Mikroelektroden-geführte Implantation von Elektroden in den Nucleus subthalamicus des Rats für die Langzeit-Tiefe Hirnstimulation

Zusammenfassung

Ein Verfahren zur Implantation von Elektroden in den subthalamischen Kern (STN) von Ratten wird beschrieben. Eine bessere Lokalisierung des STN wurde durch den Einsatz eines Mikroaufzeichnungssystems erreicht. Des Weiteren wird ein Stimulationsaufbau vorgestellt, der sich durch lang anhaltende Verbindungen zwischen dem Kopf des Tieres und dem Stimulator auszeichnet.

Zusammenfassung

Tiefen Hirnstimulation (DBS) ist eine weit verbreitete und effektive Therapie für einige neurologische Störungen, wie idiopathische Parkinson-Krankheit, Dystonie oder Tremor. DBS wird auf der Abgabe elektrischer Impulse an bestimmte tiefen anatomischen Strukturen des zentralen Nervensystems. Die Mechanismen der Wirkung von DBS Basiswert bleiben rätselhaft. Dies hat zu einem Interesse an der Untersuchung der Auswirkungen der DBS in Tiermodellen, insbesondere bei Ratten führte. Wie DBS ist eine Langzeittherapie sollte die Forschung auf molekulargenetischer Veränderungen der neuronalen Schaltkreise, die nach DBS einige Wochen auftreten, fokussiert werden. Langfristige DBS bei Ratten ist schwierig, weil die Ratten bewegen sich in ihrem Käfig, was zu Problemen führt im Einklang anstelle des Drahtes, der von dem Kopf des Tieres an den Stimulator. Weiterhin sind Zielstrukturen für die Stimulation im Gehirn der Ratte klein und daher Elektroden nicht leicht auf die richtige Position gebracht werden. Somit wird ein Set-up für langanhaltende stimulation von Ratten mit Platin / Iridium-Elektroden mit einer Impedanz von ungefähr 1 M & OHgr; wurde für diese Untersuchung entwickelt. Eine Elektrode mit diesen Spezifikationen ermöglicht nicht nur eine angemessene Stimulation, sondern auch die Aufnahme von tiefen Hirnstrukturen, um den Zielbereich für DBS zu identifizieren. In unserer Einrichtung wurde eine Elektrode mit einem Stecker für den Draht in Dentalzement mit vier Verankerungsschrauben auf den Schädel befestigt eingebettet. Die Leitung von der Klemme an den Stimulator wurde von einem Edelstahlfeder geschützt. Ein Schwenk wurde an die Leitung angeschlossen, um den Draht verheddert verhindern. Insgesamt bietet diese Stimulation Set-up eine hohe freie Beweglichkeit für die Ratte und ermöglicht die Kopfstecker sowie der Drahtverbindung zwischen dem Stecker und dem Stimulator, um lang anhaltende Stärke zu halten.

Einleitung

Tiefen Hirnstimulation (DBS) ist eine Behandlung auf der Grundlage der Abgabe von elektrischen Impulsen über implantierte Elektroden um bestimmte Hirnstrukturen, wie dem inneren Globus pallidus ^1, Nucleus subthalamicus (STN) ^2-4 oder ventralen Zwischen Thalamus ^5. In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich diese Behandlung als leistungsfähiges therapeutisches Werkzeug für die Parkinson-Krankheit ¹ etabliert ^{- 4,} Dystonie ⁶ und Tremor ^{7 und} wird auch verwendet, um chronische Schmerzen ^7, psychiatrische Störungen (modulieren, dh Zwangsstörungen ^8, Hauptdepression ^{9) oder} schwer behandelbarer Epilepsie ^10,11. Außerdem DBS könnte, in der Zukunft, zu einem Behandlungsoption für feuerfeste arterieller Hypertonie ^{12 oder} orthostatische Hypotonie ^13.

Die physiologischen Mechanismen, die die Auswirkungender DBS bleiben weitgehend unverstanden. Studien an narkotisierten Nagetieren haben Einblick in neuronale Reaktionen auf Hochfrequenz-Stimulation, die klinisch angewendet nachahmen DBS ^{14 vorgesehen.} Allerdings sind diese Studien fehlen nicht nur Verhaltens Bestätigung der DBS-Effekt, sondern auch führen zu erheblichen Schwankungen in Abhängigkeit von den Stimulationsparameter angewendet ^14.

Um mehr prägnant die Auswirkungen auf das Verhalten und die zugrunde liegenden Mechanismen der DBS in bewusste Nagetieren zu untersuchen, wird ein Stimulationsaufbau benötigt, die bestimmte Anforderungen erfüllt. DBS wird überwiegend als Langzeittherapie verwendet (beispielsweise Parkinson-Krankheit, chronischem Schmerz). Somit sollte die Stimulation Aufbau in Nagetieren entwickelt werden, damit die Einheit besteht aus einer Elektrode mit einem Stecker sowie eine Leitung von der Klemme mit einer externen Stimulator; und das Gerät sollte leicht, aber unzerbrechlich sein, wenn auf den Totenkopf fixiert. Darüber hinaus ist die Freizügigkeit der Ratten während stimula unverzichtbartion über einen längeren Zeitraum. Die Zielstrukturen von DBS sind klein; beispielsweise der STN bei Ratten hat eine Länge von 1,2 mm und einem Volumen von 0,8 mm ^3,15. Daher müssen Elektroden ausgebildet sein, daß der Kern während des Einführens nicht läsionierten und Targeting Bedürfnissen genau zu sein. Da die meisten DBS an Nagetieren durchgeführt wurden, Wahrzeichen basierend stereo Einführen der Elektrode in die Zielstruktur verwendet werden, kann die Fehlerrate relativ hoch sein kann, auch wenn unter Verwendung der Koordinaten gemß Paxinos und Watson ^16. Dies resultiert in einer größeren Anzahl von Tieren benötigt, um eine statistisch sinnvolles Ergebnis zu erreichen.

In der vorliegenden Studie eine Elektrodenimplantationstechnik eingeführt wird, dass die STN mit hoher Genauigkeit Ziele mit Hilfe eines Mikroaufzeichnung System beim Vorschieben der Elektrode. Darüber hinaus wird ein Stimulationssystem vorgestellt, das nicht nur ermöglicht ein hohes Maß an Mobilität für die stimulierte Tier sondern garantiert auch kontinuierliche stimulatiauf über eine sichere Fixierung der Stimulationsdraht auf den Kopf der Ratte (die durch eine Edelstahlfeder geschützt ist).

Protokoll

Und durchgeführt gemäß den Empfehlungen für die Forschung in der experimentellen Schlaganfallstudien ¹⁷ und die aktuelle Tierforschung: Tierversuche wurden von der Universität Würzburg und der gesetzlichen staatlichen Behörden (54-2531.01-102 / 13 Unterfranken, Zulassungsnummer): zugelassene Meldung von In-vivo-Experimente Richtlinien (http://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Anästhesie

1. Überprüfen des Narkosesystems, um ausreichende Mengen von Versorgungsgas (Sauerstoff) und Isofluran für die Dauer des Verfahrens zu gewährleisten. Verbinden Sie den Nasenkonus mit der Schneideleiste des stereotaktischen Gerät und setzen Sie den Schneidebalken auf -3,3 mm.
2. Schalten Sie die Versorgungsgas (2 l / min). Legen Sie die Ratten in eine Kiste und Abdichtung der Oberseite. Schalten Sie die Isofluran-Verdampfer auf 3,5%.
3. Wenn die Ratte Liegerad, schalten Sie das System so, dass das Narkosegas strömt in die Vorsatzhaube, die auf die Schneideleiste befestigt ist.
4. Entfernen Sie die rat aus dem Feld Kammer und rasieren Sie den Bereich zwischen den Ohren und die Augen; mit einem Wattestäbchen mit Jodosept PVP getränkten Tupfer die rasierte Fläche, um alle losen Haare zu entfernen.
5. Positionieren Sie die Ratte in der Vorsatzhaube (Abbildung 1) und setzen Sie die Narkose mit Isofluran 2,5% _O 2 (1 l / min). Prüfen Sie das Niveau der Anästhesie durch Kneifen der Interdigitalbereich. Wenn die Ratte ausreichend betäubt werden die Abwehrreflexe abgeschafft (dh Rücknahme des Fußes).
6. Überwachen der Atmung und Reaktion auf die Stimulation während des Verfahrens und stellen Sie den Verdampfer bei Bedarf.
7. Bewerben vet Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Überwachen und Aufrechterhalten der Körpertemperatur auf 37 ± 0,5 ° C durch eine Rückkopplung gesteuert Heizsystem.

2. Chirurgie

1. Halten Sie das OP-Feld sterile während der gesamten Operation. Sobald die Operateurs Hände sind steril und das Operationsfeld ist steril, bewegen sich nur carefully und erinnere mich nicht, um die Sterilität zu brechen. Dies umfasst auch einen sterilen Bereich (dh sterile wasserdichte Vorhänge), auf dem kann man Instrumente abgesetzt.
2. Spritzen Sie 0,2 ml Mepivacain subkutan in die Mitte des rasierten Bereich. Mepivacain ist ein Lokalanästhetikum, das eine Wirkungsdauer von bis zu 3 Stunden hat. Es ist ferner zu betäuben den OP-Bereich.
3. Mit einem Skalpell, stellen ein Mittellinienschnitt ausgehend zwischen den Ohren und sich in Richtung 2 cm. Stellen Sie sicher, dass die Knochenhaut (glänzende Membran unter die Haut) ist ebenfalls eingeschnitten. Setzen Sie den Schädel mit vier Klammern (Abbildung 2).
4. Mit einem Wattestäbchen, entfernen Sie vorsichtig die Knochenhaut, bis die koronalen und sagittalen Nähten ausgesetzt sind; danach, Zuverlässig das Blut mit Watte.
5. Bestimmen Sie die Koordinaten des Bregma mit einer Nadel an einem Sondenhalter fixiert und dann markieren die Spitze der Nadel mit einem schwarzen Filzstift. Verwendung der anterior / posterior (AP), Mittellinie / lateral(ML) und dorsoventral (DV) Antriebsschrauben, positionieren Sie die Spitze der Nadel direkt über dem Bregma.
6. Nehmen Sie die AP und ML Nonius Messwerte: subtrahieren Sie 3,6 mm von der AP Lesen und 2,5 mm von der ML Lektüre für Elektrodenimplantation in die rechte STN, oder fügen Sie 2,5 mm für die Elektrodenimplantation in die linke STN. Diese Position wird durch den Farbstoff der Filzstift nach dem Absenken der Spitze der Nadel in die Oberfläche des Schädels markiert.
7. Klemmen Sie die Zahnbohrer auf die große Sondenhalter der stereotaktischen Instrument. Bewegen Sie den Dentalbohrer auf den berechneten Bereich - dh der markierten Stelle auf dem Schädel. Blick durch das Mikroskop, bohren Sie ein Loch (Durchmesser ca. 1 mm) durch den Schädel, bis die Dura sichtbar ist (der Schädel ist etwa 1 mm dick). Ziehen Sie die Dura mit Mikrodissektion Pinzette oder einer sterilen Nadel. Die Dura ist hart genug, um die Spitze der Elektrode zu zerstören.
8. Bohren Sie ein Loch mit dem Dentalbohrer in jeder Stirnbeinschuppe, und in der interparietal squama gegenüber dem Elektrodenloch. Trennen Sie das Sondenhalter von der stereotaktischen Instrument. Auf einem Schädel Naht Bohren Sie keine wie venösen Gefäße befolgen Sie die Nähte unter dem Schädel.
9. Schrauben Sie eine Knochenschraube in jede der fünf Löcher. Vermeiden Einfädeln der Schrauben zu tief. Für Edelstahl-Schrauben (M1.6), 2-3 Umdrehungen der Schraube wird die Schraube ausreichend zu halten, ohne Druck auf das Gehirn. Die Anzahl der Windungen auf der Steigung der Schraube ab. Klemmen Sie den Sondenhalter mit der Elektrode in den Mikromanipulator (Abbildung 3).
10. Unter Verwendung der AP, ML und DV Antriebsschrauben, bewegen Sie den Sondenhalter mit der Elektrode, bis die Spitze ist fast berühren die Bregma. Beachten Sie die AP, ML und DV Nonius Messwerte am Bregma. Wenn die Messwerte vorgenommen werden, erhöhen die Elektrode eine wenige Millimeter, um die Elektrode von Schaben der Schädel während der Bewegung zu verhindern. Zur Bestimmung der Koordinaten der Position, wo die Elektrode in eingefügtzu dem Loch, fügen Sie 3,6 mm an den AP Lesen und addiert (oder subtrahiert) 2,5 mm an den ML Lesen.
11. Unter Verwendung der AP und ML Antriebsschrauben, bewegen Sie die Elektrode an die berechnete Position. An diesem Punkt sollte die Elektrodenspitze direkt über dem gebohrten Elektrodenöffnung befinden. Dann, mit einem Blick durch das Mikroskop, senken Sie die Elektrode auf das Niveau der Dura (Abbildung 4). Diese Ebene dient als Nullniveau in der DV-Richtung. Danach schieben Sie die Spitze der Elektrode in das Gehirn, indem Sie durch das Mikroskop.
12. Schließen Sie das Elektrodenstift an den Anschluss des Aufzeichnungssystems. Setzen Sie einen Faraday-Käfig (oder ersetzen Sie es mit Aluminiumfolie) über die Ratte in der stereotaktischen Gerät an (Abbildung 5). Erden Sie den stereotaktischen Instrument mit dem Gegengewicht des Raumes, die in gearbeitet wird.
13. Starten Sie das Aufzeichnungssystem. Falls verfügbar, auch einen Lautsprecher zu verwenden, um ein akustisches Signal von Ableitungen / Salben einzelner Einheiten während advancin erhalteng die Elektrode.
14. Langsam die Elektrode in das Gehirn Einsatz durch Aufzeichnung der elektrischen Aktivität während der Förderung der Elektrode. In einer Tiefe von zwischen 7,5 und 8,1 mm von der Dura, ist die spezifische elektrische Aktivität des STN normalerweise nachweisbar (Abbildung 6). Die typische Aktivität von Neuronen in der STN wird durch eine unregelmäßige Schlagmuster und eine hohe Feuerrate gekennzeichnet (mittlere Frequenz: 40,9 ± 12,9 Hz) ^18.
15. Während der Aufzeichnung zu verringern Narkose möglichst viel (zum Beispiel um 0,8-1,0%); Low-narkotisierten Tiere zeigen ein klareres elektrische Aktivität des Gehirns.
16. Tupfer entfernt kein Blut oder Liquor, die an der Oberfläche des Schädels verschoben wurde beim Absenken der Elektrode.
17. Mischen Sie eine kleine Menge von Zahnzement und wenden es um die Elektrode und um vier der fünf Schrauben mit einem kleinen Spatel (Abbildung 7). Die fünfte Schraube wird verwendet, um das Erdungskabel des Steckers zu fixieren.
18. Trennen der Elektrodenanschlussstift von dem Elektrodenhalter und der Verbinder des Aufzeichnungssystems, wenn der Zahnzement fixiert.
19. Lösen Sie die Schraube, die nicht von Zahnzement fixiert wurde. Stecken Sie den Stecker auf der Elektrodenstift. Befestigen Sie das Erdungskabel des Steckers mit dem fünften Schraube (Abbildung 8).
20. Mix up Zahnzement und wenden es um den Stecker. Da die Zement verdickt, formen es um den Stecker, eine Kappe zu bilden. Vermeiden Sie scharfe Kanten der Zahnzement, die das Tier schädigen und beim Aushärten (9A und B) entfernen kann.
21. Debride Wundränder und zu schließen durch eine Naht an der Vorderseite und hinter der Kappe. Desinfizieren Sie die Wundränder.
22. Schließen Sie das Kopfstecker an den Draht, die auf einem Dreh befestigt ist. Entfernen Sie die Ratte von der stereotaktischen Instrument.
23. Gelten Tramadol (12,5 mg / kg, intraperitoneal) am Ende des Eingriffs und dann einmal täglich für 2-3 Tage. Legen Sie die Ratte in einem sauberen Käfig mit Thermal Unterstützung, fixieren den Dreh auf dieser Käfig (Bild 10), und überprüfen Sie es sorgfältig auf 1 Std.
24. Haben ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück.

3. Stimulation

1. Bestimmen den Widerstand des Tieres vor der Stimulation mit einem Impedanzmesser.
2. Verbinden Sie den Stecker des Dreh mit einem Draht und der Stecker am anderen Ende des Drahtes mit dem Stromausgang und dem Ausgang für das Massekabel des Stimulators. Verbinden Sie den Stimulator mit einem Computer, um den Stimulator programmieren.
3. Wählen Sie die Parameter der Stimulation im Programm; zum Beispiel sind die bei der Parkinson-Krankheit verwendet Parameter Pulslänge: 60 & mgr; s; Frequenz: 130 Hz. Stimulieren die Ratte mit einer steigenden Stromamplitude, bis Dyskinesie werden erkannt. Reduzieren the elektrische Intensität um 10-20% unter der Intensität, die Dyskinesien hervorgerufen oder bis neurologische Symptome verschwinden und das Tier ist bequem. Einphasige Rechteckimpulse wurden in dieser Studie verwendet.
4. Nach Abschluss des Experiments, das Tier einschläfern mit Isofluran: Stellen Sie die isofurane Flussrate oder Konzentration bis 5% oder mehr. Weiter Isofluran Exposition bis 1 min nach dem Atemstillstand.

Ergebnisse

Implantieren einer Elektrode in die STN einer Ratte unter Verwendung eines Aufzeichnungssystems - wie hier dargestellt - ist ein wirksames und genaues Verfahren für DBS, die etwa 1 Stunde pro Tier erfolgt. Dieses Modell ist ein ziemlich kleiner Eingriff: von 10 Ratten, die Operation unterzogen, überlebt die ganze Intervention. Vierundzwanzig Stunden nach dem Eingriff wurde der Zustand jeder Ratte überwacht und kein Tier erreicht mehr als 1 um 3 Punkte nach dem Schweregrad. Während der Zeit der kontinuierliche Stimulatio...

Diskussion

Diese Studie stellt eine Schritt-für-Schritt-Satz von Anweisungen zum Implantieren einer monopolaren chronischen Elektrode in den STN von Ratten. Obwohl Wolframelektroden niederohmig werden häufig für DBS ^18,19, einer monopolaren Elektrode aus Platin / Iridium (Pt / Ir) verwendet wird, das eine Impedanz von ungefähr 1 M & OHgr gemacht hatte eingesetzt. Pt / Ir-Elektroden sind auch bei Patienten mit Parkinson-Krankheit aufgrund ihrer günstigen Eigenschaften verwendet: sie zeigen minimale Erosion

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pt/Ir-Elektrode	FHC Inc.	UE	Sonderanfertigung: Spezifikation: UEPSEGSECN1M
Stecker	GT Labortechnik (Arnstein/Deutschland)		Sonderanfertigung
Stiftleiste	DISTRELEC	143-95-324	einreihig, 90° 1x3 Datamate, Typ M80-8420342
Steckdose	DISTRELEC	143-95-621	einreihig, gerade 2 mm Pol Nr.1 x 3 Datamate, Typ M80-8400342
Edelstahlfeder	Kunststoff ONE	SS0102	Teile-#: .120 X .156 Feder-ID (mm): 3.0  Feder AD (mm): 4,0
Zahnzement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	Liquid, 500 ml
Zahnzement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	Pulver, rosa, 500 g
Kopfschraube	Hummer & Reiss	V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept PVP	Vetoquinol		435678/E04
Mepivacain 1%	AstraZeneca		PZN03338515
Epinephrin	Sanofi-Aventis		PZN00176118
Tramadolhydrochlorid	Rotexmedica		38449.00.00