Summary
Stresstålighet är ett av kännetecknen för livslängd och är känd för att vara genetiskt styrda. Här har vi tagit fram en opartisk hög genomströmning metod för att screena för mutationer som ger stresstålighet i ES-celler med för att utveckla musmodeller för livslängd studier.
Introduction
Livslängd har en intim relation med stresstålighet. I allmänhet, ofta långlivade arter uppvisar ökad resistens mot flera stressfaktorer, såsom väteperoxid, parakvat (PQ), UV, värme, och tungmetaller 1,2. I motsats, ökad känslighet för stress tenderar att förutsäga livslängd förkortas och / eller en mer sjukdom som ofta drabbas fenotyp. Den antioxidant elimineringsvägen har länge spekulerats spela en viktig roll i överföra stressresistens till djuret. Men med några få undantag, studier från olika transgena djur med manipulationer i olika antioxidant enzymer (t.ex. SOD) tyder på att höja nivån på oxiderande eliminerings enzymer inte ökar livslängden eller hälsa span 3. Dessa data tyder på att stresstålighet drag konsekvent observerats i långlivade djur förmedlas av andra cellulära vägar ännu inte avslöjats.
Vi tog en opartisk framåtgenetiska tillvägagångssätt för att identifiera gener, som vid muterade, kunde ger en stresstålighet fenotyp i odlade embryonala stamceller (ES-celler). ES-celler har två stora fördelar i denna studie: (1) avancerade genetiska manipulationer finns tillgängliga för att modifiera genomet hos ES-celler; och (2) kan någon stress resistenta ES-celler som återvunnits från skärmen direkt användas för framställning mus, tillåter snabb översättning till hela djurstudier för att mäta livslängden och hälsa spännvidd.
I denna rapport beskrivs vi användning av C9 ES-cellinje, i vilken de BLM alleler var under kontroll av en tetracyklin responsivt element. Behandling av doxycyklin (DOX) gående avstängd uttrycket av Blm leder till ökad incident av systerkromatidutbyte. Denna kortsiktiga Blm knock-out tillåtet för generering av homozygota mutationer inom heterozygot befolkningen så att recessiva mutationer för stresstålighet kunde fångas i urvalsförfarandet. Viockså beskrivit användningen av piggyBac (PB) transposonet som mutagener till slumpmässigt sätt i ett poly-A-fälla kassett (PB-UPA) att mutera gener i genomet. Celler med avbrott av en gen av poly-A-fällan blev G418 resistenta och kunde återvinnas, så att en samling av gen-trap mutanter (gen-fälla bibliotek) skulle kunna göras, och därefter screenas för mutanta kloner som var stresstålig.
Stress resistenta kloner återhämtat sig från valet skulle kunna karakteriseras tämligen snabbt av molekylära tekniker när det gäller antalet insättningar (qPCR), platsen för insättnings (splinkerette PCR), identiteten hos den störs-genen (BLAST), och dess uttrycksnivån ( RT-qPCR). PB insättning kunde remobilized genom transient expression av MPB transposas i klonen för att återställa den av vildtyp-DNA-sekvensen och sålunda testa för förlusten av stressresistens. Dessa är kraftfulla sätt att bekräfta kausalitet mutationen, som bör göras företill dyra produktions mus. Tidigare studier visade att celler som utsätts för stressfaktorer förlorat sin pluripotens 4,5. Således, i detta protokoll, är bevarandet av en kopia uppsättning muterade celler, som inte skulle behandlas med stress avgörande för framgångsrik produktion mus.
Vårt laboratorium har konstruerat C9 ES-cell linje och PB-UPA vektor, båda är tillgängliga för andra forskare på begäran. Protokollet redovisas här kommer att börja med generering av de novo bibliotek av gen-fångade ES-celler med PB-UPA (Figur 1A), följt av replica plating och urval stress isolera spännings resistenta kloner (Figur 1B). Vi visade valet med parakvat, en potent friradikalbildare inuti celler. Praktiskt taget varje cytotoxisk förening eller toxin, till exempel, ER stressfaktorer (t.ex., tapsigargin och Tunikamycin), neuronal oxidationsmedel (t.ex., MPP +, 6-hydroxi dopamin och rotenon), värme, och tungametaller (t ex Cd, Se), skulle kunna anpassas till den metod för att välja för respektive resistenta mutanter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gene-fångade ES Cell Library Construction Använda piggyBac Transposon
- Förbered primära mus embryonala fibroblaster (PMEF) som matare ES cellodling
- Tina en flaska med mitomycin C-inaktiv PMEF (5,0 x 10 6) i en 37 ° C vattenbad. Överföra celler i 5 ml av ES-cellmedium (DMEM innehållande 15% FBS, 1000 enheter / ml av leukemiinhiberande faktorer, 100 | iM icke-essentiella aminosyror, 2 mM glutamin, 55 ^ M 2-merkaptoetanol, och 25 enheter / ml penicillin / streptomycin ), och centrifugera vid 100 xg under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 30 ml ES-cellmedium följt av distribution i två T25-kolvar (5 ml vardera) och två 100-mm plattor (10 ml vardera). Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 24 timmar.
- Kultur och expandera C9 ES-celler
- Tina en flaska med C9 ES-celler (2,5 x 10 6 celler i 0,5 ml) i en 37 ° C vattenbad och överföraceller i 5 ml ES-celler medium. Centrifugera vid 100 xg under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera-ES-celler i 5 ml ES-cellmedium, följt av utstrykning in i T25 matarkolven. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2. Ersätt ES-celler mediet dagligen.
- Efter 2 dagars odling bör ES-cellerna blir ~ 80% konfluenta, och är redo att passe. Tvätta cellerna med 5 ml PBS (utan Ca2 + och Mg2 +) och tillsätt sedan 2,5 ml förvärmd 0,25% trypsin-EDTA. Inkubera vid 37 ° C under 10 minuter. Tillsätt 2,5 ml ES cellmedium för att stoppa trypsin; pipettera upp och ner 15 gånger för att bryta upp cellklumpar. Centrifugera vid 100 xg under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 4 ml ES-cellmedium. Transfer 1 ml celler per 100 mm platta innehållande 9 ml ES-celler medium; förbereda två 100-mm plattor. Detta är en 1: 8 passagen. Mata cellerna dagligen med 10 ml ES-cellmedium.
- Förbered 96 brunnar matarplattor för biblioteket
- Som beskrivits i 1.1.1, tina tre flaskor med mitomycin-C inaktiv PMEF (var och en innehållande 5 x 10 6 celler) och återsuspendera cellerna från varje flaska med 33,3 ml ES-celler medium. Kombinera celler för att ge en 100-ml cellsuspension.
- Plansch 100 pl celler per brunn på tio 96-brunnars plattor. Dessa 96 brunnar matarplattor bör beredas minst en dag innan transfektion C9 ES-celler med PB transposon.
- Elektroporering av C9 ES-celler med PB-UPA vektor
- Trypsinize och räkna de expanderade C9 ES-celler med hjälp av en automatiserad cellräknare. Tvätta varje 100-mm platta C9 ES-celler med 10 ml PBS. Tillsätt 8 ml förvärmda 0,25% trypsin-EDTA och inkubera vid 37 ° C under 10 minuter.
- Stoppa trypsin genom att tillsätta 2 ml ES-celler medium. Överför cellsuspensionen till en 15-ml rör och pipett upp och ned 15 gånger för att bryta sönder cellklumpar. Centrifugera omedelbart vid 100 xg under 5 minuter följt av aspirera supernatanten.
- Resuspendera cellsi 10 ml ES-cellmedium och räkna ES-celler med användning av en hemocytometer. Förbered sex 15 ml rör med cellsuspensionen vardera innehållande 5 x 10 6 ES-celler. Centrifugera vid 100 xg under 5 minuter. Aspirera supernatanten och återsuspendera varje cellpelleten i 0,8 ml PBS.
- Förbered sex elektroporering kyvetter (4 mm gap) till vilken 0,8 ml cellerna överförs. Till varje kyvett, tillsätt 1 pg PB-UPA och 20 mikrogram MPB transposas (mPBase); blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned. Sätt kuvetterna på is. Utför elektroporering med en elektroporator använder den exponentiella inställningen på 250 V, 500 iF, och oändligheten ohm.
OBS: Typiskt är tidskonstanten cirka 10 till 12 msek för en framgångsrik elektroporation, vilka ger ca 1500 till 2000 G418-resistenta transformanter per 5 x 10 6 celler. - Hämta och pool de transfekterade cellerna till en T75 kolv innehållande 98 ml ES-celler medium. Blanda cellerna genom försiktig pipettering och sedan överföra cellerna till en reservoar (50 ml). Ossing en 12-kanals pipett 100 ul av celler per brunn till den tidigare beredda 96 brunnar matarplattorna (10 totalt). Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2.
- Efter 24 timmar, mata cellerna dagligen med färska ES-cell medium innehållande G418 (150 mikrogram / ml) för att selektera för gen-fångade kloner.
OBS: Typiskt varje brunn innehåller omkring tio G418 resistenta kolonier. När dessa kolonier växa till tillräcklig storlek (typiskt 5-7 dagar), kommer de 96-brunnsplattor (biblioteket) replikeras i 2 uppsättningar för lagring och urval, respektive. Varje platta i biblioteket betecknas som "underbibliotek", så i detta fall, finns det 10 underbibliotek.
2. Bibliotek replikering
- Replikera Master plattorna
- 24-48 timmar före G418 resistenta kolonier nå 50-60% konfluens, tina ytterligare tre flaskor med mitomycin C-inaktiv PMEF på tio plattor med 96 brunnar som matare (se avsnitt 1.3). Gelatinize tio 96-brunnars plattor genom att inkubera 0,1% gelatin (100 | j, l / brunn) vid 37 ° C under minst femton - 30 minuter; O / N inkubationen är acceptabelt.
- Förbered enkelcellsuspensioner i 96-brunnars plattor genom trypsinisering. Aspirera medium från 96-brunnars plattor och tvätta en gång med lika stor volym av PBS (utan Ca2 +, Mg2 +). Tillsätt 50 pl av förvärmda 0,25% trypsin-EDTA, inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 under 10 minuter. Sluta trypsin med 50 pl ES-celler medium. Bryta isär de cellklumpar genom att pipettera upp och ned 15 gånger med multikanalpipett.
- Överför 50 ul av trypsinerades cellsuspensionen till motsvarande rad av matarplattan (Master) som redan innehöll 150 | il ES-cell-medium och de återstående 50 ^ till motsvarande rad i den gelatinerade plattan (replik) som redan innehöll 150 | il ES-cellmedium. Behandla varje rad av celler till en Master och replik plattan. Inkubera plattorna (som nu innehåller en 200 ^ culture volym) vid 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
OBS: Det finns nu tjugo 96-brunnsplattor. - Nästa dag mata cellerna med 100 pl färskt ES-cell-medium innehållande 150 pg / ml G418. Ersätt mediet dagligen tills brunnarna är 80-90% sammanflytande.
- Frys Master plattorna
- När masterplattorna är ca 80% sammanflytande, trypsinize cellerna såsom beskrivits (se avsnitt 2.1.2).
- Ta bort plattorna och stoppa trypsin reaktion med 50 pl 2x frysning medium (60% ES-celler medium, 20% FBS, 20% DMSO). Pipettera upp och ner 10 gånger med en flerkanalspipett för att säkerställa korrekt blandning av frysmedium.
- Sätt de 96-brunnars plattor i en tätt försluten styrofoam låda och placera den i -80 ° C frys under upp till fyra månaders lagring. Fyra månader kommer att tillåta tillräckligt med tid för att avsluta valet stress och för att identifiera vilka brunnar från Master plattan innehåller klonerna av intresse.
OBS: Lagring vid -80 & #176; C längre än 4 månader resulterar i minskningen av cellernas livskraft. Man kan utnyttja kryo-rör i 96-brunnsformat som kan lagras i ångfasen av flytande kväve under längre förvaring.
- Förbered DNA plattor och sub-bibliotekspooler från replika plattor
- 24-48 h före replikera ytterligare DNA plattor och sub-biblioteket pooler, förbereda tio 100 mm plattor med mitomycin C-inaktive PMEF för underbiblioteket pool, och tio gelatin 96 brunnar för DNA plattan replikerar. Se avsnitt 1.3 för allmänna förfarandet.
- Trypsinize cellerna i 96-brunn replika plattor (se avsnitt 2.1.2). Under 10 minuter trypsinering steget, aspirera gelatin från DNA-plattorna och ersätta med 150 | il ES-cell-medium innehållande G418 (150 | ig / ml). Också förbereda en behållare innehållande 5 ml av ES-celler mediet för en sammanslagning av de "underbibliotek" i 100-mm matarplattan.
- Efter trypsinisering, sluta försökaPSIN med 50 pl ES-cellmedium en rad åt gången med användning av en 12-kanals pipett. Pipettera upp och ned 10 gånger för att bryta sönder cellklumpar.
- Överför 50 ul av cellsuspensionen till motsvarande rad i den DNA-plattan och överföra de återstående 50 ^ till reservoaren innehållande 5 ml ES-cellmedium. Efter att ha avslutat en full 96-brunnar, aspirera mediet av en 100-mm matarplattan till vilken de sammanslagna cellerna överförs. Dessa poolade muterade celler betecknas som en "sub-biblioteket".
- Upprepa för de återstående nio 96-brunnsplattor. Mata 96 brunnar DNA plattor och 100-mm poolade "sub-bibliotek skyltar dagligen med ES-celler medium innehållande G418 (150 mikrogram / ml).
OBS: Det finns nu tio 96-brunn "DNA" plattor, och tio 100-mm "sub-bibliotek skyltar.
- Frysa DNA plattorna. När cellerna i DNA plattan är 80-90% sammanflytande, aspirera mediet, tvätta cellerna två gånger med 100pl PBS och lagra vid -20 ° C för senare genomiskt DNA-isolering 6. Dessa DNA-plattorna screenas med PCR för att identifiera vilka som motsvarar väl i "Mästaren" platta innehåller klonen av intresse.
3. doxycyklin-inducerad Homozygota mutanter
- Frysa under bibliotek pooler och passage celler för doxycyklin behandling
- 24 timmar före 100-mm "sub-biblioteket" plattor med kolonier som är tillräckligt stora för att ge 70-80% konfluens, förbereda en uppsättning av tio gelatin 100 mm plattor för doxycyklin behandling.
- Förbered enkelcellsuspensioner för varje underbibliotek (se avsnitt 1.4.1 och 1.4.2 för mer information). Överför 5 x 10 6 celler till den gelatiniserade 100-mm platta med doxycyklin (1 | ig / ml); inkubera vid 37 ° C, 5% CO2. Frys återstående icke-doxycyklin behandlade sub-biblioteks poolerna på 5 x 10 6 celler per flaska.
- Passage celler i närvaroav doxycyklin att slå ut Blm
- Passage de underbibliotek på 1: 8 var 2-3 dagar i närvaro av doxycyklin (1 | ig / ml) i upp till två veckor, under vilken tid dox-inducerad knock-out av Blm kommer att främja förlust av heterozygositet i cellen populationen, vilket möjliggör generering av homozygota mutanter.
4. Stress Val och isolering av resistenta kloner
- Ämnes doxycyklin-behandlade cellerna för urval påkänning
- 24 h före passage doxycyklin behandlade celler för val stress, förbereda tio gelatin 150 mm plattor, plats i en 37 ° C, 5% CO2 fuktad inkubator.
- Förbered en enda cell suspension av varje under bibliotek genom trypsinisering (se avsnitt 1.4.1 och 1.4.2 för mer information). Seed 6,6 x 10 6 celler på varje 150-mm platta i 30 ml total odlingsvolymen, distribuera celler jämnt. Inkubera cellerna med stress (10 iM parakvat eller utelämnande av β-merkaptoetanol,i ES-cellmedium innehållande 7,5% värmeinaktiverat FBS) under 7 dagar, varefter ersätter med normala ES-cell-medium för att låta överlevande celler att växa till kolonier för plockning.
- Valfritt: Frys till vänster över doxycyklin-behandlade cellerna vid 5,0 x 10 6 celler per flaska.
- Välj spännings resistenta kolonier
- Efter återinförande av normal media för en vecka, observera hur många påfrestning resistenta kolonier är närvarande. Beroende på antalet kolonier som ska plockas, förbereda tillräckligt brunnar med mitomycin C-inaktiv PMEF på 96 brunnar en dag i förväg i enlighet med detta (se avsnitt 1.1 för mer information).
- På dagen för plockning, aspirera och ersätta medium i 96-brunnars matarplatta med 100 | il färskt ES-cell medel, återställ i 37 ° C, 5% CO2 fuktad inkubator. Vid denna tid, förbereda en U-bottnad 96-brunnsplatta med 50 | il 0,25% trypsin-EDTA per brunn. Aspirera medium från 150-mm val spänningsplattan och lägg equal volym PBS.
- Ställ in mikropipett till 2 pl och "plocka" överlevande kolonier i U-botten trypsin innehållande brunnar, plocka en koloni per brunn. Det är acceptabelt att låta plattan sitta vid RT tills det önskade antalet kolonier har plockats. Därefter inkubera U bottenplatta vid 37 ° C, 5% CO2 under 10 minuter.
OBS: Normalt tar vi en timme att plocka 96 kolonier. - Stoppa trypsin reaktion en rad i taget med 50 ^ ES-cell medium med användning av en flerkanalspipett. Pipettera upp och ner 15 gånger för att erhålla en enkelcellsuspension och överföra 100 fil celler till motsvarande rad av matarplattan redan innehåller 100 pl ES-cellmediet. Slutföra överföringen för hela plattan. Kulturceller O / N i 200 ^. Nästa morgon, aspirera medium och ersätta med 100 ^ ES-celler medium.
- Replikera 96-brunnsplattor
- När brunnarna i plockade kolonierna är 80-90% confluent, replikera i två matchande plåtar, en för DNA-isolering och den andra för celler back-up. Dessa plattor är gelatinerad och inte innehåller mitomycin C-inaktiv PMEF.
- Aspirera medium och tvätta med 100 pl PBS. Lägg 50 pl 0,25% trypsin-EDTA till varje brunn, inkubera vid 37 ° C under 10 minuter. Stoppa trypsinet med 150 | il ES-cellmedium, blanda genom pipettering, och överför 100 pl av cellsuspensionen till motsvarande rad i två 96-brunnars plattor. Ändra mediet dagligen.
- När plattorna är 80-90% sammanflytande, frysa en uppsättning av plattor som "back-up" (se avsnitt 2.2 för mer information). Den andra uppsättningen plattor är ytterligare expanderas såsom beskrivs nedan.
- Expanderande celler för genomisk DNA-isolering
- Förbered en enda cell suspension i 96 brunnar DNA platta (se 2.1.2 för mer information).
- Överför cellsuspensionen från varje individuell brunn i 96-brunnars platta till brunnen av en 24-brunnsplatta (4 totalt) under användning av en MICRopipette. Se till att det inte finns någon korskontaminering av alla celler, som "plockade" kolonier "klonala" ursprung. Kultur celler i 0,5 ml ES-celler medium förändrade mediet dagligen tills brunnar är 80-90% sammanflytande.
OBS: 24-brunnar kommer att tillåta tillräcklig utbyte av genomiskt DNA för PCR-analys.
5. Identifiering av PB Insertion platser och fångade Genes
- Genomisk DNA-isolering från 24-brunnar: Lyse celler i 24-brunnar och isolera RNA-fri genomiskt DNA.
- Utför Splinkerette PCR (SpPCR) för att generera sekvensfragment som flankerar PB transposon integrationsstället som beskrivs 7,8.
OBS: SpPCR är en fem dagars process, även om praktisk tid varje dag är minimal.
6. Genetisk Analys av muterade kloner
- Leta herre väl och rena klon av intresse.
- När integrationsstället PB har varitavbildas, utforma en framåtriktad primer uppströms om integrationsstället för att använda med en PB omvänd primer (t.ex. PB3'-1) 8 och screena DNA-plattan som motsvarar samma "sub-bibliotek" från vilken stresstålig klon plockades. Räkna med att hitta en enda positiv väl över hela 96-väl DNA platta. Tina denna specifika väl från "Master" platta till en 24-brunnar på matare och växa celler tills 80-90% konfluens.
OBS: På denna punkt, detta väl innehåller en blandning av gen-fångade kloner. - När 24-brunnar är 80-90% konfluenta, trypsinize celler och plattan 1000 ES-celler i en 100-mm matarplatta (se enkelcellsuspension). Passage de återstående cellerna till en T25 kolven på Anläggningar för expansion. Frysa cellerna från T25 kolven när kolonier är 80-90% sammanflytande. Freeze 4 flaskor per T25-kolv som back-up.
- Låt kolonierna växa i 7 dagar och sedan plocka 96 kolonier till en 96-brunnars feeder platta. Se avsnitt 4.2 för att plocka förfarande. Replikera plattan när du är klar till en "DNA" plattan och frysa den andra som "2: a -Master" platta (se avsnitt 2.2 för frysning).
- Tillåt kolonier för att nå 80-90% konfluens. Screena DNA plattan för att hitta brunnar innehållande den renade klonen av intresse. Expand celler från 96-brunn 2 nd -Master plattan till 24-brunn och därefter till en T25-kolv (alla på matare). Freeze 4 flaskor per T25-kolv.
OBS: Vid denna punkt, den gen-fångade cellinje är klonal, har inte utsatts för stressfaktorer, och är lämplig för produktion mus.
- När integrationsstället PB har varitavbildas, utforma en framåtriktad primer uppströms om integrationsstället för att använda med en PB omvänd primer (t.ex. PB3'-1) 8 och screena DNA-plattan som motsvarar samma "sub-bibliotek" från vilken stresstålig klon plockades. Räkna med att hitta en enda positiv väl över hela 96-väl DNA platta. Tina denna specifika väl från "Master" platta till en 24-brunnar på matare och växa celler tills 80-90% konfluens.
- Bestämma antalet PB insättning: Tina en flaska av stresstålig cellinje och expandera celler i en gelatin T25 kolv. Isolera genom-DNA och kontrollera kopieantalet av PB transposonet. Detta kan uppnås genom qPCR targeting neomycingenen.
- Mät genuttryck nivå: Efter konrming det finns en enskild händelse PB integration i cellinjen av intresse, mäta nivån av uttryck av fångade genen genom RT-qPCR använda specifika TaqMan prober för varje gen.
- Sekvensera mutanta mRNA: Generera en cDNA amplikon genom PCR med användning av en uppströms primerhybridisering till en exon och en nedströms primerhybridisering till splitsningsacceptorsekvens av genen fällan kassetten. Sekvens cDNA-fragmentet för att bekräfta att den förväntade splitsning sker i den fångade genen.
- Remobilize den piggyBac transposon för att testa orsakssamband mellan den fångade genen och stresstålighet.
- 24-48 h före upptining celler för PB mobilisering, tina och platta DR4 matare på en T25 kolv och två 100-mm plattor. Minst en dag efter det att DR4 matare stryks på T25 kolven, tina en flaska av cellinje som innehåller PB införande och platta celler i T25 kolv innehållande DR4 matare. Odla cellerna i ES-cellmediumför 48 timmar, ändra mediet dagligen.
- Förbered en enkelcellsuspension av de ES-celler. Räkna celler med en automatiserad cellräknare, och överföra 5,0 x 10 6 ES-celler till en 15-ml rör. Centrifugera vid 100 x g, och återsuspendera cellerna i 800 pl PBS. Överför suspensionen till en 4 mm kyvett.
- Tillsätt 20 mikrogram mPBase Puro till kyvetten, blanda genom att pipettera, och electroporate celler (se avsnitt 1.4 för mer information). Fördela de transfekterade cellerna på två 100-mm DR4 matarplattorna. Kulturceller O / N i ES-celler medium.
- Nästa morgon, mata cellerna med ES-medium med 1 | ig / ml puromycin och kulturceller för 48 h. Uttag puromycinselektion och fortsätta att odla cellerna i 5 dagar. När kolonierna är tillräckligt stora för plockning, plocka in en 96-brunn matarplatta (se avsnitt 4.2).
- När plockade cellerna har nått 80-90% konfluens, dela 1/6: e av plattan i en DNA-platta och 1/6: e plåt i en G418 platta, lämnar 2/3 rds av cellerna i den ursprungliga plattan som skall frysas (se avsnitt 2.2 för frysning).
- Kultur DNA plattan i ES-cellmedium för senare DNA-isolering, och G418-plattan i 150 | ig / ml G418 för att testa för förlusten av neomycinresistens. Brunnar utan levande celler efter 72-96 timmar i kultur innehållande G418 indikerar framgångsrik mobilisering av genen fångande PB transposon.
- Motsvarande brunnar i 'DNA "plattan kommer att granskas av PCR för att bekräfta PB transposonen har tagits bort. När DNA-plattan är 90% konfluent, isolera det genomiska DNA i 96-brunnsplattformat 4 för PCR-screening för restaurering av den vildtypsekvensen och frånvaron av neo-IRES som ett medel för att bekräfta reversion.
- Tina de matchande brunnar från Master plattan till 24-brunnars platta och expandera till en T25-kolv (alla med matare). Freeze fyra flaskor per T25-kolv som back-up.
7. Framställning av Mus mutanter - Återskapa resistenta ES-celler från masterplattorna och använda dem för embryo injektion för att generera chimär. Omkring 15-20 ES-celler injiceras i en individ C57BL / 6 blastocyst. Transfer 15 blastocyster per mus till livmodern hos en pseudohavande (stam ICR). Mate den manliga chimär (indikeras av ES-celler specifika agouti pälsfärg) återhämtat sig från kullen med flera unga jungfru C57BL / 6J kvinnor till testet för bakterie line överföring, samt att bygga upp en koloni av muterade möss.
- Isolera och testa svans hudfibroblaster från muterade möss F1 och vildtyp kull för reaktiva syreradikaler (ROS) nivå och motståndskraft mot parakvat 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I ett typiskt mutagenes experiment, transfektion består av totalt 3 x 10 7 ES-celler med PB-UPA och mpb transposas. Antalet gen-fångade ES-celler som genereras i två oberoende experiment är sammanfattade i tabell 1. Effektiviteten av gen-infångning är ca 0,04%. De kombinerade bibliotek gen-fälla innehåller 22.400 oberoende mutanter, om en full täckning av musgenomet (23.000 kodande gener). Överdriven täckning kan uppnås genom att generera fler mutanter genom upprepad mutagenes och / eller skala upp processen.
Eftersom biblioteken gen-fällan innehåller slumpvisa mutationer, är det inte möjligt att förutsäga antalet mutanter som har en stresstålighet fenotyp. Två oberoende val för PQ motstånd utfördes; den kombinerade screeningen av 22,440 oberoende gen-trap mutationer avtäckt 17 mutationer som ger cellulär resistens mot PQ (0,08%) (tabell 1).
<p class = "jove_content"> Vi har renat 3 muterade kloner, den Pigl, Tiam1 och Rffl, från masterplattor för vidare analys och produktion mus. Celler med heterozygot Rffl mutation framgångsrikt förmås att producera homozygot avkomma genom att slå ut Blm. Emellertid missade vi producerar några homozygota mutanter från mutanterna Pigl och Tiam1, förmodligen på grund av en homozygositet bunden cell dödlighet. Stressmotståndet hos dessa renade kloner bekräftades genom användning av 2 olika typer av stressfaktorer: utelämnande av 2-merkaptoetanol (2-ME) och PQ (Figur 2). Vid avlägsnande av PB från dessa kloner, var tillhörande stresstålighet fenotyp också förlorat (Figur 2), bekräftar att gen-fällan mutationer är orsak. Karakterisering av kloner återhämtat sig från masterplattorna är avgörande eftersom det skulle utesluta stokastisk skada vid stress val som orsak till den observerade fenotypen.Av 3muterade ES-celler förs in blastocyster för datormöss produktion (tabell 2), 2 rader (Pigl och Tiam1) visar könsceller överföring. Den Rffl injektionen produceras endast en kvinnlig chimär som inte var ett optimalt antal chimär till att börja med. Således, beror sannolikt på en inkompetent chimär misslyckande könsceller överföring av Rffl. Vi testade den cellulära fenotypen av hudfibroblaster isolerade från muterade möss Pigl och visade att de vidhöll den reducerade nivån av endogena reaktiva syreradikaler (ROS) samt stress motstånd mot PQ (Figur 3).
Figur 1. ES-celler mutagenes och selektion stress. (A) PB-UPA-vektor. En opartisk polyA (UPA) fälla vektor bestående av en splitsningsacceptor (SA), bovint tillväxthormon poly-adeny signal (pA), phosphoglycerate kinas (PGK), neomycinfosfotransferas (neo), inre ribosomalt ingångsställe (IRES), och en splitsningsdonator (SD) med artificiell ATG (i 3 olika läsramar) klonades in i piggyBac transposonet, flankerad av 3 ' och 5 'långa terminala upprepningen (LTR). (B) Slumpmässig mutagenes av ES-celler och selektion med avseende på spännings resistenta kloner. ES-celler samtransfekterades genom elektroporering med PB-UPA och mPBase följt av utstrykning på 96-brunnsplattor. Gene fångade kloner selekterades genom G418-resistens; en gång sammanflytande, var de indelade i 2 replikuppsättningar. En replikuppsättning ytterligare uppdelad i två hälften för DNA-isolering och urval stress genom parakvat (PQ); den andra replikuppsättning (master) frystes ned. De överlevande ES-cellkolonier återhämtat sig från den stress behandling analyserades molekylärt för PB införande av Sp-PCR. Primers sedan utformade för att screena repliken DNA plattan från vilken brunnen innehåller sibling PQ R klon kunde vara belägen på masterplattan. Dessa celler är för stresstålighet analys på olika stress och produktions mus. Modifierad från et al. Chick 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Hållbarhet i muterade ES-celler. (A) Resistens mot 2-merkaptoetanol (2-ME) tillbakadragande. (B) Motstånd mot parakvat (PQ). Visas är föräldra vild typ ES-celler (C9: gul), en stresståliga kontroll ES-cellklon, (4C11: röd), som återvunnits från en tidigare studie 5, och tre gen-fälla kloner (grå). Celler utsattes för stress behandling under två dagar, varefter antalet livsdugliga celler räknades. < em> Pigl, Tiam1 och Rffl heterozygoter. (PB / +: mörkgrå) uppvisar resistens mot båda dessa faktorer Rffl homozygoter (PB / PB: svart) uppvisar starkare stresstålighet jämfört med heterozygoter. Resistens mot båda stress gick förlorad när PB inser togs bort (+ / +: ljusgrå). Felstaplar representerar standardavvikelse för medelvärdet (n = 4). * P <0,001, * P = 0,01 mellan gen-trap kloner och vildtyp föräldra C9, utvärderade med Students t-test. (C) ES cellkolonibildning enligt PQ (10 M) behandling. Stress-resistent ES-kloner kunde bilda kolonier i kultur under PQ behandling medan antalet och storleken av kolonier från vildtyp klon reducerades signifikant. Modifierad från et al. Chick 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Karakterisering av Pigl PB / + fibroblaster. (A) Reaktiva syrespecies (ROS) nivå. Tail hudfibroblaster isolerade från vildtyp (WT) och Pigl PB / + möss färgades med CM-DCFCA och fluorescensen normaliserades mot Hoechst. ROS halten uttrycktes som relativ fluorescens enhet (RFU). P-värdet utvärderades genom två tailed Students t-test (n = 8). (B) PQ motstånd. Tail hudfibroblaster från vild-typ (WT) och Pigl PB / + möss exponerades för 4 mM PQ under 6 timmar, varefter cellernas viabilitet mättes genom MTT-analyser. Den procentuella andelen levande celler efter PQ behandling beräknades genom förhållandet mellan absorbansen erhållen från PQ-behandlade cells och från FN-behandlade celler. P-värdet utvärderades genom en tailed Students t-test (n = 8). Modifierad från et al. Chick 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Bibliotek | Underbibliotek | ES-cellstam | Antal gen fångade klon | Antal PQ R-kloner |
| 1 | C9PA01 - C9PA10 | C9 (Blm tet / tet) | 9000 | 7 |
| 2 | C9PA11 - C9PA20 | C9 (Blm tet / tet) | 13.440 10 | |
| Total | 22.440 | 17 |
Tabell 1. piggyBac gen-trap bibliotekskonstruktion och återvinning av PQ resistenta kloner. Modifierad från Chick et al. 7.
| ES-cell-klon injicerades | Antal chimär återvinnas | Germline transmission * |
| Pigl PB / Pigl + | 4 | Ja |
| Tiam1 PB / Tiam1 + | 2 | Ja | </ tr>
| Rffl PB / Rffl + | 1 | Nej |
Tabell 2. Framställning av möss. Modifierad från Chick et al. 7.
* Germline överföring bekräftades genom arv av genen-fällan allel detekteras genom PCR genotypning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector | |||
| PB-UPA | |||
| mPBase | |||
| mPBasePuro | |||
| Tissue Culture | |||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE | |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 | |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 | |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B | |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| T25 Flask | Corning | 353108 | |
| T75 flask | Corning | 353135 | |
| 100-mm plate | Corning | 353003 | |
| 150-mm plate | Corning | 430599 | |
| 96-well plate | Corning | 3585 | |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 | |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 | |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL | |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 | |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 | |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 | |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | ||
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 | |
| Electroporation | |||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 | |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Molecular Biology | |||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S | |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 | |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 | |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 | |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | |||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 | |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 | |
| Electrophoresis | |||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU | |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 | |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 | |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S | |
| 1 Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S | |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L | |
References
- Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
- Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
- Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
- Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
- Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
- Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
- Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
- Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
- Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
- Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
- Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
- Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
- Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
- Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).
