Ein unberechenbarer Chronische leichter Stress Protokoll zur Anstiftung depressive Symptome, Verhaltensänderungen und negativen gesundheitlichen Folgen in Nagetiere

Depressive psychischen Erkrankungen ist eine komplexe neurologische Erkrankung, die derzeit als eine führende Ursache von Behinderungen und Krankheitslast weltweit anerkannt wird. Die NIMH berichtet, dass etwa 12% der Amerikaner leiden an einer klinischen Depression, mit doppelt so viele Frauen im Vergleich zu Männern ¹ betroffen. Allein in den USA, Konten Depressionen für Milliarden von Dollar direkten Gesundheitskosten und schätzungsweise 193 Mrd. $ mehr bei den indirekten Kosten (abgesenkt Ertrags- und Produktivitätsverluste) ^2. Symptome der Depression sind Anhedonie, Gewichtsveränderungen und Schlafzyklen, verminderte körperliche Aktivität und Körperpflege, Gefühle der Hoffnungslosigkeit oder Schuld und / oder wiederkehrende Gedanken an Tod oder Selbstmord. Während des letzten Jahrzehnts, epidemiologischen und klinischen Studien haben gezeigt, dass eine Depression ist ein unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen (CVD) Morbidität und Mortalität ^{3 und} prädiktiv ist schwereren Prognose von kardiovaskulären Erkrankungen, einschließlich atherosclerosis, Hypertonie, Myokardinfarkt und koronare Herzkrankheit, unabhängig von der Vorgeschichte offene CVD ^4. Trotz der steigenden Prävalenz und die öffentliche Gesundheit Auswirkungen von Depression wird der Ätiologie und verwandte Pathophysiologie dieser Erkrankung schlecht verstanden und die Heterogenität der Erkrankung infolge verschiedener Faktoren (zB genetischen, biologischen und Umweltkomponenten) wurde die klinische Diagnose schwierig gemacht definieren.

Daten zeigen, dass unlösbare psychischer Stress ist ein wichtiger Faktor für die Entwicklung von depressiven Erkrankungen und kann auch ein starker pathogener Faktor verbindet Depressionen und CVD, zum Teil auf Störungen und Fehlregulation der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA) ^5,6 sein. Dysfunktion der HPA-Achse ist ein wichtiger Mechanismus, der an die in der Depression beobachtet verhaltensmäßigen und physiologischen Veränderungen und die Entwicklung mehrerer CVD Risikofaktoren in Verbindung gebracht wurde, einschließlichDyslipidämien, Fettleibigkeit und ^{Diabetes. 7} Mehreren Tiermodellen der Depression in Versuch, den Mechanismus der veränderten HPA-Achse Aktivitätscharakteristik der klinischen Depression replizieren entwickelt worden; solche Modelle bieten eine validierte Verfahren zur Untersuchung der Verhaltens, neurologischen und physiologischen Veränderungen mit chronischem und akutem Stress bei Tieren. Die Gültigkeit der einem Tiermodell der Krankheit wird auf der Relevanz der Ätiologie und das Fortschreiten der Design-Modell und seine Fähigkeit, anatomischen, neurophysiologische rekapitulieren, und in der menschlichen Krankheit beobachteten Verhaltens Merkmalen. Darüber hinaus sollte der präklinischen antwortet Behandlungen (wie SSRIs) ähnliche Ergebnisse wie die in klinischen Situationen beobachtet ergeben.

Mehrere Tiermodelle von Stress-induzierten Depressionen sind derzeit in der Forschung verwendet werden, wie zum Beispiel erlernte Hilflosigkeit, frühes Leben Stress und soziale Niederlage Stress. Jedoch hat jedes dieser Modelle inhärente Nachteiledass ihre translationalen Effektivität ⁸ zu verringern. In den letzten Jahrzehnten hat sich das Unvorhersehbare Chronische Geringe Belastung (UCMS) Protokoll als eine der translational relevanten Modellen zur Untersuchung der Pathophysiologie der Depression bei Nagern ⁹ entstanden. Dieses Modell basiert auf dem Grundgedanken, die chronische Exposition gegenüber Stressoren stört Stress-Antwort-Systemen und führt letztendlich zur Entwicklung von depressiven Störungen basiert. Während des UCMS Protokoll werden die Tiere in eine randomisierte Reihe von milden ökologischen und sozialen Stressoren täglich ausgesetzt. Ein entscheidender Faktor, der die Relevanz dieses Modells für die menschliche Situationen erhöht liegt in dem hohen Grad an Unvorhersehbarkeit und Unkontrollierbarkeit der Stressoren sowie den Zeitpunkt, zu dem sie eingeführt werden. Darüber hinaus verwendet der UCMS Protokoll nur milden Stressoren, anstatt sich auf frühen Leben oder aggressive physikalische Reize. Über einen Zeitraum von UCMS Exposition entwickeln depressive Verhaltensweisen und sind vergleichbar mit Clinschen Symptomen, einschließlich verringerte Reaktionsfähigkeit auf Belohnungen (Anhedonie), Veränderungen in der körperlichen Aktivität und Ermittlungsverhalten (Hilflosigkeit und Verzweiflung), Verschlechterung der Mantel Staat und verändert sexuellen Aktivität ^10. Fast alle nachweisbaren Symptome der Depression wurden unter Verwendung dieses Modells gemeldet, und Studien haben gezeigt, dass diese Verhaltensweisen bestehen bleiben für mehrere Wochen nach dem Ende der Stress. Darüber hinaus können diese UCMS induzierten depressive Verhalten allmählich durch chronische verehrt werden, aber nicht akuter Behandlung mit bestimmten Antidepressiva, was ähnliche neurologische Wirkungen der therapeutischen Verbesserung, die genau widerspiegelt die klinische Wirkung und variable Wirksamkeit dieser Mittel bei Menschen ^{11,14- 18.} Hier berichten wir über eine detaillierte Beschreibung der UCMS Protokoll und typische Verhaltens und Gefäß Ergebnisse bei Mäusen.

Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der West Virginia University Health Sciences Center genehmigt.

1. Auswahl der Tiermodell

HINWEIS: Die am häufigsten verwendeten Arten in der UCMS Modell gehören Sprague Dawley und Wistar-Ratten und die BALB / cJ Maus; anderen murinen Modelle haben eine begrenzte Wirksamkeit gezeigt (DBA / 2, C57BL / 6). Allerdings sollten sich sorgfältig überlegen, die besondere Maus oder Ratte Stamm der Wahl gegeben werden, wie die genetischen Hintergrund und die Anfälligkeit für Umwelt-Stressoren stark variieren zwischen den Arten und haben gezeigt, dass kritische Faktoren, die die Ergebnisse der Studie ^{11,14,15 sein, 19.}

1. Verwenden Tieren des betreffenden Alter wie dieses Protokoll dauert lea (zB wenn der gewünschte Endpunkt ist, um in einer 17 Wochen alten Ratten bewertet werden, werden die Ratten müssen die UCMS Protokoll bei ~ 9 Wochen alt zu starten)st 7-9 Wochen vollständig zu induzieren depressive Symptome.
2. Einzelhaustieren unterzogen UCMS in IACUC zugelassenen Käfigen und Einrichtungen, mit Essen und Standardfutter ad libitum (wenn nicht anders von spezifischen Protokolls erforderlich).
3. Seien Sie besonders vorsichtig, um sicherzustellen, Kontrollen werden in einem ruhigen Raum mit minimaler Aktivität untergebracht, um Auswirkungen von möglichen unbekannten Umwelt-Stressoren reduzieren.

2. Unvorhersehbare Chronische leichter Stress Protocol

HINWEIS: Tiere unterziehen UCMS werden täglich zu einem Reinraum für UCMS Manipulationen verwendet transportiert (> 5 Tage pro Woche). Tiere werden auf 1 oder 2 der unter jedem Tag aufgelistet Stressoren ausgesetzt. Stressoren auf einem randomisierten Zeitplan durchgeführt wird, und jede Spannung für mindestens 3-4 Stunden verabreicht wurde (siehe Tabelle 1).

1. Das Bettzeug zu dämpfen durch Gießen 10-20 Unze. von sauberem Wasser in jedes Standard-Käfig. Einstellen der Wassermenge entsprechend der Größe desKäfig, um die Bettwäsche komplett zu dämpfen, aber nicht Bündelung von Wasser führen. Wohnen die Tiere in feuchten Käfig für 3-4 Std.
2. Decken und Kissen entfernen von jedem Käfig für 3-4 Stunden, nach denen Tiere in einen anderen überführt Stressor einen leeren Käfig (flache Wanne, Käfig Tilt) erfordern oder in einen sauberen Käfig mit frischer Bettwäsche gestellt.
3. Tilt Käfigen auf ca. 45 (ohne Bettzeug) für 3-4 h °. Käfige können mit einem stabilen Objekt, das an Ort und Stelle bleiben, wie das Tier bewegt sich in den Käfig wird gekippt werden.
4. Alter normalen 12 h / 12 h Hell / Dunkel-Zyklen in die Folgen von 30 Minuten Perioden Dauer von 8 Stunden. Nach kehren Tiere in den normalen Zyklus.
5. Übertragen jedes Tier von seinem Heimkäfig derjenigen der Käfig aus einem benachbarten Tier, das für 3 Stunden entfernt wurde.
6. Alle Betten Entfernen von jedem Käfig und Wasser bis zu einer Tiefe von ~ 0,25 Zoll für Mäuse oder ~ 0,5 Zoll für Ratten ca. 4 Std. Verwenden Sie Wasser, das wärmer als RT (~ 30 ° C), um HYPOTHERM minimierenia Potenzial. Kurz trockenen Tieren mit einem weichen Handtuch am Ende der Wasserexposition vor der Platzierung in saubere Käfige.
7. Expose Tiere Raub riecht / klingt durch Zugabe von zufällig verteilten Musterhaarbüscheln oder Urin (10-20 ml) aus dem natürlichen Raubtier-Arten in den Käfig für 3-4 Std. Alternativ spielen Knurren oder räuberischen Geräusche aus natürlichen Feind Arten in unmittelbarer Nähe zu Käfigen für 3 Stunden.
8. Am Ende eines jeden täglichen Stress Periode, legen alle Tiere in saubere Käfige und bringt sie zu dem Gehäuse Möglichkeiten.

3. Tier Monitoring / Grooming Stände

1. Untersuchen Sie jedes Tier täglich für die Entwicklung von Wunden oder Wunden, die tierärztliche Behandlung erfordern. Tiere, die milde Verletzungen können in der UCMS Protokoll über die Genehmigung des Tierarztes weiter zu entwickeln.
   1. Zwei Ermittler bei der Bewertung Fell Pflege geschult kontrollieren jedes Tier und weisen eine wöchentliche Mantel Punktzahl auf einer Skala von 0-1. Diese Punktzahl ist abzuschreckenabgebaut durch die Zuordnung einzelner Noten (0- sauber, 1-dirty) zu jedem der 8 Körper Regionen- Kopf, Hals, Rücken-Mantel, ventralen Fell, Schwanz, Vorderbeine, Hinterbeine und Genitalbereich. Die gleichen Ermittler sind, diese Aufgabe in der gesamten UCMS-Protokoll durchführen, um die Konsistenz bei der Zuordnung Mantel Noten zu halten.
   2. Jedes Tier, das eine scharfe Verringerung des Körpergewichts (dh> 15%) erlebt sollte dem Veterinärpersonal gemeldet werden und müssen aus dem Protokoll entfernt werden.

4. Behavioral Testing und Zielparameter

HINWEIS: Mehrere Bewertungsmethoden verwendet werden, um Verhaltensänderungen von der UCMS Protokoll bei Nagetieren zu quantifizieren.

1. Kumulative Coat Grooming Score.
   1. Wie oben beschrieben, wird eine wöchentliche Fell Pflege Punktzahl für jedes Tier zugeordnet.
2. Saccharose Splash Test:
   1. Legen Sie das Tier in einem sauberen Käfig mit einem Wattebausch oder Tuch, um zu verhindern, Bettwäsche ausgekleidetaus, um sein Fell haften. Sprühen Sie eine 10% Saccharose-Lösung auf den Kopf und Rückenbeschichtung von jedem Tier und notieren Gesamtputzverhalten für 5 min.
   2. Grooming-Aktivität (definiert als die Reinigung des Fells durch Lecken oder Kratzen) durch Latenz (Wartezeit zwischen der ersten Spritz und Initiierung von Grooming) und Frequenz (Anzahl der Male Grooming einen bestimmten Körperteil) gemessen.
3. Saccharose Vorlieben Test:
   1. Gewöhnen Tieren zu trinken 1% Saccharose-Lösung (w / v) 72 Stunden vor dem Test und geben Sie dann die Exposition gegenüber zwei Flaschen (1% Saccharose-Lösung gegenüber Leitungswasser in verschiedenen Flaschen). Nach Gewöhnung, bieten Tieren ad libitum Zugang zu Saccharose-Lösung und Leitungswasser für 3 Stunden. Nach 3 Stunden Aufzeichnung der Verbrauchsmengen der Saccharose-Lösung und Leitungswasser und berechnen Saccharose bevorzugt als: [(Saccharose Verbrauch) / (Wasserverbrauch + Saccharose Verbrauch)] × 100.
4. Schwanz Suspensionstest (Mäuse Only):
   1. Suverbringen Mäuse beim Schwanz von einem stabilen Stab (20 cm vom Boden) mit Klebeband (2 cm von der Spitze der Rute). Nehmen Immobilitätszeit über 5 min. Mäuse werden als immobile nur, wenn sie passiv und vollständig regungslos hängen.
5. Forced Swim Test:
   1. Ort Tieren in einem Behälter (~ 15-20 cm Durchmesser für Mäuse; ~ 55-60 cm Durchmesser für Ratten) mit Wasser bei einer Temperatur von 26 ± 0,5 ° C gefüllt. Notieren Sie sich die Latenzzeit auf den ersten Kampf der Mobilität und der Zeit, während der 5-Minuten-Testphase verbracht unbeweglich. Am Ende eines Tests, legen Sie das nasse Tier in einem Haltekäfig auf einem Heizkissen (30-35 ° C) mit normalen Betten durch ein saugfähiges Papiertuch abgedeckt, bis trocken.
6. Elevated Plus Maze:
   1. Lassen Sie jedes Tier, um das Labyrinth frei für 5 min zu erkunden. Rekord-Einträge in jedem Arm, und die Gesamtzeit in jedem Arm verbracht, nach apriorischen Kriterien ^20.
7. Locomotor Aktivität:
   1. Nehmen Aktivitätsniveaus, definiert als Gesamtbewegung, kunstbewegungen, Aufzucht Bewegungen und Nichterwerbstätigkeit, sowohl akute (30 min) und / oder chronischen (12 hr) Zeiträume. Tun Sie dies mit Hilfe der eigenen Käfig oder eine neue Umgebung, in Abhängigkeit von der individuellen Umwelt (obwohl Konsistenz beibehalten werden sollte) in Echtzeit von einem Beobachter oder post-hoc durch die Wiedergabe und Analyse von Kamera-Aufnahmen.

5. Erweiterung / Variation UCMS Protocol

1. Verwalten geeignete therapeutische Mittel oder Herausforderungen, um ihre Fähigkeit, entweder stumpf die Entwicklung UCMS induzierten Ergebnisse (wenn frühzeitig initiiert) oder Schwere der fest UCMS induzierten Ergebnisse umkehren (wenn spät eingeleitet) zu studieren. Dies ist abhängig von der einzelnen Labor oder Protokoll ^11.

6. Endergebnis Assessments

1. Nach dem Abschluss der UCMS Protokolle und Verhaltenstests, nutzen Tieren in den Folge experFormen in einer Weise, die die spezifischen Hypothesen, Ziele oder Ziele der einzelnen Labor anspricht.
   HINWEIS: Als Beispiele können diese kardiovaskulärer, entzündlicher oder endokrine Reaktionen, die chronischem Stress umfassen. Alternativ können therapeutische Eingriffe an diesem Punkt eingeführt werden, um ihre Wirksamkeit und mechanistischen Grundlagen zu bewerten.

Ein Beispiel der Zeitplan für eine Woche nach dem UCMS Verfahren ist in Tabelle 1. Jede Woche gezeigt, wurden Stressoren randomisiert acclamation verhindern und Unvorhersehbarkeit der Stress Herausforderung jeden Tag zu gewährleisten.

Maßnahmen der Depressive wie Behaviors

Nach 8 Wochen UCMS gab es erhebliche Veränderungen an beiden verhaltensmäßigen und physiologischen Ergebnissen bei chronisch gestresst Nagern in Bezug auf ihren unbelasteten Kontrollstämme. Entwicklung von depressiven Symptomen wie folgt UCMS war Einschätzung über Mantel Punktzahl, Saccharose splash Test und der Schwanz Suspension (nur Mäuse; verweist 12,13). Eine fortschreitende Rückgang der Mantel grooming Noten wurde in allen UCMS Tieren (Bild 1, Teil A) beobachtet, und dies markiert Verschlechterung in den physikalischen Zustand des Fells schlägt verringerte Pflegetätigkeit. Dieses Verhalten kann die fehlende Motivation oder Verlust von Interesse an p parallelerforming täglichen Aufgaben, wie die Aufrechterhaltung des minimalen Körperpflege.

UCMS Tiere zeigten auch eine erhöhte Latenzzeit zu pflegen und reduzierten Gesamt grooming Zeit in der Saccharose-splash-Test (Abbildung 1, Panels B und C). Erhöhte Zeit zu initiieren Putzverhalten zusammen mit verringerter Zeitaufwand für Pflege wird mit reduzierter Motivation und einem Rückgang der selbststimulierendes Verhalten, oder verminderte Empfindlichkeit gegenüber Freude verbunden. Dies ist repräsentativ für den Kern Symptom der Depression, Anhedonie. Darüber hinaus gibt es einen deutlichen Anstieg in der Immobilitätsdauer im Schwanzaufhängungstest an Mäusen. Wie zuvor angegeben, ist dieses Verhalten ein Maß behavioral despair mit größerer Immobilität, die einen schweren depressiven wie Symptom.

Maßnahmen der physiologische Veränderungen

MAP kann deutlich als Ergebnis der UCMS Protokoll erhöht werden, aber dies ist nicht konsistent beobachtet ( (Figur 2). Diese erhöhte Verschiebung hin abgestumpft Dilatator Reaktionen in klinischen Fällen von erhöhten Risiko für die Entwicklung von Herz-Kreislauf-Krankheit beobachtet.

UCMS Mäusen manifestiert erhöhten Plasmaspiegel von Cortisol, einem Marker der chronischen physiologischen Stress und Nitrotyrosin, einem Marker der chronischen oxidativen Stress (Tabelle 2).

Zusätzlich zeigten UCMS Mäusen signifikant erhöhte Spiegel von proinflammatorischen Marker TNF-α und MCP-1. Zusammen legen diese Ergebnisse nahe, dass gestressten Tieren einen pathophysiologischen Profil folgenden 8 Wochen UCMS (Tabelle 2) zu entwickeln.

Divergence mit Sex

Neuere Erkenntnisse wurde vorgeschlagen, dass es eine wesentliche quantitative divergence in den Antworten auf UCMS zwischen männlichen und weiblichen Mäusen (13). Insbesondere zeigen die Daten, dass die weiblichen Mäusen auf das identische UCMS Protokoll als bei gleichaltrigen Männchen ausgesetzt entwickeln schwereren Verhaltensreaktionen auf das Protokoll als dies Männern (Tabelle 3 und Abbildung 3), die mit erhöhten Konzentrationen von Cortisol, Nitrotyrosin und Entzündungsmarkern .

Trotz dieser Unterschiede zwischen den Geschlechtern nach dem UCMS Protokoll erscheint jedoch die Vaskulopathie, die als Ergebnis entwickelt, um in das weibliche Geschlecht abgestumpft im Vergleich zu den Männern, was stark darauf eine überlegene Wartung der Endothelfunktion werden, trotz der kompromittierten Umgebung (Abbildung 4) .

Für den 1 und 3 wurden die Ergebnisse mit den oben beschriebenen, mit der Anwendung von ANOVA und t-Tests geeigneten Techniken erhalten. Für den 2 und 4 wurden die Ergebnisse erhalten u singen Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen in der ex vivo Aortenring Zubereitungen. Kurven wurden mit einem Drei-Parameter logistischen Gleichung wie für den unteren Grenzen der Kurven geeigneten Passung mit ANOVA und t-Tests. Bitte siehe Referenzen 12,13 für Details.

Abbildung 1. Depressive Symptome folgenden acht Wochen der UCMS bei Mäusen. Die Daten werden für Mantel-Status (Teil A), die Latenzzeit (Feld B) und Frequenz (Feld C) von Gesichts-Pflege nach einer 10% Saccharoselösung Spray, und die Gesamt vorgestellt Zeit der Immobilität während der Schwanz Suspensionstest (Feld D) zur Steuerung und UCMS Mäusen. * P <0,05 im Vergleich Steuerung heraus siehe Bezugs 12 für weitere Einzelheiten.Lank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Vasodilator Responses to Methacholine von Mäusen nach acht Wochen der UCMS. Die Daten werden für die Mäuse unter Kontrollbedingungen (Steuerungsuntergrenze = 10,3 ± 2,4%) und die folgenden acht Wochen des verhängt UCMS Protokoll (UCMS Untergrenze = 33,6 ± 4,4 vorgestellt %). * P <0,05 im Vergleich zu Reaktionen in unbehandelten Gefäßringe von Kontrollmäusen. Re druckten vom Referenz 12 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Unterschiede der depressiven Symptome Folgenden Acht Wochen der UCMS in männlichen und weiblichen Mäusen. Die Daten werden für Mantel-Status (A), die Latenzzeit (B) und der Frequenz (C) von Gesichts-Pflege nach einer 10% Saccharoselösung Spray, und die Gesamtdauer der Bewegungslosigkeit während die vorgestellt tail Suspensionstest (D) für die Steuerung und UCMS Mäusen. * P <0,05 versus Kontrolle in der Sex; † p <0,05 im Vergleich zu UCMS-Male. Re druckten vom Referenz 13 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Die Unterschiede in Vasodilator Antworten von männlichen und weiblichen Mäusen folgenden acht Wochen der UCMS. Dilator Antworten Aortenringen zur Steigerung concentrations Methacholin (obere Tafel) und Natriumnitroprussid (untere Reihe) von Mäusen, die unter Kontrollbedingungen und nach acht Wochen UCMS. * P <0,05 versus Kontrolle in der Sex; † p <0,05 im Vergleich zu UCMS-Male. Re druckten vom Referenz 13 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1. Zwei Proben Wochen für die Verhängung von unvorhersehbaren chronische milde Stress (UCMS) Protokoll.

Tabelle 2. Baseline-Charakteristika zwischen Maus Gruppen unter Kontrollbedingungen und nach 8 Wochen der UCMS. Alle Mäuse sind 17-18 Wochen gealtert. * P <0,05 gegenüber der Kontrolle. Geändert von Referenz 12.

Tabelle 3 Baseline-Charakteristika zwischen männlichen und weiblichen Maus Gruppen unter Kontrollbedingungen und nach 8 Wochen der UCMS. Alle Mäuse sind 17-18 Wochen gealtert. * P <0,05 gegenüber der Kontrolle. Geändert von Referenz 13.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.