Mittels konfokaler Analyse Xenopus laevis Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

Das Manuskript hier bietet eine einfache Reihe von Methoden für die Sekretion und Verbreitung von fluoreszierend markierten Liganden in Xenopus-Analyse. Dies bietet einen Rahmen für die Prüfung der Fähigkeit von anderen Proteinen zu Ligand Verteilung ändern und erlaubt Experimente, die Einblick in die Mechanismen, die Morphogen Gradienten geben kann.

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die Sekretion und Diffusion von fluoreszenzmarkierten Liganden in einem intakten Epithel durch Expression in xip pos lavis sichtbar zu machen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zur Etablierung von Morpho in Gradienten zu beantworten, von denen bekannt ist, dass sie für die Spezifizierung von Zelllinien während der frühen Embryonalentwicklung unerlässlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine einfache Methode handelt, um die Ligandenverteilung in einem intakten Epithel sichtbar zu machen.

Ein wesentlicher Teil des Protokolls ist die Erzeugung biologisch aktiver Liganden, die normalerweise verarbeitet und sezerniert werden und in der Lage sind, eine Reaktion in den Empfängerzellen hervorzurufen, obwohl sie mit einem Fluoreszenz-Tag versehen sind. Die konfokale Mikroskopie ist eine ideale Möglichkeit, die Lokalisierung von fluoreszierend markierten Proteinen in dreidimensionalen Geweben zu untersuchen. Die unabhängigen Laser und Detektoren ermöglichen eine saubere Analyse innerhalb dieser komplexen Gewebetypen und ermöglichen die Erfassung robuster Daten. Nach der Erzeugung einer mRNA-Beschichtung für fluoreszenzmarkierte Liganden und der Gewinnung von XUS-Lavis-Embryonen gemäß dem schriftlichen Protokoll wird die mRNA zusammen mit einem Lineage-Tracer wie Membran RFP in eine einzelne Zelle im Zellstadium von 16 bis 32 injiziert, falls gewünscht, ein Modulator kann mit einem fluoreszierenden Liganden und dem Lineage-Marker co-injiziert werden, um seine Wirkungen zu analysieren.

Manchmal ist es sinnvoll, auch eine benachbarte Zelle zu injizieren. Hier wird eine zweite Zelle neben der zuvor injizierten Zelle injiziert. Eine Zelle wird mit mRNAs injiziert, die für den GFP-markierten Liganden und einen Linientracer wie Membran RFP kodieren, während der anderen Zelle mRNAs injiziert werden, die für den Modulator kodieren, und ein anderer Tracer, wie z. B. Membran-Coelin-Embryonen, die in einen 12,5 Grad Celsius heißen Inkubator und die Kultur in einen neuen Koop übertragen werden. Im Faber-Stadium acht füllt man am folgenden Tag, wenn die Embryonen das achte Stadium erreicht haben, die mit 1%aros beschichteten Schalen mit NAM zwei und überträgt die Embryonen mit einer abgeschnittenen Glaspipette unter Verwendung von Wolframnadeln.

Präparieren Sie kreisförmige Explan vom tierischen Pol der injizierten und kontrollierten Embryonen und achten Sie darauf, dass keine Mesoderm-Transfer von Tierexplan in 55-Millimeter-Petrischalen eingenommen wird, die mit 1%aros beschichtet sind, und kultivieren Sie Embryonen für vier Stunden. Damit die fluoreszierenden Proteine reifen können, um Linderung zu erzeugen. Objektträger werden mit zwei Schichten PVC-Isolierband auf die Objektträger aufgebracht und vollständig abgeflacht.

Schneiden Sie aus dem Klebeband ein 14 x 10 Millimeter großes Rechteck für die Montage von Tierkappen aus. Pipettieren Sie anschließend zwei separate Tröpfchen NM zwei in den Reliefschieber. Übertragen Sie dann mit einer abgeschnittenen P 20-Spitze bis zu 15 Tierexplanate auf jeden Objektträger und richten Sie die X-Explantate mit einer Pinzette so aus, dass die apikale Seite nach oben zeigt.

Ritzen Sie mit einem Diamantstift einen Deckzettel aus Glas und brechen Sie ihn, um einen kleineren Deckschirm zu erstellen. Um den Reliefschieber zu montieren, senken Sie einen Glasdeckel vorsichtig mit einer gebogenen 19-Gauge-Nadel auf den Reliefschieber ab. Komprimierung der apikalen Schicht von tierischen Kappenzellen.

Verwenden Sie Nagellack, um das Objektträger 20 Minuten lang im Dunkeln trocken zu versiegeln und innerhalb von vier bis sechs Stunden abzubilden. Um gesunde Tierkappen zu gewährleisten, müssen Tierkappen in den benutzerdefinierten Folien und dann auf den Deckblättern korrekt ausgerichtet werden. Vorsichtig auf die Objektträger laden.

Es ist wichtig, nicht zu viel Nagellack zu verwenden, um die Objektträger zu versiegeln, da dies dazu führt, dass das Klebeband knittert und die Versiegelung auf dem Objektträger später bricht. Sobald Sie es gemeistert haben, müssen Sie etwa 25 Embryonen injizieren, um 20 gute Tierkappen pro Bedingung zu nehmen, an der Sie interessiert sind. Diese können dann am Folgetag mittels konfokaler Mikroskopie analysiert werden.

Verwenden Sie zum Fotografieren ein Objektiv mit geringer Vergrößerung, um X explan zu finden. Wechseln Sie dann zu einem 63 x 1,4 Ölobjektiv für Bildgebung mit höherer Auflösung. Schalten Sie die erforderlichen Laser ein, darunter 405 für MIAN, 488 für GFP und 561.

Optimieren Sie für MRFP die Laserleistung, sodass alle Fluorvieren erkannt werden können. Verwenden Sie das 32-Detektor-Array bei gleichzeitiger Minimierung der erforderlichen Spannung und Verstärkung, verwenden Sie dann den Lambda-Modus und wählen Sie die 405-Nanometer-, 488- und 561-Nanometer-Laser aus. Um ein breiteres Sichtfeld zu ermöglichen, verkleinern Sie das Bild auf 0,6 x.

Stellen Sie als Nächstes die Rahmengröße auf die gewünschte Bildgröße ein. Dies bietet eine ausreichende Auflösung für den Analysesatz mit einem Mittelwert von vier bis acht, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen und die Lochblende für diesen Datensatz zu optimieren. Eine Flächeneinheit entsprechend dem 561-Nanometer-Laser wurde mit 405 und 4 88 5 61 verwendet.

Diic-Spiegel sammeln das Licht, das von Membran Saru, GFP und Membran RFP emittiert wird. In diesem Experiment wurde etwa alle 10 Nanometer Licht von 415 bis 720 Nanometern gesammelt. Führen Sie eine Bildanalyse gemäß dem hier gezeigten Textprotokoll durch, das die Verteilung von GFP tagged sonic hedgehog in einem Tier cab X unter kontrollierten Bedingungen extributiert, sonic hedgehog GFP wird sezerniert und diffundiert außerhalb der Region, die die injizierten mRNAs exprimiert.

In Gegenwart des Modulators SULF one ist Sonic Hedgehog GFP jedoch in seiner Verteilung eingeschränkter. Und in dieser Probe sind nur wenige Herde von sonic Hedgehog GFP in kurzer Entfernung von dem Klon der Zellen zu sehen, die es produzieren. Diese Abbildung zeigt die Charakterisierung von zwei fluoreszenzmarkierten Liganden, die in Zellen injiziert wurden, wie hier angedeutet, sowohl Wind acht A als auch win 11 B-H-A-E-G-F-P akkumulieren auf der Membran von tierischen Kappenzellen, wobei Gewinn acht A-H-A-E-G-F-P effizienter akkumuliert als Wind 11 B. Diese Abbildung zeigt die Verteilung des Windes acht A-H-A-E-G-F-P, exprimiert in einem Klon von Zellen, die mit membrangebundenem Coelinblau markiert sind.

Es ist zu beobachten, dass der fluoreszenzmarkierte Ligand von den Quellzellen weg und in die umgebenden Zellen des Epithels diffundiert. Bildanalysesoftware wird verwendet, um Daten über die Verteilung von fluoreszenzmarkierten Windliganden in mehreren experimentellen Proben zu extrahieren, wie hier gezeigt. Der Abstand vom Mem-Saru-exprimierenden Klon und das Niveau der GFP-Fluoreszenz werden gemessen, um den Bereich der Winddiffusion und die Form des Gradienten zu bestimmen.

Nach der Messung der Verteilung eines Liganden kann auch die Ausgabe eines Signalwegs bewertet werden, indem dieses Protokoll mit einem anderen Assay kombiniert wird, um die Reaktion der empfangenden Zellen zu überwachen. Und auf diese Weise können Sie versuchen, den Schwellenwert von am Morphogen zu bestimmen.