Acrylharz-Form Based Leiter Fixationstechnik in Nagetiere

Zusammenfassung

Traditionelle Kopffixationstechniken haben metallische Rahmen, die am Schädel befestigt sind, als Schnittstelle für Kopffixationsgeräte verwendet. Dieses Protokoll demonstriert eine rahmenlose, auf Acrylharz basierende Kopffixierungstechnik für Verhaltensaufgaben bei Nagetieren.

Zusammenfassung

Die Kopffixierung ist eine Technik, bei der der Kopf eines Tieres ruhiggestellt wird, indem ein Kopfpfosten am Schädel befestigt wird, um ihn starr zu klemmen. Die traditionelle Kopffixierung erfordert die chirurgische Befestigung von Metallrahmen am Schädel. Die befestigten Rahmen werden dann auf eine stationäre Plattform geklemmt, was zu einer Ruhigstellung des Kopfes führt. Metallrahmen für die Kopffixierung waren jedoch technisch schwierig zu entwerfen und in der allgemeinen Laborumgebung zu implementieren. In dieser Studie stellen wir eine neuartige Methode zur Kopffixierung vor. Unter Verwendung einer maßgefertigten Kopffixierungsstange wird der Kopfbestücker während der Implantationsoperation konstruiert. Nach dem Auftragen von Acrylharz zur Befestigung von Implantaten wie Elektroden und Kanülen auf dem Schädel werden weitere Harze aufgetragen, um eine Form zu bilden, die zum Anschluss des Fixierstegs passt. Der geformte Kopfbestücker dient als Führungsschiene, der Untersucher fixiert den Kopf des Tieres bequem, indem er den Kopfbestücker in die Öffnung der Fixierstange einführt. Diese Methode könnte leicht anwendbar sein, wenn eine Implantation mit Zahnacryl erforderlich ist, und könnte für Labore nützlich sein, die nicht ohne weiteres CNC-gefräste Metallkopfstützen herstellen können.

Einleitung

Kopffixierung oder Kopfrückhalte ist eine Technik zur Immobilisierung Kopf des Tieres durch das Anbringen eines Rahmens oder einer Platte auf dem Schädel für starre Klemm. Die Technik wurde für die präzise sensorische Stimulation, Verhaltenserkundung mit oder ohne neuronale Aufnahme in wachen Tieren ^{1-3 und} für juxtacellular Kennzeichnung während der ^{Schlaf-Wach-Zyklus} 4 übernommen. Es ist auch für in vivo bildgebenden ^5,6 eingesetzt. Jetzt Kopf Fixationstechnik ist ein häufig verwendetes Werkzeug in den Neurowissenschaften und Verhaltensforschung.

Grundsätzlich traditionellen Kopffixierung erfordert chirurgische Befestigung der Metall-Kopf-Beiträge auf der Oberseite des Schädels ^6-8. Die Anlagen werden dann auf einer stationären Plattform eingeklemmt, was zu einer Immobilisierung des Kopfes. Neurophysiologische Forschung im wachen Tieren wie neuronale und / oder optischen Aufzeichnungs, Gehirn-Schaltung Intervention wird Bildgebung des Gehirns durch die Implantationschirurgie Dentalacryl begleitet. Deshalb,es scheint eine einfache Aufgabe, um den Kopf Fixierung in diesen Laboratorien durchzuführen, wenn es notwendig ist, experimentell. Die Rahmen sollten so gestaltet sein, um leicht und klein genug sein, nicht auf natürliche Verhalten Tieres in ihre Käfige zu stören. Es bietet auch mechanische Festigkeit, wenn sie der stationären Plattform eingeklemmt ist. Es hat weitere Biokompatibilität je nach Versuchszwecken. Daher ist es technisch schwierig zu entwerfen und fabrizieren wie Kopf-Beiträge in allgemeinen Laborgeräten.

In dieser Studie wird ein neuartiges Kopffixierungsmethode beschrieben, die mechanische Festigkeit durch praktische Klemm ohne Verwendung von Metall-Kopf-Beiträge. Durch Verwendung des Verfahrens, konnte Kopffixierung unter allgemeinen Laborbedingungen, wo Implantationschirurgie ist in der Regel bei Nagetieren für Gehirn-Studie durchgeführt, durchgeführt werden. Die Metall-Kopf-Beiträge sind mit Acrylharz-Zement teilweise durch eine maßgeschneiderte Kopffixierung Bar und dem Formverfahren geformt ersetzt wird während Senioren getantation der Operation. Die Fixierung Bar bietet hohe räumliche Kompatibilität mit anderen Implantaten, wie neuronale Aufnahme Sonden, Stimulationselektroden. Auch es erleichtert die Schritte der Spannkopf des Tieres auf der Fixierung Plattform, indem Verschrauben. Wir verwendeten diese Methode in der vorherigen Verhaltensstudie und wir festgestellt, dass dieses Verfahren einfach zu implementieren ist und bequem in praktischen Versuchen ^9.

Protokoll

Ethics Statement:
Dieser Versuch wurde von der National University Kyungpook Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt und wurde nach den für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Institute of Health, 1996) Führer durchgeführt. Nach dem Experiment wurden die Tiere unter Kohlendioxid Euthanasie getötet.

1. Design der Kopffixierung Bar für Ratten

Hinweis: Dieser Schritt ist eine allgemeine Richtlinie für eine Fixierung Bar-Design. Jede Änderung über die Dimension und Material ist möglich, je nach Tieren oder Implantate. Entwerfen einer Kopf-Fixierungs bar mit CAD-Software ist empfehlenswert, aber nicht notwendig.

1. CAD-Software verwenden, um eine Fixierung bar zu gestalten.
   1. Entwerfen Sie eine Fixation bar eine rechteckige Form (123 x 35 x 6 mm) (Abbildung 1A). Einen rechteckigen Ausschnitt (16 × 20 mm; port) in der Mitte der Befestigungsleiste. In Pisten oder Vertiefungen which als Führungsschiene auf den Rändern der Öffnung (1A-a, -Pfeile 1B) dienen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Bereich des Hafens erstreckt sich der geschätzte Rechteck des Schädels rat über das Gehirn, um vertikale Zugriffe ermöglichen mit einem stereotaktischen Manipulators zu den meisten Bereichen des Gehirns durch eine Kraniotomie.
   2. Befestigen Platten (50 x 20 x 6 mm) mit zwei langgestreckten Verankerungslöcher auf beiden Seiten der Befestigungsleiste. Stellen Sie sicher, dass diese Löcher passieren Schrauben mit 6 mm Durchmesser (1A-d). Machen Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 3 mm vor dem Anschluss für einen Verriegelungshaken (1A-b).
   3. Stellen Sie eine Box mit einem Boden (135 × 305 mm) und die Seitenwände (305 × 76 mm). Bohren Sie zwei Löcher mit einem Durchmesser von 6 mm, wie in 1A (kleines Bild) angezeigt. In Stützmauern auf der Fixationsstange (1A-e).
2. Herstellung des gestaltete Bar und Kasten und montieren jede von ihnen mit Cyanacrylat alsin 1A (kleines Bild) angezeigt. Montieren Sie die Bar an der Box mit Schrauben mit 6 mm Durchmesser. Bewerben Steigung durch Anpassung der Schneckenposition des Stabes für ergonomisches Kopffixierung (1A-Einschub).
   HINWEIS: Bei Mäusen ist die Abmessung des Befestigungsleiste 60 x 20 x 4 mm (aus zwei Schichten besteht aus 2 mm starkem Acrylplatten). Der Port Quadrat der Breite von 8 mm (oben) und 9 x 10 mm (niedriger), wie in 1C gezeigt. Ankerplatten die gleiche Größe von Ratten. Die Box Platte und Seitenwände sind 100 x 72 mm und 100 x 50 mm.

2. Leiter Mounter Bau während der Implantation Chirurgie

ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Zahnacrylharz. Flüssigkeit kann Hautreizungen verursachen. Setzen Sie auf eine Maske und Handschuhe tragen. Arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich.

1. Vorbereitung vor der Operation
   1. Dich wickeln Sie den Rand des Hafens von der Fixierung bar mit aparaffin Folie, um die Haftung der aufgebrachten Acrylharz zum Stab zu verhindern (siehe 1B und 2A). Bestreichen Sie die Grenze des Hafens durch die Paraffinfilm mit einer dünnen Schicht aus Acrylharz bedeckt.
   2. Gebrauch sterilisiert chirurgische Instrumente. Gründlich zu desinfizieren stereotaktischen Rahmen und seine Umgebung mit 70% Ethylalkohol.
2. Führen stereotaktischen Implantationschirurgie
   1. Betäuben ein Tier durch intraperitoneale Injektion einer Cocktail-Mischung (2 ml / kg) von Ketamin 10 ml (50 mg / ml), 1,5 ml Xylazinhydrochlorid (23,32 mg / ml) und Kochsalzlösung 2,5 ml. Bestätigen Sie, dass das Tier vollständig betäubt und nicht zum Schwanz und Zehen Prisen zu reagieren. Injizieren Cocktail Mischung von 1 ml / kg während Operationen, wenn nötig.
   2. Befestigen Sie das Tier auf den stereotaktischen Apparat. Bewerben Augensalbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Operation zu verhindern. Rasur und reinigen Sie die Kopfhaut mit 70% Ethanol. Geben subkutane Injektion von 2% Lidocain und einzuschneiden SCAlp entlang der Mittellinie des Schädels. Komplett abkratzen Knochenhaut. Spülen mit Kochsalzlösung mehrmals.
   3. Machen Grat Lochbohren in der Nähe des Randes des Schädels. Implantatschrauben 4-5 Umdrehungen (bis zu 1 mm Tiefe) von der Schädeloberfläche, um einen Verstoß gegen die Dura mater zu verhindern. Achten Sie darauf, keine Leckage des CSF und Blut auf der Schädeloberfläche nach dem Schraubenimplantation. Spülen mit Kochsalzlösung und trocknen Sie die Schädeloberfläche mit Lufthauch, vor allem rund um die Schrauben.
   4. Coat Schädeloberfläche mit einer dünnen Schicht von "Dentalkleber (Super-Bond C & B)". Nicht vollständig bedecken die Oberfläche des Schädels einschließlich Bregma wenn zusätzliche Elektrodenimplantation soll. Verwenden Sie das Bregma zum Markieren Kraniotomie Koordinaten. Implant-Elektroden und / oder Microdrive und befestigen Sie es auf dem Schädel, indem Acrylharz um ihn herum.
   5. Gelten zusätzliche Acrylharz auf der Oberseite der Zahnzement. Verwenden Sie geeignete Menge an Acrylharz, um eine ausreichende Füllung-out Raum zwischen stabbeschichtet Harz ein zu verlassend Erstmontage Harz, wenn Fixieren Sie die Schrauben und / oder Elektroden (Abbildung 2A).
3. Legen Sie den Kopf-Fixierung bar 5 mm oder mehr über der Schädeloberfläche und richten ihr Zentrum (2A -Links).
4. Bewerben Acrylharz in den Spalt zwischen der Basis des Schädels und erste Befestigungs Harze. (2A -Center). Warten Sie, bis das Harz hart werden.
5. Entfernen Ohrleiste und ziehen Sie die Formmontagegerät aus der Fixierung bar Anschluss. (2A -Rechts). Zusätzliche Acrylharz sorgfältig gelten rund um die Kantenschienen des Formmontagegerät, wenn nötig.
6. Spülen der Wunde Oberfläche der Kopfhaut mit einer sterilen Kochsalzlösung. Injizieren eines Antibiotikums (Enrofloxacin, 5 mg / kg sc) und ein Schmerzmittel (Butorphanoltartrat, 2 mg / kg sc) unmittelbar nach der Operation. Haus des Tier einzeln in einem Käfig.

3. gewöhnen Tiere an Kopf-Fixierung

Hinweis: Dieser Schritt deritzt Gewöhnungszeitpläne auf der Grundlage empirisch erfolgreiche Einschätzungen Autoren. Für einen Überblick über die Gewöhnung Verfahren zur Kopffixierung, siehe Schwartz ^{10 oder} Guo ¹¹ Arbeit.

1. Geben ausreichende Erholungsphase (eine Woche oder mehr) zu den Tieren. Am Tag 1, Griff Tieren häufig unterteilt kurzen Sitzungen.
2. Am nächsten Tag (Tag 2), setzen das Tier zur Fixierung Umwelt (Kasten). Nicht den Kopf mounter in den Hafen der Fixationsstange einführen. Tiere verlassen, sich an die Umgebung zu bekommen. Sicher greifen die Kopfmontagegerät mit Hand für 1 bis 2 Sekunden und lassen Sie sie sofort. Wiederholen kurzfristige Fixierung von Hand-grab mehrmals.
3. Am Tag 3, zu gewöhnen Tiere Kopf-Fixierung.
   1. Bringen Sie Tiere aus den Käfigen und setzen Sie sie in der Box Regie Köpfe in Richtung des Hafens von der Fixierung bar. Besorgen Sie sich die Kopfmontagegerät und stecken Sie sie in den Hafen der Fixierung bar.
   2. Binden Sie die Montagevorrichtung (TiersKopf) mit dem Verriegelungshaken des Befestigungsleiste mit einem Gummiband. Stehen Sie für 5 min.
      HINWEIS: Berühren Sie nicht den Kofferraum oder Schwanz des Tieres nach der Fixierung, die das Tier führt zu quietschen und Kampf steigenden Tieres Stress. Wenn das Tier weiterhin kämpfen mehr als 1 min, loslassen und versuchen Sie es später. Von diesem Schritt Tieren zeigen, Urin und Kot ausgeschieden, wenn die Fixierung Kopf ausgesetzt, aber diese nach und nach wird so die Gewöhnung Erlös reduziert.
   3. Rufen Sie die Verriegelung Gummiband und Auswerfen der Montagevorrichtung aus dem Hafen. Setzen Sie die Tiere zurück zum Käfig und ein Stück von Getreide oder einen Sonnenblumensamen in den Heimkäfig als Belohnung. Die nächste Verhandlung beginnt in 30 min. Wiederholen 3.4.1 bis 3.4.4 fünf oder mehr innerhalb eines Tages.
4. An Tag 4 bis 7, freizulegen, das Tier, um die Fixierung Kopf in Protokoll 3.4 beschrieben. Schrittweise Erhöhung der Dauer der Kopffixierung (10 min, 20 min, 30 min und 50 min nach Gewöhnung Erlös).
   HINWEIS: Wenn Tiere tun nichtt füttern die Futterbelohnung, kann es ein Zeichen für ein hohes Maß an Stress. Die Fixierung der Zeit erhöhen Sie nicht. Wenn Tiere zeigen wiederholt kämpfen Verhalten, zu gewöhnen sie für einen längeren Zeitraum.
5. Überprüfen Sie das Körpergewicht Tieres täglich. Betrachten erfolglosen Gewöhnung, wenn das Körpergewicht abnimmt. Fahren Sie mit Verhaltensaufgaben mit Kopffixierung nach erfolgreicher Gewöhnung.
   ANMERKUNG: Erfolgreiche Gewöhnung erleichtert spätere Verhaltenstraining (3E und F).

Ergebnisse

Diese Kopffixierung Verfahren ist auf beiden Ratten und Mäusen. Insgesamt acht Ratten erhielten eine bilaterale Implantation von stimulierenden Elektroden in das mediale Vorderhirnbündel. Für vier von ihnen wurden maßgeschneiderte Wolframdraht-Elektroden (Microdrives) zusätzlich in die M1 forelimb Bereich (2C) implantiert. Für Mäuse (n = 2), vier Edelstahl-Drahtelektroden wurden in frontal / okzipitalen kortikalen Arealen implantiert. Während der Operation wurden Kopf Montagevorrichtungen für Kopf-Fixie...

Diskussion

Dieses Protokoll zeigt eine einfache und bequeme Methode zur Fixierung des Kopfes unter Verwendung der zur Hand befindlichen Materialien. Für eine körperlich erfolgreiche Kopffixierung besteht der erste kritische Schritt während der Operation darin, die Schädeloberfläche vor dem Auftragen des Zahnhaftharzzementes klar zu spülen und zu trocknen. Zweitens verwendet diese Methode keine Schrauben, die unter die Schläfenmuskulatur implantiert werden, und hängt nur von den Schrauben am Schädel ab, deren senkrechte Implantation...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dentales Acrylharz	Lang Dental Manufacturing	Ortho-Jet	zur Herstellung von Formbestückern
Paraffinfolie	Bemis	Parafilm	zur Verhinderung des Anhaften von Acrylharz an der Stange
Dentalkleber	Sun Medical	Super-Bond C& B	zum Verbinden zwischen Acrylharz und
Schädel Plexglas oder andere Acrylplatte			zur Herstellung von Fixierstangen und Kastenplattformen
Cyanacrylat			zum Verkleben von Acrylplatten