Methodenartikel

Mittels konfokaler Analyse

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DOI:

10.3791/53162

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14. Dezember 2015

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1Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 2Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, 3Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 4School of Biochemistry, University of Bristol, 5Biology Department, University of York

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Manuskript hier bietet eine einfache Reihe von Methoden für die Sekretion und Verbreitung von fluoreszierend markierten Liganden in Xenopus-Analyse. Dies bietet einen Rahmen für die Prüfung der Fähigkeit von anderen Proteinen zu Ligand Verteilung ändern und erlaubt Experimente, die Einblick in die Mechanismen, die Morphogen Gradienten geben kann.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um Liganden über ein Feld von Zellen verteilt visualisieren. Die Leichtigkeit der exprimieren exogene Proteine, zusammen mit der Größe ihrer Zellen in frühen Embryonen, stellen Xenopus laevis ein nützliches Modell für die Visualisierung von GFP-markierten Liganden. Synthetischer mRNAs effizient nach der Injektion in die übersetzte frühzeitig Xenopus-Embryonen und Injektionen können auf eine einzelne Zelle gezielt werden. Wenn sie mit einer Linie Tracer wie Membranbunden RFP kombiniert werden, kann der eingespritzte Zelle (und ihre Nachkommen), die Herstellung des überexprimierten Proteins leicht verfolgt werden. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von fluoreszenzmarkierten Wnt und Shh Liganden aus injizierten mRNA. Die Verfahren die micro Dissektion der ektodermalen Explantate (animal caps) und der Analyse der Liganden Diffusion in mehreren Proben. Durch konfokale Bildgebung können Informationen über Ligand Sekretion und Diffusion über ein Feld von Zellen erhalten werden. Statistische Analysen der konfokalen Bilder liefern quantitative Daten über die Form des Liganden Steigungen. Diese Methoden können nützlich für Forscher, um die Auswirkungen der Faktoren, die die Form der Morphogen Gradienten regulieren kann testen wollen.

Einleitung

Während der frühen embryonalen Entwicklung werden die Zellen schrittweise verpflichtet, bestimmte Abstammungslinien der Differenzierung zu folgen: dies bedeutet eine Gruppe von totipotenten (oder pluripotenten Zellen) werden auf die Schaffung Populationen von Vorläuferzellen bestimmt Anlass zu einem Zelltyp geben allmählich beschränkt. Zell-Zell-Signalisierung ist von zentraler Bedeutung für die Regulierung der Linienspezifikation während der embryonalen Entwicklung. Manipulation dieser Signale wird benötigt, um Stammzellen in Richtung besonderen Schicksale lenken, neue medizinische Behandlungen zu unterstützen.

Eine relativ kleine Anzahl von Signalwegen, werden während der Entwicklung wiederholt, einschließlich Wegen als Antwort auf die TGF-Superfamilie (nodals und BMPs) 1-2, FGFs 3, Wnt 4 und 5 Igel. Diese sekretierten Proteine ​​binden an der Zellmembran, die Signaltransduktion wodurch Genexpression und / oder das Verhalten der Zelle ändern aktivieren Rezeptoren. Die enge Regulation von ZellzeichenAlling ist essentiell für Zelllinie Spezifikation und eine normale Entwicklung. Während das Übersprechen zwischen diesen Bahnen ist bei der Bestimmung des Zellschicksals wichtig ist, kann ein einzelner Ligand selbst hervorrufen unterschiedliche Reaktionen in unterschiedlichen Konzentrationen. Morphogen Gradienten wurden vor über 100 Jahren als eine Theorie zu erklären, wie verschiedene Zelltypen können aus einem Feld von Zellen 6 abzuleiten beschrieben. Signalmoleküle durch eine Gruppe von Zellen hergestellt werden, können über einen gewissen Bereich zu diffundieren, Abnahme in der Konzentration mit einem größeren Abstand von der Quelle. Zellen auf das Signal ausgesetzt wird, um die lokale Konzentration an ihrer Position in dem Bereich der Zellen entsprechen, die sich Zellen an verschiedenen Positionen unterschiedlich reagieren auf verschiedenen Ebenen des Signals. Beweise für die Existenz von Morphogenen ergeben sich aus Studien der frühen Drosophila-Embryo 7 und der Flügelscheibe 8 sowie des Vertebraten Schenkel 9 und Neuralrohr 10.

Verfahren sind in benötigtenvestigate wie Morphogen Gradienten etabliert sind und an andere Moleküle bei der Regulierung dieser Gradienten wichtig zu identifizieren. Elegante Experimente mittels Immunhistochemie auf endogenen Proteinen in vivo im Kontext von verschiedenen genetischen Hinter visualisiert wurden zur Morphogengradienten 11-12 untersuchen. , Gute Antikörpern und spezifischen Mutanten sind jedoch nicht immer zur Verfügung, so dass wir mit Überexpression von fluoreszierenden Liganden in Xenopus, um eine alternative, einfache Methode, um zu zerlegen, wie exogene Genprodukte Verteilung von Liganden, die über ein Feld von Zellen beeinflussen, bereitzustellen beschreiben hier eine Protokoll. Xenopus laevis bietet ein ausgezeichnetes System, um diese Arten von Experimenten durchzuführen, wie ihre Embryonen entwickeln, von außen, so dass sie in den frühesten Stadien zugänglich sind. Ihre Größe (1-1.5mm Durchmesser) vereinfacht die Mikroinjektion und chirurgischen Manipulation und durch Blastula Stufen die Zellen leicht zu Bild, da sie immer noch relativ groß ist (etwa 2081; m Durchmesser). Die Überexpression Studien in Xenopus sind einfach zu tun: mRNA in den frühen Embryo injiziert werden, um bestimmte Zellen gezielt und effizient umgerechnet.

Die fluoreszenzmarkierten Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP-Konstrukte wurden mit pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 und eGFP generiert. Der HA-Peptid ist wichtig, umfassen nicht nur eine zusätzliche molekulare Markierung zu schaffen, sondern auch, weil es wird angenommen, dass als Abstandshalter trennt die Wnt und eGFP-Proteinen so dass sowohl Genprodukte zu funktionieren handeln. Das zur Visualisierung von Shh verwendet Konstrukt wurde zuvor verwendet, um eine transgene Maus eine Shh-eGFP-Fusionsproteins 15 exprimieren, zu erzeugen; Dies wurde freundlicherweise von Andy McMahon zur Verfügung gestellt. Wichtig ist, dass das GFP-Tag für alle Konstrukte kloniert 3 'zur Signalsequenz, so daß sie nach der Bearbeitung beibehalten. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass die endgültige Protein enthält Sequenzen, die für Änderungen erforderlich sind, wie die addition von Lipiden, wie es der Fall für Shh und Wnt ligands.The cDNAs wurden in den pCS2 + Expressionsvektor, der für die prodution synthetischer mRNA optimiert ist subkloniert; es enthält einen SP6-Promotor und Polyadenylierungssignal (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

Die hier beschriebene Arbeit bietet ein einfaches Protokoll für den Vergleich der Sekretion und Verbreitung von fluoreszenzmarkierten Wnt und Shh getaggt Liganden. Durch Einspritzen von definierten Mengen synthetischer mRNA, umrundet das Protokoll keine Probleme mit variabler Expression aus verschiedenen Vektoren mit verschiedenen Promotoren verbunden. Diese Methoden wurden kürzlich angewendet, um die Wirkungen von Heparansulfat endosulfatase Sulf1 auf Shh-eGFP und Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP-Sekretion und Diffusion in Xenopus 16-17 untersuchen.

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Protokoll

Ethics Statement: Tierversuche wurden unter einem britischen Innenministeriums Lizenz durchgeführt, um Europaabgeordnete und den durchgeführten Versuchen wurde von der University of York Ethik-Kommission in Übereinstimmung mit dem ANKOMMEN zugelassen (Tierforschung: Meldung von In-vivo-Experimente) Richtlinien. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Strategie zur fluoreszenzmarkierten Liganden Gene

Unten ist ein Beispiel-Protokoll zur Subklonierung Wnt8a-HA und eGFP in pCS2, um zu produzieren das im Rahmen Fusionskonstrukt Wnta-HA-eGFP:

  1. Einrichten und Ausführen von PCR-Reaktionen zur Wnt8a-HA und eGFP. Verwenden des Primers Informationen in Tabelle 1 und das Beispiel PCR-Reaktion und Beispiel PCR-Bedingungen in Tabelle 2 angezeigt Hinweis angezeigt: Template DNA variiert in Abhängigkeit von dem Konstrukt produziert wird, in diesem Beispiel wird Wnt8a-HA als Matrizen-DNA verwendet.
  2. Clean up PCR-Reaktionen unter Verwendung eines Gelextraktionskit, führen abschließende Elution in 30μl Wasser molekularen Klasse.
  3. Check 2 ul des PCR-Produkts auf einem 1% Agarosegel in TAE hergestellt.
  4. Digest Wnt8a-HA und eGFP PCR-Produkte und pCS2 mit den geeigneten Restriktionsenzymen (siehe Tabelle 1), bis Reaktionen wie in Tabelle 2 (Beispiel PCR-Produkt-Digest) beschrieben.
  5. Reaktionen Inkubieren für 3 Stunden bei 37 ° C und dann Wnt8a-HA und GFP PCR-Produkte zu speichern auf Eis.
  6. Fügen Sie 1 ul alkalische Kälberdarm-Phosphatase (CAIP) bis pCS2 Digest und Inkubation für 6 min bei 37 ° C.
  7. Wärme inaktivieren CAIP durch Inkubation für 15 min bei 65 ° C.
  8. Run pCS2 und PCR verdaut auf einem 1% hochreinem Agarosegel in TAE vorbereitet.
  9. Gel-Extrakt und aufräumen pCS2 und PCR-Produkte unter Verwendung eines Gelextraktionskit, führen abschließende Elution in 30 ul Wasser molekularen Klasse.
  10. Up-Ligation wie in Tabelle 2 (Beispiel T4-Ligation) beschrieben und Inkubation bei 12 ° C für 16 Stunden.

2. mRNA-Synthese: Die Erzeugung des Template

  1. Produzieren Sie Vorlagen mit Restriktionsenzymverdau der folgenden Plasmide (alle in den Expressionsvektor pCS2): Membran-Cerulean (memCerulean), Membran-RFP (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP.
    1. Richten Sie Restriktionsverdaue wie in Tabelle 2 beschrieben (Beispiel Template zu verdauen).
    2. Vorsichtig mischen und inkubieren Sie die Reaktionen für 2 Stunden bei 37 ° C.
  2. Ausgeführt 2,5 ul verdauten Plasmid auf einem 1% Agarosegel (TAE), um zu überprüfen, dass die Reaktion vollständig geschnitten.
  3. Bereinigen Sie die Übersichten mit Hilfe eines Gelextraktionskit, führen abschließende Elution in 50 ul Wasser molekularen Klasse.

3. mRNA-Synthese: in vitro-Transkription

  1. Synthetisieren funktionelle mRNA unter Verwendung des SP6 mRNA-Transkription-Kit. Montieren Sie die Reaktionen in 1,5 ml DNAse / RNAse freien Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Up-mRNA-Transkriptionsreaktionen auf, wie in Tabelle 2 (Beispiel mRNA-Synthese) beschrieben.
  3. Mischen Sie dieReaktionen vorsichtig mit einer Pipette und dann bei 37 ° C für 4 Stunden.
  4. Kontrolle 1 ul der Reaktion auf einem 2% igen Agarosegel (TAE).
  5. 1 & mgr; l DNAse zur Reaktion vorsichtig mischen mit einem P20 und Inkubieren der Reaktion für weitere 15 min bei 37 ° C.
  6. Add 340 ul Wasser UPW 40 ul Ammoniumacetat und 400 ul Phenol-Chloroform zur Reaktions. Mischen Sie den Reaktionen für 30 Sekunden.
  7. Spin der mRNA für 5 min, 14.000 x g, 4 ° C.
  8. Pipettieren Sie die obere (wässrige) Schicht von jedem Reaktions Verschieben in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss.
  9. Ein gleiches Volumen Chloroform zu jedem der abdekantiert Reaktionen. Mischen Sie den Proben für 30 Sekunden.
  10. Spin der mRNA für 5 min, 14.000 x g, 4 ° C
  11. Pipettieren Sie die obere wässrige Schicht von jeder Reaktion der Verbringung an einen frischen 1,5 ml Schraubkappe Mikrozentrifugenröhrchen.
  12. Ein gleiches Volumen Isopropanol zu jeder der Reaktionen und auszufällen mRNA bei -80 ° C für 30 min.
  13. Spin jeder der Reaktionen für 15 Minuten bei 14.000 × g, 4 ° C, um die mRNA zu pelletisieren
  14. Entfernen Sie den Überstand kümmert sich nicht um die pelle mRNA stören
  15. Nach Zugabe von 200 ul 70% igem Ethanol zu jeder der Reaktionen, die Reaktionen zu mischen und dann zu drehen für 10 min bei 14.000 × g, 4 ° C.
  16. Entfernen Sie das Ethanol kümmert sich nicht um die mRNA zu stören, trocknen Sie das Pellet bei Raumtemperatur mit Hilfe eines Vakuumtrockenschrank oder Speed-Vac.
  17. Re-Aussetzung der mRNA in 10-20 ul Wasser molekularen Klasse. Spin kurz und halten Sie die Proben auf Eis. Anmerkung: Erwärmen der Probe auf 80 ° C für 1 min können helfen, es aufzulösen.
  18. Laufen 1 ul mRNA auf einem 2% Agarosegel (TAE) und Analyse 1,2 ul auf einem Spektrophotometer, um eine genaue Auslesung der Konzentration zu erhalten.
    Entscheidender Schritt: Eine Konzentration von 400 ng / ul synthetischer mRNA ist erforderlich, um die Durchführung der folgenden Experimente.
    Entscheidender Schritt: Wenn der 260/280-Verhältnisaußerhalb des Bereichs von 2,00 bis 2,20, oder die Gesamtmenge der mRNA als 12 & mgr; g, die Durchführung einer Lithiumchloridniederschlag.
  19. Speicher mRNA in 1 & mgr; l-Aliquots bei -80 ° C. Verwenden Aliquots und dann wegwerfen; nicht wieder eingefroren mRNA.

4. Generieren von Xenopus laevis Embryonen

  1. Prime Xenopus laevis Weibchen durch subkutane Injektion mit 50 Einheiten von menschlichem Choriongonadotropin Hormon (HCG; Chorulon) eine Woche vor dem Experiment.
  2. Induzieren Xenopus laevis-Weibchen in der Nacht vor dem Experiment durch die Injektion von 250 Einheiten HCG und Inkubation im Dunkeln, O / N bei 19 ° C.
  3. Sezieren Hoden aus euthanasiert männlichen Frosch und lagern in 1xNAM bei 4 ° C. Hinweis: Männlich Frosch wird von Terminalanästhesie in Übereinstimmung mit Anhang 1 der Tiere euthanasiert (Scientific Procedures) Act 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. Massage weiblichen Xenopus laevis, um Ovulation zu induzieren, zur Erhebung der laid Eier in eine runde Petrischale von 55 mm Durchmesser.
  5. Produzieren eine Spermiensuspension durch Zerkleinern ¼ Xenopus laevis Hoden in 1 ml VE-Wasser.
  6. Pinsel Xenopus-Oozyten mit dem zerkleinerten Spermiensuspension mit einer Pasteurpipette und Pipetten Glühlampe entscheidender Schritt:. Führen Befruchtung Reaktionen bei ca. 04.30 am Tag des Experiments.
  7. Kultur Embryonen bei 21 ° C in NAM / 10 (siehe Tabelle 3 für Lösungen) in 55 mm Petrischalen mit 1% Agarose in Wasser (Wasser) verdünnt aufgetragen.
  8. De-Gelee Embryonen nach 45 min unter Verwendung von Cystein / HCl (Tabelle 3). Anmerkung: Bei 21 ° C werden die Embryos 2-Zellen-Stadium nach 90 min erreicht und spaltet alle 20 Minuten danach.

5. Mikroinjektion von Xenopus Embryonen

  1. Unter Verwendung von 1 X 90mm Glaskapillaren und Narishige PC-10 Dual-Stage Glas-Mikropipette Puller, Mikropipetten für Injektionszwecke zu ziehen. Passen Sie die Einstellungen empirisch zu einer feinen Spitze zu erreichen (weniger als ein Mikrometer Durchter).
  2. Befestigen einer Mikropipette (Nadel) zu einem Gas Mikroinjektor (beispielsweise die Harvard Appartaus PLI-100 PICO-Injektor), wiederholt präzise Flüssigkeitsmengen zu liefern, indem eine geregelte Druck für eine digital eingestellt Zeitraum. Einstellen des pneumatischen Druck auf ein Volumen von 1,25 bis 10 Nanolitern zu liefern, wie unter Verwendung eines Retikels oder Kalibrierungsdia bestimmt.
  3. Beschichten einer 55 mm Petrischale mit 5 ml 1% Agarose (Wasser). Schneiden Sie ein 35 bis 35 mm im Quadrat aus Agarose aus dem Gericht, wird dies eine stabile Oberfläche, um Embryonen microinject.
  4. Transfer Embryonen in NAM / 3 + Ficoll (Tabelle 3) und an die Einspritz Gericht.
  5. Injizieren Embryonen im Tier Hemisphäre, sobald sie die erforderlichen Voraussetzungen für das Experiment zu erreichen.
    1. Für die Analyse der Verteilung der GFP-markierten Liganden an der Zelloberfläche, injizieren die Embryonen bilateral an den beiden Zell-Stadium 10NL pro Zelle. Beispiel mRNA Verdünnungen unten Wnt8a-HA-eGFP gezeigt. Entscheidender Schritt: Stellen Sie sicher, dass alle mRNA-Konzentrationen stTechnik bei 400 ng / ul.
      Anmerkung: Die Menge an mRNA, die injiziert werden muss, um empirisch durch Testen von Konzentrationen und Auffinden der Mindestmenge benötigt, um den fluoreszierenden Liganden visualisieren bestimmt werden. Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-HA-Antikörper ist ein wesentlicher Schritt, um zu bestimmen, dass die mRNAs auf das Niveau, um den Vergleich von zwei verschiedenen fluoreszenzmarkierten Liganden zu ermöglichen übersetzt; Wir haben dies für Wnt8a-HA-eGFP und Wnt11b-HA-eGFP in Fellgett et al., 2015 gemacht.
      Anmerkung: Bei der Beurteilung der Auswirkung eines injizierten mRNA (wie eine Codierung für einen Kandidaten-Regler) ist ein typischer Steuer um eine nicht-aktive RNA, wie beispielsweise LacZ, um auf die Auswirkungen der zusätzlichen Steuer einzuspritzen, in Geschwister Embryonen Transkripte in den Embryo.
      1. Verdünnen Sie memRFP mRNA 1: 4 (1 & mgr; + 3 ul dH 2 O) mit Wasser molekularen Grad um die Konzentration auf 100 ng / & mgr; l zu reduzieren.
      2. Verdünnen Sie Wnt8a-HA-eGFP mRNA 1: 4 (1 & mgr; + 3 ul dH2 O) mit Wasser molekularen Grad um die Konzentration auf 100 ng / & mgr; l zu reduzieren.
      3. Mischen Sie memRFP mRNA in einem Verhältnis 1: 1 mit Wnt8a-HA-eGFP mRNA.
      4. Mischungs mRNA aus 5.5.1.3 in einem Verhältnis 1: 1 entweder mit der Kontroll-mRNA LacZ oder einem Modulator, wie Sulf1.
      5. Injizieren Embryonen bilateral an der 2-Zellstadium mit 10NL von mRNA pro Zelle (insgesamt 20NL). Hinweis: Dies führt zu 250 pg m em RFP, 250 pg Wnt8a-HA- e GFP, 500 pg der Wnt11b-HA- e GFP und 2 ng LacZ oder Sulf1 mRNA, die in jede Zelle eingespritzt.
    2. Um zu analysieren, die Diffusion von GFP-markierten Liganden, zu injizieren mRNA für Ligand-GFP kodierenden zusammen mit einem Linienmarker wie memRFP am 16-32 Zell-Stadium, 1,25 nl pro Zelle.
    3. Um die Auswirkungen eines möglichen Modulators der Ligand Diffusion zu analysieren, Co-injizieren mRNA für den Modulator Codierung zusammen mit dem Liganden und Abstammung Tracer. Alternativ zu injizieren Nachbarzellen: eine mit mRNAs für die GFP-markierten ligan Codierungd und eine Linie Tracer (memRFP) und das andere mit mRNAs für den Modulator und einer anderen Linie Tracer (memCerulean) Codierung.
  6. Transfer-Embryonen zu einer 12,5 ° C-Inkubator und Kultur bis zum nächsten Tag, Nieuwkoop und Faber (NF) Stufe 8.

6. Ausschneiden Tier Kappe Explantate

  1. Transferembryonen in einer 55 mm-Petrischalen mit 5 ml 1% Agarose (Wasser) beschichtet. Füllen Sie die Schale mit NAM / 2 (Tabelle 3).
  2. Nehmen Kreis animal caps mit Tungsten Nadeln kritischer Schritt:. Nehmen Large Caps in dieser Phase, da diese zu heilen besser und leichter sein Bild, behalten die Kontrolle Kappen, um sicherzustellen, keine konvergente Extension auftritt.
  3. Übertragen Tier Explantate auf 55 mm-Petrischalen mit 1% Agarose (Wasser) und Kultur Embryos aufgetragen und bei 21 ° C für 4 Stunden kritischer Schritt. Das 4-stündiger Inkubation erforderlich ist, damit fluoreszierenden Proteinen zu reifen.
  4. Generieren Erleichterung Folien durch Kleben hinunter zwei Lagen PVC insulation Band auf Objektträgern. Schneiden Sie ein 14 mm mal 10 mm Rechteck aus der Band um eine Kammer für die Montage animal caps verlassen entscheidender Schritt:. Glätten Sie die beiden Schichten des Bandes sorgfältig auf den Objektträger vor dem Schneiden Sie das Rechteck.
  5. Pipette 2 separate Tröpfchen NAM / 2 (Tabelle 3) in den Entlastungsschieber, etwa 30 ul pro Tropfen.
  6. Bringen Tier Explantate auf den Relief Dias mit einem abgeschnitten P20 Spitze und zu orientieren, so dass der apikalen Seite nach oben zeigt. Hinweis: Jede Folie kann 10-15 animal caps halten kritischer Schritt. In diesem Stadium die animal caps sollte teilweise geheilt haben, bedeutet dies, sie sind weniger empfindlich und kann mit einer Pinzette orientieren.
  7. Senken Sie ein Deckglas auf die Entlastung Rutsche und lassen Sie das Deckglas, um für 20 Minuten trocknen entscheidender Schritt: Die Größe des Tieres Kappe ist von entscheidender Bedeutung;. sicherzustellen, die Kappe ist groß genug, dass, wenn das Deckglas wird auf die Entlastungsschieber senkte sie die apikale Schicht aus Tierkappe Zellen genug, um pr komprimiertoduce eine flache Oberfläche, die dem Bild. Wenn das Tier Kappen sind zu klein, noch dann reduzieren Sie die PVC-Band, um eine Schicht.
  8. Verschließen Sie die Folie mit Nagellack entscheidender Schritt:. Verwenden Sie nicht zu viel Nagellack, um die Entlastung Folien zu versiegeln, denn wenn die PVC-Band wird zu dämpfen, wird es wieder aufrichten und ruinieren die Rutsche.
  9. Dry Erleichterung Folien für 20 Minuten in der Dunkelheit und sie sind bereit, die dem Bild sind, in der Regel animal caps gesund für 4-6 Stunden einmal in der Folie verschlossen bleiben.

7. Imaging

Anmerkung: Bilderzeugung wurde unter Verwendung eines invertierten Konfokalmikroskop ausgeführt. Lambda-Modus wurde für die Bildgebung ausgewählt zulässig, da es mehrere Fluorophore mit überlappenden Signaturen verwendet werden, und entfernt das Problem möglicher Probenbewegung zwischen den Scans.

  1. Finden Explantate mit einer geringen Vergrößerung Ziel dann zu 63x / 1.4 Öl-Objektiv zu wechseln für höhere Auflösung Bildgebung.
  2. Schalten Sie erforderliche Laser; für dieses Beispiel die 405Laser wurde verwendet, um memCerulean anzuregen, wurde die 488-Laser verwendet werden, um GFP zu erregen und die 561 Laser memRFP mit 405 und 488/561 dichroitische Spiegel zu erregen.
  3. Verwenden Lambda-Modus (Im Zen 2011 wählen Lambda-Modus - 32 Fächer).
  4. Wählen Sie das 405nm, 488nm und 561nm lasers.To ein breiteres Sichtfeld zu ermöglichen, Verkleinern des Bildes (bis 0.6x).
  5. Stellen Sie die Bildgröße auf die gewünschte Bildgröße (1024 x 1024 mit Pixelgrößen von 220 nm wurde für diesen Datensatz verwendet wird).
  6. Set Durchschnitt typischerweise 4 bis 8, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.
  7. Optimieren Sie die Lochblende (1 luftigen Einheit gemäß der 561nm-Laser wurde für diesen Datensatz verwendet wird).
  8. Optimierung der Laserleistung kritischer Schritt. Balance der 405nm, 488nm und 561nm-Laser, so daß alle Fluorophore mit der Detektoranordnung 32 bei gleichzeitiger Minimierung der Menge an Spannung und Verstärkung benötigt detektiert werden.
  9. Sammeln Sie das Licht aus memCerulean, GFP und memRFP emittiert. Aus diesem Arbeitslicht wurde jeden gesammelten ~10 nm von 415-720nm, obwohl größere Erfassungsintervalle sind möglich (z. B. jede ~ 20 nm).

8. Bildanalyse

  1. Untersuchung der Wirkungen von Modulatoren auf die Zelloberflächenexpression von GFP-markierten Liganden,
    HINWEIS: Die folgenden Schritte sind eine detaillierte Anleitung, wie die Analyse in unserem Labor durchgeführt. Der Endanwender wünschen können, um den Prozess, indem er ein ImageJ oder FIJI-Skript, um einige der manuellen Schritte zu entfernen straffen.
    Kritischer Schritt: Es ist wichtig, die Endbenutzer-Proben werden die Spektren einer Fluorophore unter den gleichen Bedingungen, dass die endgültige Experiment um ORM wirksame Entmischung der mehreren Fluorophoren in dem letzten Experiment verwendet perf geführt eingesetzt.
    Zwei Arten der Analyse sind in diesem Abschnitt durchgeführt:
    1. Berechnung der Gesamtzahl von Wnt-HA-eGFP Pixel Co-Lokalisations mit der Zellmembran.
      1. Entmischen die grüne,Rot und cerulean Kanäle mit Spektren von einzelnen Einspritzungen dieser Fluorophore in ZEN-Software abgetastet. Speichern Sie diese Bilder als separate LSM Dokumente in alle der folgenden Schritte verwenden.
      2. Offene LSM-Dateien direkt in Bildbearbeitungssoftware. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für die Fidschi J.
      3. Speichern Sie die LSM-Bilder als Bildsequenz Dokumente, dies wird automatisch geteilt die Bilder in die einzelnen Kanäle.
      4. Speichern Sie das Bild-Sequenz in dem gleichen Ordner wie die Skripte für das Skript-Analyse-Software, die verwendet wird, um die Daten zu analysieren werden (siehe Zusatzcode-Dateien für die eigentliche Skript). Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für Matlab.
      5. Öffnen Sie den Script-Analyse-Software und öffnen Sie das Verzeichnis, in dem die Skripte geschrieben werden.
      6. Geben Sie den Dateinamen unter Standortanalyse, wird die Software den Dateinamen zu nehmen und führen Sie die Analyse.
        Hinweis: Die Dateinamen werden ImageA0000 und ImageA0001 für jeden ima lesenge. Das Skript-Analyse-Software wird das Bild verwenden markiert 0001 als Maske und zu analysieren, den Prozentsatz der Pixel im Bild 0000, das gemeinsam zu lokalisieren Mit dieser Maske.
      7. Nehmen Sie die Prozent Kolokalisation Nummer (als Zellmembran besiedelten annotiert) und kopieren Sie diese in eine Tabellenkalkulation. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für Excel.
      8. Zeichnen Sie den Prozentsatz Kolokalisation Nummer auf einem Balkendiagramm entweder als absoluter oder relativer Wert.
    2. Analysieren Sie die Anzahl, Größe und Form der Wnt-HA-eGFP puncta.
      1. Offene ungemischten LSM-Dateien direkt in Bildbearbeitungssoftware. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für Fidschi J.
      2. Split jedes Bild in seine einzelnen Kanäle (Bild> Farbe> Split-Kanäle).
      3. Threshold sowohl die Wnt-HA-eGFP und die Membranmarker Kanäle (Bild> Anpassen> Auto-Schwelle) kritischer Schritt:. Versuchen Sie, eine Reihe von Schwellenwerten zu sehen, welches ein repräsentatives Bild erzeugt, ohne eine Überbelichtungder Kanal.
      4. Konvertieren Sie die Membranmarker-Kanal zu einer Maske (Process> Binary> Make-Maske).
      5. Kehren Sie diese Maske (Bearbeiten> Invert).
      6. Konvertieren Sie die Wnt-HA-eGFP puncta zu einer Maske wie oben.
      7. Subtrahieren Sie die Membranmarker Maske vom Liganden-GFP-Maske (Process> Bild Rechner> Wnt-Maske in Top-Box, Membranmaske im unteren Kasten).
      8. Verwenden Sie die Analyse von Partikelfunktion. Von hier aus, wählen Sie die erforderlichen Parameter und die Daten (Analyse> Analyse Partikel) zu analysieren.
      9. Kopieren Sie die Anzahl der Partikel, mittlere Teilchengröße und Kreisdaten in eine Tabellenkalkulation und Diagramme zeichnen aus diesen Daten. Hinweis: Für diese Analyse werden nur Partikel zwischen 0.1-10μm 2 Größe analysiert wurden, wurden keine Einschränkungen für Kreisförmigkeit der Teilchen platziert. Diese Anleitung ist für Excel.
  2. Analyse der Palette von Liganden Diffusions
    1. Öffnen Sie alle ungemischten Bilder in konfokalen imAging-Software und exportieren Sie die Dateien in einem TIF-Format, als Rohdaten und als RGB-Bild Hinweis:.. Diese Anleitung ist für Zen lite 2011 entscheidende Schritt: Fügen Sie eine Maßstabsleiste auf mindestens eines der Bilder, so dass Entfernung kann während der Analyse berechnet.
    2. Die Bilder zu öffnen, um in der Bildanalyse-Software analysiert werden. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für Photoshop 8.2.3) mit der rechten Maustaste auf den Hintergrund des Bildes und wählen Sie "Schicht von Hintergrund ', um eine neue Ebene zu erstellen..
    3. Setzen Sie die Membranmarker Kanäle auf 0, so dass nur die Liganden-GFP-Kanal sichtbar ist (Ebene> Neue Einstellungsebene> Kanalmischer) kritischer Schritt. Clip der neue Einstellungsebene, um das Bild, die analysiert, um die Option die neue Ebene Clip zu diesem Bild ist als Kontrollkästchen nach dem Klicken auf die Option Kanal-Mixer zur Verfügung.
    4. Öffnen Sie einen neuen Arbeitsbereich. Stellen Sie die Auflösung auf 300 Pixel pro Zoll und den Farbmodus auf RGB-Farbe (Datei>New> Zwischenablage).
    5. Kopieren Sie alle Bilder in die einzelnen Arbeitsbereich analysiert (Klicken Sie auf das Bild, und es ist Kanal-Mixer, indem Steuer dann halten Sie Steuerung und Alt und ziehen Sie das Bild in den Arbeitsbereich abgeschnitten).
    6. Orientieren alle der Bilder, so dass die maximale Länge der Diffusion für jedes Bild entlang der horizontalen Achse gemessen werden, wobei die Zellen, die Wnt-HA-eGFP nach links orientiert.
    7. Speichern Sie die Arbeitsfläche als TIF und öffnen Sie diese in der Bildanalyse-Software. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für die Fidschi J.
    8. Öffnen Sie den ROI-Manager-Fenster (Analyse> Tools> ROI-Manager).
    9. Zeichnen Sie ein Rechteck auf das erste Bild, kann die genaue Größe des Rechtecks ​​festgelegt werden (Wählen Sie Rechteck-Werkzeug und ziehen Sie jede Rechteck> Bearbeiten> Auswahl> angeben). Anmerkung: Eine Größe von 650 x 100 Pixel Länge × Breite wurde in dieser Studie verwendet.
    10. Positionieren Sie das Rechteck auf dem Rand des Domain-exprimierenden Wnt-HA-eGFP. Legen Sie das Rechteck über den Bereich mit der maximalen Entfernung von Wnt-HA-eGFP Diffusion. Entscheidender Schritt: Auch ohne die Membranmarker die Regionen Wnt-HA- e GFP-exprimierenden sichtbar sein soll aufgrund der Hintergrundfluoreszenz; wenn nicht, dann wenden Sie RAW-Bilder.
    11. Verschieben das Feld 10 & mgr; M auf der rechten Seite. Bestimmen Sie die Anzahl der Mikrometer durch Messung der Länge der Maßstabsleiste in einem der Bilder enthalten (Zeichnen Sie eine Linie Rückverfolgung der Maßstabsleiste> Analyse> gesetzt Skala). Hinweis: Diese stellt einen Wert für 10 uM in Pixel.
    12. Fügen Sie die Box auf der ROI-Manager, indem Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen in ROI-Manager-Fenster.
    13. Verschieben Rechteck zum nächsten Bild, indem Sie wieder auf dem Rechteck-Werkzeug, um das Rechteck bewegen, gemessen werden. Wiederholen Sie die Schritte 8.2.10-11.
    14. Sobald alle Platten gemessen worden sind, wählen Sie Multiplot aus dem ROI-Manager-Menü (ROI-Manager> Mehr> Multiplot> Liste).
      Hinweis: Die Daten repräsentieren Wnt Pixel intensity (Y) mit zunehmendem Abstand entlang der horizontalen Achse (X, gemessen in Pixel). Der Wert für Y ist die mittlere Signalintensität eines Liganden-GFP am Punkt X und der Mittelwert wird aus allen der Pixel in der Y-Achse für jeden X-Wert berechnet. Folglich ist die größere der Kasten, desto mehr Pixel werden analysiert, um diesen Mittelwert zu erzeugen. Ein kleines Feld (in der Y-Achse) wird verrauschter; ein großer Kasten werden sehr niedrige Durchschnittspixelintensität haben.
    15. Kopieren Sie die Daten vom Multidiagrammfeld in eine Tabellenkalkulation und re-Label entsprechend. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für Excel.
    16. Entsorgen Sie die ersten 10-20 um von Daten von jeder Analyse wie dies stellt Hintergrundfluoreszenz von Ligand-GFP-exprimierenden Zellen und verzerrt die Graphen.
    17. Öffnen Sie die wissenschaftliche Analyse und Grafik-Software und erstellen Sie ein neues Notebook. Hinweis: Die folgenden Anweisungen gelten für Sigmaplot 13.
    18. Beschriften Sie die erforderliche Anzahl der Spalten für die Daten durch einen Doppelklick auf den horizontalen Nummern on das Arbeitsblatt und Kennzeichnung ihnen Abstand in um, Wnt8a-HA-eGFP und Wnt11b-HA-eGFP.
    19. Kopieren Sie Daten aus der Tabellenkalkulation in die entsprechenden Spalten in der wissenschaftlichen Analyse und Grafik-Software.
    20. Erstellen Sie ein Streudiagramm (Create Graph> Scatter> Multiple Streu> Wählen X viele Y> Wählen Sie den Abstand Spalte für X> Select Wnt8a-HA-eGFP und Wnt11b-HA-eGFP für die Y-Werte> Finish).
    21. Führen Regressionsanalyse auf Wnt8a-HA-eGFP-Kurve mit der linken Maustaste auf eine Wnt8a-HA-eGFP Punkt auf dem Streudiagramm. Alle Punkte sind hervorzuheben. Klicken Sie auf Analyse> Regression Assistenten.
    22. Wählen Sie die Kurvengleichung Kategorie (exponentiellen Abfall) und die Gleichung Name (Einzel, 3 Parameter) und drücken Sie dann auf Weiter.
    23. Wählen Sie die X- und Y-Werte in dem die Kurve sollte montiert werden (wenn die Daten zuvor hervorgehoben, sollte dies automatisch durchgeführt werden) und drücken Sie dann auf Weiter.
    24. Fahren Sie mit dem Assistenten, bis die numerische Ausgabe-OptionSeite, sicherzustellen, "Bericht erstellen" wird dann angekreuzt Sie auf Weiter. Hinweis: Die Parameter für die angepasste Kurve wird im Report 1 angezeigt *.
    25. Auf der Graph-Optionen Seite zu gewährleisten 'hinzuzufügen Gleichung Titel grafisch' wird dann angekreuzt drücken Abgang. Hinweis: Der Assistent Report 1 * und Grafik 1 * Registerkarten am oberen Rand des Notizbuch erstellt haben. Zusätzlich wird die Kurve zu der in (8.2.20) erzeugten Graphen hinzugefügt wurden.
    26. Wiederholen Sie die Schritte 8.2.21-8.2.25, um eine Kurve für Wnt11b-HA-eGFP passen entscheidender Schritt:. Versuchen, mehrere Pass Gleichung Kategorien und Gleichung Namen auf die Daten. Hinweis: Die Kurve mit der besten Passform sollte den höchsten R 2 Wert mit der geringsten Restquadratsumme zu erzeugen.

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Ergebnisse

Konfokale Analyse animal cap Explantate exprimieren fluoreszent markierte Proteine ​​bietet ein wirksames System zur Visualisierung Ligand Verteilung unter unterschiedlichen Versuchsbedingungen. In einem Beispiel kann die Verteilung von GFP-markierte Shh dargestellt (Abbildung 1). In 2-Zellen-Stadium werden Xenopus-Embryonen in die beiden Zellen, die entweder mit einem Kontroll-mRNA oder mRNA, die für Sulf1, ein Enzym, das die Zelloberflächen Heparansulfat verändert und beeinflusst die Shh Morp...

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Diskussion

Ein wesentlicher Teil dieses Protokolls erzeugt biologisch aktiven Liganden, die normalerweise bearbeitet werden, ausgeschieden wird, und fähig sind, eine Antwort in der Aufnahmezelle auslösen kann, obwohl sie eine fluoreszierende Gruppe gebunden. Es kritisch ist, nachzuweisen, dass das fluoreszenzmarkierte Genprodukt ist biologisch aktiv unter Verwendung eines geeigneten Assays. Für Shh-GFP wurde die Fähigkeit, die Expression von ptc1 aktivieren 16 bestätigt. Wnt8a hat eine bemerkenswert starke Fähi...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von einem BBSRC finanziert gewähren MdEP (BB / H010297 / 1), ein BBSRC Quoten studentship zu SAR und einen MRC studentship zu SWF.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseMelfordMB 1200
AmmoniumacetatAmbionaus Megascript SP6 Kit AM 1330
BicarbonatVWR InternationalRC-091
CalciumnitratSigmaC13961
Kappe analog (m7G(5'))AppliedBiosystemsAM 8050
ChloroformSigmaC 2432
L-Cysteinhydrochlorid-MonohydratSigmaC7880
dNTPsInvitrogen18427-013
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)SigmaO3690
EthanolVWR International20821.33
Ficoll 400SigmaF 4375
Fidschi image J softwareKostenloser Download http://fiji.sc/Fiji
GentamycinMelfordG 0124
EisessigFisher ScientificA/0400/PB17
Glasabdeckgläser, Nr.1.5 Wissenschaftlicher Laborbedarf22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
GlasnadelabzieherNarishigeNarishige PC -10
GlaszugnadelnDrummond Scientific3-000-203-G/X
Humanes chronisches Gonadotropin (HCG)Intervet
IsopropanolFisher ScientificP/7500/PB17
Lithiumchlorid (LiCl)SigmaL-7026
LSM710 und Zen-Software (2008-2010)Carl Zeiss
Matlab-SoftwareMathworkshttp://uk.mathworks.com/
Wasser in molekularer Qualität Fisher ScientificBP 2819-10
Nagellack StiefelBarcode 3600530 373048
SpektralphotometerLab.tech InternationalND-1000 / ND8000
Petrischale (55 mm)VWR International391-0865
Phenol-ChloroformSigmaP3803
Photoshop SoftwareAdobehttp://www.photoshop.com/products
High Fidelity DNA-Polymerase und Puffer BiolabsM0530S  Puffer - M0531S
Kaliumchlorid (KCl)Fisher ScientificP/4280/53
PVC-IsolierbandOnecallSH5006MPK
Gel-Extraktionskit QiagenS28704
RestriktionsenzympufferRocheSuRE/CUT Puffer Set 11082 035 001
RNAse-freie DNAsePromegaME10A
Einschneidige Klingen mit StahlrückenPersonna66-0403-0000
Natriumchlorid (NaCl)Fisher Scientific27810.364
SP6 TranskriptionskitAmbionAM1330
GlasobjektträgerThermo FisherSHE 2505
Tris BasisInvitrogen15504-020
Wolframnadelnhausgemacht
Zen lite SoftwareCarl ZeissKostenloser Download  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

Referenzen

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KonfokalmikroskopieLigandendiffusionFluoreszenzmarkierungWnt LigandenShh LigandenMikrodissektionTierkappenBildanalyse

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