Method Article

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

DOI:

10.3791/53113

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December 11th, 2015

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1Department of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University, 2Neurophysiology Research Center, Shahed University, 3Cellular and Molecular Research Center, Iran University of Medical Sciences, 4School of Advanced Technologies in Medicine, Iran University of Medical Sciences

In This Article

Summary

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Astrozyten im ZNS verändern ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften als Reaktion auf schädliche Reize. Dieser Bericht stellt ein Protokoll zur Beurteilung der dreidimensionalen Astrozytenmorphologie bei Erkrankungen oder nach therapeutischen Eingriffen vor.

Abstract

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Gliazellen im Gehirn haben Astrozyten diverse funktionelle Rolle im zentralen Nervensystem. In Gegenwart von schädlichen Stimuli, Astrozyten ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften, eine so genannte reaktive Astrogliose modifizieren. Hier wird ein Protokoll für die Beurteilung der morphologischen Eigenschaften der Astrozyten wird vorgestellt. Dieses Protokoll umfasst die Quantifizierung der 12 verschiedene Parameter, dh die Fläche und das Volumen der von einem Astrozyten (Astrozyten Gebiet) abgedeckt Gewebe, das gesamte Astrozyten einschließlich Filialen, Zellkörper und Kern sowie Gesamtlänge und die Anzahl der Filialen, die Intensität Fluoreszenz Immunreaktivität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet, und Astrozyten Dichte (Anzahl / 1000 um 2). Hierzu dreidimensionale (3D) konfokale mikroskopische Bilder wurden erzeugt und 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity 6.3 wurde für die Messungen verwendet. Rattenhirngewebe, um Beta-Amyloid 1-40 ausgesetzt (1-40) mit oder ohne einen therapeutischen Eingriff verwendet wurde, um das Verfahren darzustellen. Dieses Protokoll kann auch für 3D morphometrische Analyse anderer Zellen entweder in vivo oder in vitro-Bedingungen verwendet werden.

Introduction

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Bei gesunden zentralen Nervensystems (ZNS), spielen Astrozyten eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutflusses, Energiestoffwechsel, synaptische Funktion und Plastizität und extrazellulären Ionen und Neurotransmitter Homöostase 1-3. Darüber hinaus Astrozyten reagieren auf verschiedene schädliche Reize und anormale Zustände wie Trauma, Infektion, Ischämie oder Neurodegeneration über reaktive Astrogliose die durch Hypertrophie, Proliferation und funktionellen Umgestaltung Astrozyten 4,5 gekennzeichnet ist.

Reaktiv Astrogliose kann die Entzündungsreaktion und Reparaturprozesses in der Gewebezüchtung, und daher ka....

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Protocol

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Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH) eingestellt Politik von Ethic Ausschuss der Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran) zugelassen wurde.

1. Tiere, Chirurgie und Probenvorbereitungen

HINWEIS: Bereiten Hirngewebe für 3D-konfokale mikroskopische Analyse.

  1. Divide Tiere zufällig in zwei Gruppen: 1-40 -Injektion (n = 8) und 1-40 -Injektion mit Genistein Behandlung (n = 8); verabreichen Genistein (10 mg / kg in einem Vehikel verdünnt wie polyethoxyliertes Rizinusöl) per Schlundsonde 1 Stunde vor der....

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Results

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Dieser Abschnitt enthält einige Beispiele für die qualitative und quantitative Beobachtungen 3D morphometrische Analyse hergestellt. Die vollständigen Ergebnisse aller 12 zuvor genannten Parameter finden Sie in unserer früheren Veröffentlichung 10.

Qualitative Beobachtungen

Astrozyten zeigten dünne oder dicke Äste, die in der Regel in 1-40 injizierten Ratten (Abbildung 1) lang waren. Einige kleine sternförmigen Astrozyten mi.......

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Discussion

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In der aktuellen Protokoll beschäftigten wir 3D-konfokale Morphometrie zu 12 verschiedene Parameter, die mit Astrozytenmorphologie verbunden waren zu bewerten. Hierzu Hippocampusgewebe von Ratten mit 1-40 - induziert wurden Astrogliose, mit oder ohne Vorbehandlung Genistein als entzündungshemmendes Mittel verwendet. Durch Verwendung von 3D-Bildern und morphometrische Software, waren wir in der Lage, die Wirkung von Genistein auf Astrogliose dh der Morphologie von Astrozyten zeigen.

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Disclosures

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem County Council von Östergötland, (Schweden) und der Cellular and Molecular Research Center an der Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran) unterstützt.

Acknowledgements

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amyloid beta 1-40Sigma Aldrich79793Halten in -70 ° C
GenisteinSigma Aldrich446-72-0halten in -20 ° C
polykolonale Kaninchen-Antikörper gegen saures Gliafibrilläres ProteinDAKOZ0334
alkalisches phosphatkonjugiertes Schwein Anti-Kaninchen-IgG-AntikörperDAKO
Liquid Permanent ChromogenDAKOK0640
Cremophor ELSigma Aldrich27963Polyethoxyliertes Rizinusöl - Schritt 1.1
LSM 700 Konfokale Laser-Scanning-MikroskopieCarl Zeiss
Volocity 6.3Perkin Elmer Inc.,
Bildanalyse 2000Tekno Optic
Streotaxic ApparatusStoelting
Graph Pad Prism 5Graph Pad Software Inc.
Flüssiger permanenter roter Substratpuffer DAKO K0640

References

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  1. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  2. Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55

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Astrocyte MorphologyConfocal Microscopy3D Image AnalysisVolocity SoftwareGFAP ImmunostainingFluorescence IntensityAstrocyte TerritoryNuclear VolumeBranch LengthCell Density

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