaltung der Proteine ​​in Peptide (siehe Abschnitt 3) entfernt werden. An diesem Punkt kann das ECM angereicherte Pellet schockgefroren und bei -80 ° C gehalten. Man beachte, dass die Größe des Pellets wird auf die Menge des unlöslichen (ECM) Proteinen im Ausgangsmaterial und den Wirkungsgrad der Dezellularisierung abhängen.

2. die Überwachung der Qualität des Dezellularisierung / ECM Enrichment durch SDS-PAGE und Western Blot

  1. Mischen Sie 10-20 ul-Aliquot der gesamten Gewebeextrakt und 50 ul Aliquots von Zwischenfraktionen mit Laemmli-Puffer, der 100 mM DTT. Resuspendieren ECM-angereicherten, unlösliche Fraktion in 3x Laemmli-Puffer, der 100 mM DTT.
    Hinweis: er erhöhte Konzentrationenvon DTT und SDS unterstützen Solubilisierung von ECM-Proteinen, die relativ unlöslich sind.
  2. Trennen der Proteine ​​durch SDS-PAGE und auf Nitrocellulosemembranen transferiert.
  3. Führen immun-Blots unter Verwendung von Antikörpern gegen Proteine ​​repräsentativ für jede der cytosolischen, nuklear, Membran, Zytoskelett und ECM-Fraktionen zu überwachen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Tabelle 2 und Abbildung 2).

3. In-Lösung Verdauung der Proteine, um Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

HINWEIS: Die nach der Dezellularisierung Verfahren und Entfernung von SDS erhaltene Pellet wird stark angereicherte unlöslich ECM Proteine ​​für die weitere Analyse durch Massenspektrometrie Diese Proteine ​​müssen in Peptide verdaut werden. Man beachte, dass als Folge der ECM Proteinunlöslichkeit, ist es nicht möglich, bei diesem Schritt um die Proteinkonzentration der Probe zu messen. Wir bieten damit Volumina von Reagenzien, um die ECM-enri verdauenCHED Proben in Peptide basierend auf der Größe (mm) oder Trockengewicht des ECM-angereicherte Pellet (Tabelle 3). Die Lösungen aus Ammoniumbicarbonat, Harnstoff, DTT, Iodacetamid und Trifluoressigsäure alle müssen frisch hergestellt werden.

  1. Resuspendieren ECM-angereicherten Probe durch Hinzufügen der erforderlichen Menge von 8 M Harnstoff in dem ECM-angereicherte Pellet und fügen DTT in einer Endkonzentration von 10 mM (siehe Tabelle 3). Inkubiere unter ständigem Rühren bei 1.400 Upm für 2 h bei 37 ° C.
    HINWEIS: An diesem Punkt der ECM-Proteine ​​nicht vollständig gelöst werden, und die sichtbare große Proteinpartikel nicht durch Zentrifugation oder Filtration verworfen. Die Suspension wird nach Deglykosylierung und Verdauung (siehe Video) zu löschen.
  2. Alkylierung
    1. Bereiten Sie die Lösung Iodacetamid in HPLC-Qualität Wasser. Kühlen Sie die Probe auf Raumtemperatur und fügen Sie die Iodacetamid zu einer Endkonzentration von 25 mM. Für eine vollständige Alkylierung, die DTT: sollte iodoacetamide Verhältnis zwischen 1: 2.5 und 1: 3.
    2. Inkubieren im Dunkeln für 30 min bei RT.
  3. Deglycosylation:
    Anmerkung: Deglykosylierung wird benötigt, um Kohlenhydrat-Seitenketten, die mit der Identifizierung von Peptiden, die von N modifiziert stören -verknüpften Glycosylierungsstellen entfernen.
    1. Zu verdünnen, um 2 M Harnstoff mit 100 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8,0, und fügen Sie die entsprechende Menge an PNGaseF (siehe Tabelle 3). Inkubiere unter ständigem Rühren bei 1.400 Upm für 2 h bei 37 ° C.
  4. Verdauung
    1. Hinzuzufügen Lys-C und Inkubation unter ständigem Rühren bei 1.400 Upm für 2 h bei 37 ° C. Fügen Sie die Trypsin und Inkubation unter ständigem Rühren bei 1.400 rpm O / N bei 37 ° C.
      HINWEIS: das ECM-reiche Suspension, die trüb beim erstmaligen Rekonstitution in 8 M Harnstoff begann klar erscheint nach O / N Verdauung (siehe Video).
    2. Hinzufügen eines zweiten Aliquots von Trypsin zur Probe und Inkubation unter ständigem Rühren bei 1.400 Upm für weitere 2 Stunden bei 37 ° C.
  5. Versauerung
    1. Nach Abschluss der Verdauung, das Trypsin zu inaktivieren durch Ansäuern der Probe mit frisch hergestellten 50% Trifluoressigsäure (TFA). Die Probe sollte pH <2 erreichen Wir schlagen die Zugabe von 1-1,5 ul 50% TFA zu einer Zeit und unter Verwendung von 1 & mgr; l der Peptidlösung, um den pH-Wert der Lösung mit pH-Papier (siehe Video) zu messen.
    2. Zentrifugieren Sie die angesäuerten Probe bei 16.000 xg für 5 min bei RT. Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Low-Retention-Röhre. An diesem Punkt kann das Peptid-Lösung bei -20 ° C gelagert werden.
  6. Entsalzung
    Beachte, daß dieser letzte Schritt wird üblicherweise bei einer Massenspektrometrie Einrichtung nach seinem eigenen bevorzugten Verfahren durchgeführt.
    1. Vor der Proteomanalyse, die Proben entsalzen und Peptide mit frisch zubereiteten 60% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure, gefolgt von Konzentration in einem Vakuumkonzentrator eluiert. Resuspendieren der Peptide in frisch zubereiteten 3% acetonitrIle, 0,1% Trifluoressigsäure 8.
      HINWEIS: dass nach dem Entsalzen wurde die Konzentration der Peptidlösung kann spektralphotometrisch gemessen werden (siehe Erwartete Ergebnisse Abschnitt).
    2. Jetzt analysieren die Probe durch Massenspektrometrie, wieder nach den optimalen Verfahren der Massenspektrometrie Möglichkeiten.
      HINWEIS: Wir empfehlen die Forscher interessiert Charakterisierung der Zusammensetzung der ECM unter Verwendung von Massenspektrometrie, um unsere anderen Publikationen 8 beziehen - 10 und Website, die weitere detaillierte Erklärung, einschließlich LC-MS / MS-Parameter, Massenspektrometrie Daten Suche nach Proteinidentifikation und Datenanalyse bieten unter Verwendung der in silico matrisome Annotationstool wir entwickelt 8.

Ergebnisse

Qualitätskontrolle der Verfahren Dezellularisierung

Die Effizienz der Dezellularisierung kann durch Analyse der Proteingehalt jeder Fraktion durch Western-Blot überwacht werden. In Tabelle 2 sind Proteine ​​der diagnostische Wert, um die Qualität der Dezellularisierung Verfahren zu bewerten. 2A zeigt die effiziente Gewinnung der Zwischenfraktionen von zytosolischen (GAPDH ), Kern (Histone), Membran (β1 Integrin) und Zytoskelett (Actin) -Proteine, während keine ECM-Proteine ​​(Kollagen I) wird in diesen Fraktionen nachgewiesen (Abbildung 2). Im Gegenzug wird das endgültige Pellet zur ECM Proteine ​​angereichert und weitgehend von intrazellulären Proteinen (Abbildung 2A). 2B zeigt zufriedenstellende intrazellulären Proteinabbau (kein Histon im ECM-reiche Fraktion nachgewiesen), obwohl, Actin noch erfasst werden abgereicherte das ECM-reiche Fraktion und die Erschöpfung der monomeren Kollagen I- Scheinbaren Molekulargewicht ~ 110 kDa, mutmaßlich um nicht zusammengebauten Kollagen I entspricht - kann in der CS-Fraktion zu beachten.

Wir routinemßig zusätzlichen ECM-Proteine ​​wie Fibronectin und Laminin überwachen, obwohl in einigen Geweben können diese Komponenten teilweise in früheren Fraktionen 8-10 solubilisiert werden. Beispielsweise tritt Fibronectin als lösliche Plasmafibronektin, die nicht in der ECM enthalten ist. Durchblutung des Gewebes vor der Extraktion reduziert Plasma-Fibronektin-Konzentration, aber nicht immer beseitigen. In einigen Geweben, Laminine gefunden lose mit der Zelloberfläche oder der ECM und Extrakt in Zwischenfraktionen assoziiert. In diesem Fall kann es durch Änderung Extraktionsbedingungen (siehe Diskussion) angesprochen werden.

Man beachte, dass die Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen und die gleichzeitige Entleerung der intrazellulären Komponenten basiert auf der relativen Löslichkeit von Proteinen in den verschiedenen Puffern basiert. Thist, unterscheidet sich bei den verschiedenen Geweben - in einigen Fällen die Histone und Aktin werden leichter extrahiert als in anderen. Beachten Sie auch, dass, obwohl Histone voraussichtlich im N-Fraktion (2B) extrahiert werden, beobachten wir oft eine vollständige Verarmung von Histonen in der M oder CS Fraktion (2A und B).

Richtpeptidkonzentration erwartet

Die Konzentration der nach Aufschluss, die Säuerung und Entsalzung erhaltene Peptidlösung kann entweder spektrophotometrisch durch Messung der Absorption der Peptidlösung unter Verwendung der 280 nm Wellenlänge, die Tryptophan, Tyrosin oder mit der 205 nm Wellenlänge, die Absorption des Peptids zu messen Anleihen.

Wir maßen die Konzentration der von der Dezellularisierung von drei murine Lungen Proben erhaltenen Peptidlösungen (82 mg, 100 mg und 100 mg, jeweils) prepared parallel und voneinander erhalten: 424 ng / ul, 450 ng / ul, und 580 ng / & mgr; l von Peptiden sind.

Identifizierung von ECM Peptide durch Massenspektrometrie

Massenspektrometrische Analyse der Zusammensetzung des ECM-angereicherten Proteinproben, hergestellt wie hier beschrieben, zeigte, daß> 70% der Signalintensität entspricht ECM und ECM-assoziierten Proteine ​​8-10.

Tabelle 1 Volumen der Reagenzien aus Compartmental Extraction Kit, um 100 mg (Nassgewicht) von Gewebe oder Tumor Dezellularisieren. In dieser Tabelle sind die Zusammensetzung und die Lautstärke der einzelnen Puffer verwendet, um die Dezellularisierung von 100 mg Gewebe oder Tumor zu führen. Ein Cocktail von Protease-Inhibitoren als 50x-Lösung zur Verfügung gestellt und müssen für jeden einzelnen Puffer 2 hinzugefügt.

Reagenzien von Compartment Protein Extraction Kit Volume 100 mg Gewebe Zusammensetzung (bezogen auf Millipore Datenblatt cat # 2145 1)
Puffer C 500 & mgr; HEPES (pH 7,9 3), MgCl 2, KCl, EDT 4, Sucrose, Glycerol, Natriumorthovanadat 5
Buffer W 400 & mgr; HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, Sucrose, Glycerol, Natriumorthovanadat
Puffer N 150 ul x 2 HEPES (pH 7,9), MgCl 2, NaCl, EDTA, Glycerin, Natriumorthovanadat
Buffer W 400 & mgr; HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, Sucrose, Glycerol, Natriumorthovanadat
Buffer M 100 & mgr; HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, Sucrose, Glycerol, Natriumdesoxycholat (DOC) 6, NP-40 6 , Natriumorthovanadat
Buffer CS 200 & mgr; PIPES (pH 6,8), MgCl 2, NaCl, EDTA, Sucrose, Natriumdodecylsulfat (SDS) 7, Natriumorthovanadat
Puffer C 150 & mgr; HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, Sucrose, Glycerol, Natriumorthovanadat
1x PBS 500 & mgr; l / Waschgang -

Hinweise:
1 Für proprietäre Gründen konnten wir nicht die genaue Zusammensetzung der Puffer von dem Lieferanten, der das Kit zu erhalten, aber wir sind hier ein paar Notizen auf der Grundlage unserer eigenen Erfahrungen mit hausgemachten Puffer ähnliche Extraktionen durchzuführen.
2 Protease-Inhibitor: es ist ratsam, eine Vielzahl von Inhibitoren gegen Cystein, Serin und Threonin Peptidasen Serinesterasen, divalente kationenabhängige Metalloproteinasen usw. umfassenViele im Handel erhältliche Protease-Inhibitor-Cocktails existieren.
3 pH-Wert über 7,0 ist ein wirksamer Inhibitor der lysosomalen Proteasen.
4 EDTA (üblicherweise bei 2 mm verwendet wird) ist ein wirksamer Inhibitor von zweiwertigen Kationen abhängigen Proteasen.
5 Natriumorthovanadat ist eine Phosphatase-Inhibitor. Eine typische wirksame Konzentration würde 0,5-5 mm betragen.
6 NP40 bei 0,1% -0,5% ist ausreichend, um die meisten Membranlipiden solubilisieren. Die Kombination von NP40 und DOC - oft als strengere Extraktion noch lässt viele Protein-Protein-Wechselwirkungen intakt verwendet - oft bei gleichen Konzentrationen (beispielsweise 0,5% von jedem) verwendet.
7 ist ein SDS strengere ionisches Detergens (CMC 0,1%). Es kann auch in Kombination mit den anderen zwei Detergenzien SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% als Zwischen Stringenz-Puffer verwendet werden.

Tabelle 2. Diagnostic ProteineÜberwachung der Qualität der Dezellularisierung Verfahren. Diese Tabelle Beispiele für Proteine, die Eigenschaften jedes subzellulären Kompartiment (Cytosol, Zellkern, Plasmamembran, Zellskelett und ECM), die verwendet werden können, um die Qualität der Dezellularisierung Verfahrens und die Effizienz der Überwachung auflistet ECM-Anreicherung.

Intrazellulären Kompartiment Diagnostic Proteine
Cytosolproteine Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH)
Kernproteinen Histone, Lamine, Nukleoporin
Membranproteine Integrine, Transferrin Receptor
Zytoskelettproteine Actin, Tubulin, Vimentin
Basalmembran ECM Proteine Collagen IV, Nidogene, Laminine
Interstitial ECM-Proteine ​​(interstitielle) Kollagen I, Kollagen III, Kollagen VI, Fibronectin

Für Empfehlung auf Antikörpern siehe unsere Publikationen 8-10.

Tabelle 3. Volumen von Reagenzien an ECM-angereicherten Proben in Peptide verdauen. Diese Tabelle enthält die verwendet werden, um ECM-angereicherten Proteinproben zu suspendieren und zu reduzieren, Alkylat, deglycosylieren und zu verdauen Proteine ​​in Peptide Proben vor der Massenspektrometrie-Analyse Reagenzien.

Reagenzien Zubereitung Endkonzentration / Betrag für 1 mm dicke Pellet (~ 5-10 mg Trockengewicht) Volume 1 mm dicken Pellets (~ 5-10 mg Trockengewicht)
Ammoniumbicarbonat (NH 4 HCO 3) 100 mM Lösung in HPLC-Qualität Wasser - -
Harnstoff 8 M-Lösung in 100 mM Ammoniumbicarbonat 8 M 50 & mgr;
Dithiothreitol Rekonstitution in HPLC-Qualität Wasser bei 500 mM 10 mM 1 & mgr;
Iodacetamid Rekonstitution in HPLC-Qualität Wasser bei 500 mM 25 mM 2,5 ul
Peptid-N -Glycosidase F (PNGaseF) Kommerzielle Lösung bei 500 U / & mgr; 1.000 U 2 & mgr;
Endoproteinase LysC, Massenspektrometrie-grade Rekonstitution in HPLC-Qualität Wasser bei 0,5 ug / ul 1 & mgr; 2 & mgr;
Trypsin, Massenspektrometrie-grade (Runde 1) Kommerzielle Lösung von 0,5 ug / ul 3 & mgr; 6 ul
Trypsin, Massenspektrometrie-grade (Runde 2) Kommerzielle Lösung von 0,5 ug / ul 1,5 ug 3 ul
Trifluoressigsäure (TFA) 50% ige Lösung in HPLC-Qualität Wasser - 2-5 & mgr;
Acetonitril (Elution) 60% ige Lösung mit 0,1% TFA in HPLC-reinem Wasser - 500 & mgr;
Acetonitril (Rekonstitution) 3% ige Lösung mit 0,1% TFA in HPLC-reinem Wasser - 100 & mgr;

figure-results-1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Versuchsdurchführung. Schematic Workflow des Protocol, um Gewebe (Abschnitt 1) ​​Dezellularisieren, kontrollieren die Qualität des Dezellularisierung und bewerten die ECM-Anreicherung (Abschnitt 2) und zu verdauen ECM angereicherte Proteinproben in Peptide vor der Massenspektrometrie-Analyse (Abschnitt 3).

figure-results-2
Abbildung 2. Die Qualitätskontrolle der Dezellularisierung Verfahren durch Western Blot Western Blots wurden an Mäuselunge (A) und menschlichem Brustkarzinom Xenograft (B) Proben mit den folgenden Antikörpern durchgeführt:. Kaninchen-Anti-Aktin (Klon 14-1) und Kaninchen-Anti -β1 Integrin-Antikörper, in unserem Labor hergestellt werden; Kaninchen-Anti-Kollagen I, Maus anti-GAPDH und Kaninchen-Anti-pan-Histon-Antikörper waren von Millipore. Folgenden primären Antikörper-Inkubation wurden die Membranen gewaschen und in Gegenwart von HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen- oder Ziegen-anti-mou inkubiertse Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch Laboratory. Schließlich wurden die Membranen gewaschen und im Western-Blitz ™ Chemilumineszenzreagenz (PerkinElmer LAS) inkubiert. * Zeigt minimale Rest Histon Verunreinigung des ECM reichen Fraktion. ** Zeigt teilweisen Erschöpfung der monomeren (mutmaßlich nicht zusammengebaut) Kollagen I in der CS-Fraktion. *** Zeigt an Rest Aktin Verunreinigung des ECM reichen Fraktion. Die mit dem Anti-Kollagen-Antikörper nachgewiesen Abstrich stellt verschiedene Ebenen der post-translationale Modifikationen (zB Vernetzung Glykosylierung).

Diskussion

Änderungen

Obwohl wir verwendet genau dieses Verfahren, um das ECM aus zehn Gewebe und Tumorarten bereichern 8 - 10, Änderungen des Protokolls sollte in den folgenden Fällen in Betracht gezogen werden:

1) Nachweis der ECM-Proteine ​​in den Zwischenfraktionen.

Extrazelluläre Matrices aus unterschiedlichen Geweben oder Tumorarten können in ihrer Extrahierbarkeit / Unlöslichkeit unterscheiden, wie oben für Fibronektin und Laminin diskutiert. Beispielsweise wird angenommen, dass das ECM von fibrotischen Geweben oder Umbau Gewebe dreht sehr dynamisch und somit könnte man einen höheren Anteil an extrazellulären Matrixproteinen in diesen Geweben zu beobachten, leichter extrahierbar 12 sein. Abhängig von der Fraktion, in der ECM-Proteinen erkannt werden, schlagen wir die Verringerung der Inkubationszeit der Schritt bewirkt die Extraktion von ECM-Proteine ​​oder Weglassen diesen Schritt.

2) Detection eines erheblichen Teils der intrazellulären Komponenten der ECM angereicherte Pellet. In einigen Geweben oder Tumorarten das Verhältnis Zellen: ECM besonders hoch ist (beispielsweise Leber, Milz, nicht-desmoplastischen Tumoren). In diesem Fall kann eine signifikante Kontaminierung der ECM-angereicherten Fraktion durch intrazelluläre Proteine ​​(insbesondere Zytoskelett-Proteine ​​und / oder Histone) beobachtet werden. Um intrazelluläre Proteine ​​effizient, schlagen wir vor, sich wiederholenden doppelten Inkubation in Puffer M und / oder Puffer CS (beide haltige Reinigungsmittel, dies in der Regel verbraucht reichlich intrazelluläre Proteine) führen. Eine andere Alternative wäre, alternative Puffer mit höherer Detergenzkonzentrationen verwenden, mit dem Vorbehalt, dass dies zum Abbau von relativ löslicheren ECM Proteine ​​sowie führen (siehe nächster Absatz).

3) Alternative zur Verwendung eines kommerziellen Kits.

Wir waren nicht in der Lage, für proprietäre Gründen, die genaue Zusammensetzung der Puffer fro erhaltenm die Lieferanten, der das Protein Extraction Kit Compartmental. Allerdings haben wir in Tabelle 1 Notizen auf der Grundlage unserer eigenen Erfahrungen mit hausgemachten Puffer mit definierten Reinigungsmittel (NP-40, Natriumdesoxycholat und SDS) Konzentrationen ähnliche Extraktionen durchzuführen enthalten. Eine neuere Studie auch auf die Wichtigkeit des pH Dezellularisierung Puffer ECM Proteine ​​13 beizubehalten.

EINSCHRÄNKUNGEN DER TECHNIK

Das hier vorgestellte Verfahren beruht auf der Tatsache, daß ECM-Proteine ​​sind intrinsisch unlöslich als die meisten intrazellulären Proteinen. Jedoch ist die hier beschriebene Methode Dezellularisierung sicher extrahiert innerhalb des ECM vorliegenden löslichen Bestandteile wie einige Wachstumsfaktoren oder ECM-Umbau Enzyme. Obwohl ECM-assoziierten Proteine ​​fest an ECM Proteine ​​gebunden wurden von Proteomik in Proben, hergestellt wie beschrieben, nachgewiesen, kann dieses Verfahren zu streng sein, um vollständig das Profil der Zusammensetzung matrisome assoziiertenProteinen.

Bedeutung der Technik in Bezug auf andere Verfahren

Der Vorteil der hier gegenüber anderen Methoden vorgestellten Verfahren ist, dass es auf die Art des ECM von Interesse angepasst werden: Zwischenschritte können entfallen oder wiederholt, um den Verlust von ECM-Proteinen verhindern oder steigern die Depletion von kontaminierenden intrazelluläre Proteine ​​sind. Auch dieses Verfahren verwendet nur minimale Mengen an Waschmittel, die ausgespült werden, um ihre Interferenz mit anschließender Peptidzubereitung und Massenspektrometrie zu verhindern. Schließlich hat die hier beschriebenen ECM-reiche Proteinzubereitungen in Peptide verdaut Verfahren auch den Vorteil, nicht erforderlich Proteine ​​löslich zu sein und kann auf "rohes" ECM-angereicherten Fraktionen durchgeführt werden.

Alternative Verfahren, die Dezellularisierung Chaotropen (wie Guanidin-Hydrochlorid) um die Zusammensetzung der ECMs durch Massenspektrometrie studieren been in der Literatur beschrieben (in 14 überprüft), und wurden in Kombination mit der Massenspektrometrie verwendet, um die ECM-Zusammensetzung Knorpel 15,16, Herz 17, Brustdrüse 18 und Gefäß 19 und 20 glomerulären Basalmembranen charakterisieren.

Empfehlungen

Dezellularisierung Verfahren, die Trypsin zu verdauen aus Zellen sollten nicht verwendet werden, wenn ECM für nachfolgende Proteomik angereichert analysiert werden, wie Trypsinierung wird in Teil ECM Verdauung und Verlust von ECM Proteinen und Peptiden führen. Und falls Kollagenaseverdau sollten verwendet werden, um Gewebe-Zerstörung zu unterstützen, müsste sorgfältig überwacht werden, da es ECM Verdauung und Verlust von ECM-Proteinen und Peptiden verursacht.

In-Lösung gegen In-Gel-Verdauung? ECM-Proteine ​​sind vernetzt und stark unlöslich, und selbst wenn in 3x Laemmli-Puffer (enthaltend 6% SDS) und 100 mM DTT, separate poorly auf SDS-Gelen. Somit im Gel Verdauung ist kein bevorzugtes Verfahren.

Zukünftige Anwendungen

Es ist erwähnenswert, dass, obwohl hier nicht diskutiert, die Zusammensetzung von jedem der Zwischenfraktionen bei der Dezellularisierung gesammelt könnte auch durch Massenspektrometrie analysiert werden. Dies kann besonders nützlich sein, wenn das Studium sehr kleine Proben (dh menschlicher Biopsien) oder, wenn Informationen auf anderen Zellfraktionen gewünscht.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Amanda Del Rosario und Dr. Guillaume Carmona für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des DOD Innovator Award des Verteidigungsministeriums (W81XWH-14-1-0240 an ROH) unterstützt; das National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); das Broad Institute des MIT und Harvard; das Howard Hughes Medical Institute, dessen Prüfarzt ROH ist; und teilweise durch den Support Grant des National Cancer Institute an das Koch Institute for Integrative Cancer Research am MIT (P30-CA14051). AN erhielt Postdoc-Stipendien vom Howard Hughes Medical Institute und dem Ludwig Center for Cancer Research am MIT.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Gewebehomogenisator: Bullet Blender + KügelchenNext AdvanceBB24-AU
Kompartiment-ExtraktionskitMillipore2145
Desoxyribonuklease ISigma-AldrichDN25
Ribonuclease AQiagen19101
Wasser in HPLC-QualitätSigma-Aldrich34877
HarnstoffSigma-AldrichU4883
Dithiotreitol (DTT)Thermo Scientific<a href="http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt">20291
Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3)Sigma-Aldrich9830
IodacetamidSigma-AldrichA3221
Peptid-N-Glycosidase F (PNGaseF)New England BiolabsP0704S
Endoproteinase LysC, massenspektrometrische Qualität Wako125-05061
Trypsin, massenspektrometrische Qualität PromegaV5111
TrifluoressigsäureSigma-AldrichT6508
Acetonitril, massenspektrometrische Qualität Thermo Scientific51101
Entsalzungssäulen: Oasis HLB 1  cc, 10 mg Sorptionsmittel pro KartuscheWasser186000383

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Anreicherung der extrazellul ren MatrixGewebedezellularisierungECM ProteinisolationProtokoll zum PeptidverdauWestern Blot ValidierungHarnstoff DenaturierungTrypsinverdauKollagenanreicherungEntfernung der zytosolischen Fraktion
Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse
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