Mittels konfokaler Analyse

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, die Sekretion und Diffusion fluoreszenzmarkierter Liganden in einem intakten Epithel mithilfe der Expression in xip pos lavis sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Entstehung von Morphogen-Gradienten zu beantworten, die als entscheidend für die Festlegung von Zelllinien während der frühen embryonalen Entwicklung bekannt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache Methode zur Visualisierung der Ligandenverteilung in einem intakten Epithel darstellt.

Ein wesentlicher Bestandteil des Protokolls ist die Erzeugung biologisch aktiver Liganden, die normal verarbeitet und sezerniert werden und trotz eines angehängten fluoreszierenden Markers in empfangenden Zellen eine Reaktion hervorrufen können. Die konfokale Mikroskopie ist eine ideale Methode, um die Lokalisation fluoreszenzmarkierter Proteine in dreidimensionalen Geweben mithilfe unabhängiger Laser und Detektoren zu untersuchen, was eine saubere Analyse innerhalb dieser komplexen Gewebetypen ermöglicht und robuste Daten liefert. Nachdem mRNA-Beschichtungen für fluoreszenzmarkierte Liganden hergestellt und XUS lavis-Embryonen gemäß dem schriftlichen Protokoll beschafft wurden, injizieren Sie die mRNA zusammen mit einem Linienstamm-Marker wie membranständigem RFP in eine einzelne Zelle im 16- bis 32-Zell-Stadium; gegebenenfalls kann ein Modulator gemeinsam mit einem fluoreszierenden Liganden und dem Linienstamm-Marker injiziert werden, um dessen Wirkung zu analysieren.

Manchmal ist es ebenfalls nützlich, eine benachbarte Zelle zu injizieren. Hier wird eine zweite Zelle neben der zuvor injizierten Zelle injiziert. Eine Zelle wird mit mRNA injiziert, die für den GFP-markierten Liganden und einen Linienstammdetektor wie membrangebundenes RFP kodiert, während die andere Zelle mit mRNA injiziert wird, die für den Modulator und einen anderen Linienstammdetektor wie membrangebundenes Cerulean kodiert. Überführen Sie die Embryonen in einen Inkubator mit 12,5 Grad Celsius und kultivieren Sie sie bis zum neuen Gehege. Im Faber-Stadium acht, am folgenden Tag, wenn die Embryonen das Stadium acht erreicht haben, füllen Sie mit 1 % Aros beschichtete Schalen mit NAM zwei und überführen Sie die Embryonen mithilfe einer abgeschnittenen Glaspipette unter Verwendung von Wolframnadeln.

Schneiden Sie die kreisförmigen Explanten vom Animalpol injizierter und unbehandelter Embryonen aus, wobei darauf geachtet werden muss, keinen Mesodermtransfer zu übertragen. Überführen Sie die Animal-Explanten in 55 mm große Petrischalen, die mit 1 % Agar beschichtet sind, und kultivieren Sie die Embryonen vier Stunden lang. Lassen Sie die fluoreszierenden Proteine zur Reifung anstehen, um Kontrast zu erzeugen. Für die Objektträger bringen Sie zwei Schichten PVC-Isolierband auf Mikroskop-Objektträgern auf und glätten diese vollständig.

Schneiden Sie ein 14 mal 10 Millimeter großes Rechteck aus dem Klebeband für die Montage der Tierkappen aus. Geben Sie anschließend zwei separate Tropfen NM zwei auf die Vertiefungsscheibe. Übertragen Sie dann mit einer abgeschnittenen P-20-Spitze bis zu 15 Tierexplants auf jede Scheibe und richten Sie die X-Explants mit einer Pinzette so aus, dass die apikale Seite nach oben zeigt.

Unter Verwendung eines Diamantschneiders eine Glasdeckenscheibe anritzen und brechen, um eine kleinere Deckenscheibe herzustellen. Um die Reliefpräparatscheibe passend abzudecken, die Glasdeckenscheibe vorsichtig mit einer gebogenen Nadel der Größe 19 auf die Reliefpräparatscheibe senken. Dadurch wird die apikale Schicht der Animal-Cap-Zellen komprimiert.

Die Objektträger mit Nagellack verschließen und 20 Minuten im Dunkeln trocknen lassen; die Aufnahmen sollten innerhalb von vier bis sechs Stunden angefertigt werden. Um gesunde Animal Caps sicherzustellen, müssen diese korrekt ausgerichtet in den maßgeschneiderten Objektträgern und Deckgläsern platziert werden. Vorsichtig auf die Objektträger auftragen.

Es ist wichtig, nicht zu viel Nagellack zum Versiegeln der Objektträger zu verwenden, da dies dazu führen würde, dass der Klebestreifen wellt und später die Dichtung des Objektträgers beschädigt. Wenn Sie es einmal beherrschen, müssen Sie etwa 25 Embryonen injizieren, um pro gewünschter Bedingung 20 gute tierische Kapselfragmente zu erhalten. Diese können dann am folgenden Tag mittels konfokaler Mikroskopie analysiert werden.

Verwenden Sie zur Durchführung der Bildgebung ein Objektiv mit niedriger Vergrößerung, um X explan zu finden. Wechseln Sie dann zu einem 63 x 1,4 Öl-Objektiv für die hochauflösende Bildgebung. Schalten Sie die erforderlichen Laser ein, einschließlich 405 für MIAN, 488 für GFP und 561.

Optimieren Sie bei MRFP die Laserleistungen so, dass alle Fluorofore detektiert werden können. Verwenden Sie dabei das 32-Detektor-Array und minimieren Sie die benötigte Spannung und Verstärkung. Danach schalten Sie in den Lambda-Modus und wählen die Laser mit 405, 488 und 561 Nanometer. Um ein größeres Bildfeld zu ermöglichen, zoomen Sie das Bild auf 0,6× aus.

Als Nächstes die Bildgröße auf die gewünschte Bildgröße einstellen. Dies bietet eine ausreichende Auflösung für die Analyse, wobei der Mittelwert aus vier bis acht Aufnahmen gebildet wird, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen und die Lochblende für diesen Datensatz zu optimieren. Eine Flächeneinheit gemäß dem 561 Nanometer Laser wurde unter Verwendung von 405 und 4 88 5 61 verwendet.

Diic-Spiegel sammeln das von der Membran Saru, GFP und der Membran RFP emittierte Licht. In diesem Experiment wurde das Licht im Bereich von 415 bis 720 Nanometern in etwa alle 10 Nanometer gesammelt. Führen Sie die Bildanalyse gemäß dem hier dargestellten Textprotokoll durch. Die Verteilung von mit GFP markiertem Sonic Hedgehog in einem Animal Cap X-Explant unter Kontrollbedingungen zeigt, dass Sonic Hedgehog GFP sekretiert wird und außerhalb des Bereichs, der die injizierten mRNAs exprimiert, diffundiert.

Jedoch ist bei Anwesenheit des Modulators SULF1 die Verteilung von Sonic-Hedgehog-GFP stärker eingeschränkt. In dieser Probe sind nur wenige Foci von Sonic-Hedgehog-GFP in geringem Abstand von dem Zellklon, der es produziert, sichtbar. Diese Abbildung zeigt die Charakterisierung zweier fluoreszenzmarkierter Wnt-Liganden, die wie hier angegeben in Zellen injiziert wurden; sowohl Wnt8A als auch Wnt11B-HA-EGFP reichern sich an der Membran von Animal-Cap-Zellen an, wobei sich Wnt8A-HA-EGFP effizienter anreichert als Wnt11B. Diese Abbildung zeigt die Verteilung von Wnt8A-HA-EGFP, das in einem Zellklon exprimiert wird, der mit einem membrangebundenen Cerulean markiert ist.

Man sieht, wie der fluoreszenzmarkierte Ligand sich von den Quellzellen wegbewegt und in die umliegenden Zellen des Epithels eindringt. Zur Auswertung der Verteilung fluoreszenzmarkierter Wind-Liganden in mehreren experimentellen Proben, wie hier gezeigt, wird Bildanalyse-Software verwendet. Der Abstand von der memSaru-exprimierenden Klon und die Stärke der GFP-Fluoreszenz werden gemessen, um die Reichweite der Wind-Diffusion sowie die Form des Gradienten zu bestimmen.

Nach der Messung der Verteilung eines Liganden kann die Aktivität eines Signalwegs ebenfalls bewertet werden, indem dieses Protokoll mit einem weiteren Assay kombiniert wird, um die Reaktion der empfangenden Zellen zu überwachen. Auf diese Weise können Sie versuchen, den Schwellenbereich eines Morphogens zu bestimmen.