Method Article

Die Analyse der Entwicklung von Zahnkeim Innervation Mit Microfluidic Co-Kultur-Geräte

DOI:

10.3791/53114

August 14th, 2015

In This Article

Summary

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Co-Kulturen stellen eine wertvolle Methode dar, um die Wechselwirkungen zwischen Nerven und Zielgeweben und -organen zu untersuchen. Mikrofluidische Systeme ermöglichen die Co-Kultivierung von Ganglien und ganzen sich entwickelnden Organen oder Geweben in verschiedenen Kulturmedien und stellen somit ein wertvolles Werkzeug für die in vitro Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Neuronen und ihren Zielen dar.

Abstract

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Innervation spielt eine Schlüsselrolle in der Entwicklung, Homöostase und Regeneration von Organen und Geweben. Allerdings sind die Mechanismen, die diese Phänomene sind nicht gut noch verstanden. Insbesondere wird die Rolle der Innervation in der Zahnentwicklung und Regeneration vernachlässigt.

Mehrere In-vivo-Studien haben wichtige Informationen über die Muster der Innervation der Zahngewebe während der Entwicklung und Reparaturprozesse von verschiedenen Tiermodellen zur Verfügung gestellt. Allerdings sind die meisten dieser Ansätze nicht optimal, um die molekulare Grundlage der Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zielorgane und Gewebe zu markieren.

Co-Kulturen stellen eine wertvolle Methode zu untersuchen und zu manipulieren, die Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zähne in einer kontrollierten und isolierten Umgebung. In den letzten Jahrzehnten haben sich herkömmliche Co-Kulturen unter Verwendung des gleichen Kulturmediums für sehr kurze Zeiträume durchgeführt wurden (beispielsweise zwei Tage)um die anziehende oder abstoßende Wirkung der Entwicklungs Mund- und Zahngewebe an sensorischen Nervenfasern zu untersuchen. Jedoch Verlängerung der Kultivierungsperiode erforderlich, um die Auswirkungen der Innervation auf Zahn Morphogenese und Zelldifferenzierung zu untersuchen.

Mikrofluidik-Systeme ermöglichen Co-Kulturen von Neuronen und verschiedene Zelltypen in ihren geeigneten Kulturmedien. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Trigeminalganglien (TG) und die Zähne sind in der Lage, für eine lange Zeit überleben, wenn co-kultiviert in Mikrofluidvorrichtungen, und dass sie zu erhalten in diesen Bedingungen die gleiche Innervationsmuster, dass sie in vivo zeigen.

Auf dieser Basis beschreiben wir, wie zu isolieren und Co-Kultur entwickeln Trigeminalganglien und Zahnkeime in einem mikrofluidischen Co-Kultur system.This Protokoll beschreibt eine einfache und flexible Möglichkeit, Co-Kultur-Ganglien / Nerven und Zielgewebe und die Rollen zu studieren spezifischer Moleküle auf solchen Wechselwirkungen in einem controlled und isolierten Umgebung.

Introduction

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Innervation spielt eine Schlüsselrolle in der Entwicklung, Homöostase und Regeneration von Organen und Geweben, 1,2. 5 - Weiterhin ist Innervation bei der Regulation der Stammzellproliferation, Mobilisierung und Differenzierung 3 beteiligt. In der Tat, die jüngsten Studien in Geweben des orofazialen Komplexes realisiert haben gezeigt, dass parasympathischen Nerven sind für epithelialen Vorläuferzellen Funktion notwendig bei der Entwicklung und Regeneration der Speicheldrüsen 6,7. Ebenso hat sich gezeigt, dass Innervation für die Entwicklung und Wartung von Gaumen 8 notwendig - 11. Somit ist es wichtig, die noch v....

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Protocol

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Alle Mäuse wurden nach Schweizer Tierschutzgesetz und in Übereinstimmung mit den Vorschriften des kantonalen Veterinäramt, Zürich gepflegt und behandelt werden.

1. Herstellung von Dissection Material, Kultur, Medien, Mikrofluidiksysteme

  1. Autoklaven Mikrodissektion Pinzette und Schere (121 ° C, Sterilisationszeit: 20 min) und speichert sie in einem sterilen Behälter.
  2. Sterilisieren Deckgläser (24 mm x 24 mm) durch Inkubation in 1 M HCl 24 h lang auf einem Rundschüttler bei 37 ° C. Dreimal mit 99% Ethanol waschen sie mit sterilem, destilliertem H 2 O und dreimal. Dry dann die Deckgläser auf 37 ° C oder unter st....

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Results

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Diese Ergebnisse zeigen, dass isolierte Trigeminalganglien kann in einem Abteil der mikrofluidischen Vorrichtung zu wachsen, und zusätzlich, dass die Entwicklung von den isolierten Zahnanlagen ist für einen langen Zeitraum in der anderen Kammer der mikrofluidischen Vorrichtung aufrechterhalten. Verschiedenen Kulturmedien sind in den zwei Kammern verwendet, und die Mikrorillen zwischen den beiden Kammern zu ermöglichen Verlängerung der Axone vom Ganglion trigeminale gegenüber den Entwicklungszahnanlagen dar. 3

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Discussion

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Vorherige in vitro-Studien der Zahn Innervation wurden auf herkömmliche Kokulturen Trigeminalganglien und Zahngewebe oder Zellen 26,28,29 basiert. Diese Studien wurden durchgeführt, um in erster Linie untersuchen die attraktive Wirkung dieser Zellen oder Gewebe auf sensorische Axone 38. Zwar bringen bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet wurden mehrere technische Fragen aufgeworfen. Zahnkeime beginnen, nach ein paar Tagen der Kultur 37 degenerieren. Basierend auf diesen Beobacht.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgements

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Die Arbeit wurde von der Universität Zürich finanziert. Die Autoren danken Estrela Neto und Dr. Meriem Lamghari für ihre Hilfe bei der Etablierung der Bedingungen für die Kokultur.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AXIS Axon IsolationsgeräteMilliporeAX15010-TCMikrokanäle unterschiedlicher Länge sind verfügbar
LamininSigma AldrichL2020
NeurobasalGibco21103-049
B27Gibco17504
Rekombinante Maus beta-NGFR& D Systems1156-NG-100Mensch und Ratte beta-NGF (F& D Systems) entsprechen
DMEM-F12Gibco11320-033

References

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  1. Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
  2. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue,....

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Tooth Germ InnervationMicrofluidic Co cultureTrigeminal GangliaTooth Germ IsolationNeurite OutgrowthImmunofluorescence StainingLight MicroscopyCulture Medium ChangeAxonal ChambersMicro Grooves

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