Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca 2+ Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt das detaillierte Protokoll und Anlagen für die duale optische Abbildung von Transmembranpotential (V _m) und freie inner Retikulum (SR) notwendig ^Ca 2+ in der Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von V _m und SR ^Ca 2+ Dynamik im intakten Herzens.

Zusammenfassung

Sarkoplasmatisches Retikulum (SR) Die Behandlung von Ca²⁺ spielt eine Schlüsselrolle bei der normalen Erregungs-Kontraktions-Kopplung und es ist bekannt, dass die aberrante SR^Ca2+-Handhabung eine bedeutende Rolle bei bestimmten Arten von Arrhythmien spielt. Da es sich bei Arrhythmien um räumlich unterschiedliche, emergente Phänomene handelt, müssen sie auf Gewebeebene untersucht werden. Die Methoden zur direkten Sondierung von SR Ca²⁺ im intakten Herzen sind jedoch nach wie vor begrenzt. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die duale optische Kartierung des Transmembranpotentials (V_m) und des freien intra-SR [Ca²⁺] ([Ca²⁺]_SR) im Langendorff-perfundierten Kaninchenherz. Dieser Ansatz nutzt die Vorteile des niedrig affinen Ca2⁺-Indikators Fluo-5N, der im Zytosol eine minimale Fluoreszenz aufweist, während intrazelluläres [Ca²⁺] ([Ca²⁺]_i) relativ niedrig ist, aber eine signifikante Fluoreszenz im SR-Lumen aufweist, wo [Ca²⁺]_SR im millimolaren Bereich liegt. Neben der räumlichen Darstellung der SR Ca²⁺-Eigenschaften über die epikardiale Oberfläche des Herzens hat dieser Ansatz den entscheidenden Vorteil der gleichzeitigen Überwachung von V_m, was Untersuchungen der bidirektionalen Beziehung zwischen V_m und SR Ca²⁺ und der Rolle von SR Ca²⁺ bei arrhythmogenen Phänomenen ermöglicht.

Einleitung

Duale optische Kartierung des intrazellulären Ca2⁺- und Transmembranpotentials (V_m) im intakten Langendorff-perfundierten Herzen ist zu einer Hauptstütze der Untersuchungen in der kardialen Elektrophysiologie geworden, einschließlich der Mechanismen der Arrhythmie und der Erregungs-Kontraktions-Kopplung^1-4. Dieser Ansatz hat beispiellose Erkenntnisse über die normale und abnormale Elektrophysiologie und, was wichtig ist, über die bidirektionale Beziehung zwischen V_m und intrazellulärem Ca²⁺ geliefert. Die optische Kartierung von intrazellulärem Ca2⁺ mit hochaffinen Fluoreszenzindikatoren (wie Rhod-2 und Fluo-4) berichtet jedoch nur über Massenänderungen in intrazellulärem Ca2⁺ und ist nicht in der Lage zu unterscheiden, ob diese Veränderungen auf den Transmembran-Ca2⁺-Fluss, die Freisetzung und die Wiederaufnahme in intrazelluläre Speicher oder in den meisten Fällen auf eine Kombination aus beidem zurückzuführen sind. Darüber hinaus weisen hochaffine Ca2⁺-Indikatoren eine langsame Ein-Aus-Kinetik auf und berichten möglicherweise nicht genau über schnelle Änderungen der Ca2⁺-Konzentration⁵.

Jedes Aktionspotential löst einen Anstieg des intrazellulären Ca²⁺ Transienten (CaT) aus, der als intrazelluläres Ca²⁺ Transient (CaT) bekannt ist. Im Säugetierherz sind etwa 70 – 90 % des gesamten CaT auf die Freisetzung von Ca2⁺ aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) über die Öffnung von Ryanodinrezeptoren (RyRs)⁶ zurückzuführen. Innerhalb des SR ist etwa die Hälfte des gesamten Ca2⁺-Gehalts an Calsequestrin (CSQ) und andere Intra-SR-Puffer^{gebunden 7}, die eine wichtige Rolle bei der SR-Ca2⁺-Homöostase spielen^8,9. Die Menge an freiem SR Ca²⁺ bestimmt die treibende Kraft für die Freisetzung von SR Ca²⁺ sowie das Gating von RyR und hat daher einen signifikanten Einfluss auf das intrazelluläre CaT. Darüber hinaus können Veränderungen der SR Ca²⁺-Freisetzung oder -Wiederaufnahme wiederum über den elektrogenen Na⁺-Ca2⁺-Austausch_Vm beeinflussen, was arrhythmogene Folgen haben kann. Daher kann neben dem CaT auch das Monitoring des freien SR Ca²⁺ wichtige Erkenntnisse über kontraktile und elektrophysiologische Dysfunktionen liefern.

In den letzten Jahren haben Forscher signifikante Fortschritte bei der Überwachung von SR Ca²⁺ in isolierten Herzmyozyten und von einer einzigen Stelle am intakten Herzen gemacht. Eine solche Methode erfordert schnelle Koffeinimpulse, um RyRs zu öffnen, und der SR Ca²⁺-Gehalt wird dann aus dem unmittelbaren Anstieg des intrazellulären Ca2⁺¹⁰ abgeleitet oder berechnet. Ein weiterer faszinierender Ansatz verwendet Ca²⁺-Indikatoren mit geringer Affinität, wie z. B. Fluo-5N¹¹ oder Mag-Fluo4¹², die an freies SR Ca²⁺ binden. Diese Indikatoren weisen Dissoziationskonstanten (K_d) im Bereich von 10 – 400 μM auf und weisen daher eine minimale Fluoreszenz im Zytosol auf, verglichen mit dem SR-Lumen, wo die Ca2⁺-Konzentration ([Ca2⁺]_SR) im millimolaren Bereich liegt. Unter Verwendung von niedrig affinen Ca2⁺-Indikatoren wurden verschiedene Aspekte des SR Ca2⁺-Zyklus auf der Ebene der isolierten Myozyten untersucht, einschließlich der fraktionierten SR^Ca2+-Freisetzung und der Mechanismen von Ca2⁺-Alternans^13,14. Um jedoch die heterogene Natur des SR Ca²⁺-Zyklus im intakten Herzen und die Rolle von SR Ca²⁺ bei räumlich unterschiedlichen arrhythmischen Phänomenen vollständig zu verstehen, sind Methoden zur Abbildung von SR Ca²⁺ über die Epikardoberfläche des intakten Herzens erforderlich¹⁵.

Dieser Artikel beschreibt die Methodik für die duale optische Kartierung von freiem SR Ca²⁺ und V_m im intakten Langendorff-perfundierten Kaninchenherz mit dem niedrigaffinen Ca2⁺-Indikator Fluo-5N. Neben der räumlichen Darstellung der SR Ca²⁺-Eigenschaften über die Epikardoberfläche des Herzens hat dieser Ansatz den Vorteil der gleichzeitigen Überwachung von V_m, was eine Untersuchung der bidirektionalen Beziehung zwischen V_m und SR Ca²⁺ ermöglicht.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Animal Care und Verwenden Committee der University of California, Davis zugelassen und auf den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die National Institutes of Health veröffentlicht geklebt.

1. Vorbereitung

1. Bereiten Sie zwei konzentriert (25x) Aktien von modifizierten Tyrode-Lösung im Voraus und bei 4 ° C: (1) Auf I (in mM: NaCl 3205, CaCl ₂ 32,5, KCl 117,5, _NaH 2 PO 4 29.75, MgCl ₂ 26.25) und (2) Stock II (in mM: NaHCO ₃ 500).
   1. Frisch herzustellen 2 l Tyrode-Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mM): NaCl 128,2, CaCl ₂ 1,3, KCl 4,7, MgCl ₂ 1.05, NaH _{2 PO 4} 1,19, NaHCO _{3 20} und Glucose 11,1 durch Kombination von 1840 ml entionisiertem (DI) Wasser, 80 ml Lizenz I, 80 ml Lizenz II und 4 g Glucose. Nicht direkt Mischung Stock I und Vektor II; hinzufügenm bis 1.840 ml DI, um die Ausfällung zu vermeiden.
2. Bereiten Stammlösung der Erregung und Kontraktion Entkoppler blebbistatin bei 10 mg / ml in wasserfreien Di-Dimethylsulfoxid (DMSO) im Voraus und lagern Sie die Stammlösung bei 4 ° C.
3. Stammlösungen von fluoreszierenden Farbstoffen: (1) spannungsempfindlichen Farbstoff RH237 (1 mg / ml in DMSO) und (2) von geringer Affinität Calciumindikator Fluo-5N AM (2 mg / ml in DMSO) gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Mit den Vorbereitungen sofort zur Zersetzung mit anschließendem Verlust von Ladekapazität zu vermeiden.
4. Prime das Rezirkulieren Langendorff-Perfusionssystem mit oxygeniertem (95% O _{2, 5% CO} 2) Tyrodelösung. Einstellen der Strömung von _O 2 / CO _{2, um den} pH-Wert der Tyrodelösung bei 7,4 ± 0,05 zu halten. Verwenden Sie eine in-line Nylon gewebt Nettofilter (Porengröße: 11 & mgr; m), um kontinuierlich filtern das Perfusat.
   1. Prime das Perfusionssystem bei RT, wie nachfolgende loading Fluo-5N Uhr bei RT durchgeführt. Für Fluo-5N AM Beladung mit einem kleinen Kreislaufvolumen Perfusat (~ 150 ml). Nach der Farbstoffbeladung, verwenden Sie ein größeres Volumen an Perfusat (1 - 2 L, siehe Abbildung 1C).
5. Schalten Sie Datenerfassungssystem und die Vorbereitungen für die kontinuierliche Überwachung von EKG und Perfusionsdruck. Bereiten Druck-Überwachungssystem: Verbinden Sie einen Druckwandler, um die Perfusion Linie und der Perfusionsdruck mit einem Transbridge Verstärker zu überwachen. Können die Grundlinien Perfusionsdruck auf 0 mmHg, wenn das Herz nicht in das Perfusionssystem angebracht ist.
6. Richten Sie die optische Abbildungskameras, um räumliche Ausrichtung zwischen dem V _m und SR ^Ca 2+ Signale zu gewährleisten.
   1. Zunächst konzentrieren sich die Kameras, indem Sie ein Lineal oder ein Objekt mit Text in die Perfusion Gericht. Drehen Sie die Mapping-Kameras in eine Live View-Modus, und stellen Sie den Fokus, bis der Text ist scharf und klar. Erwerben Sie einen einzelnen Frame Bild von jeder Kamera.
   2. OverlayDiese Bilder und die Transparenz anzupassen des oberen Bildes, so dass die beiden Bilder sichtbar sind. Der Text in den Bildern sollte genau überlappen. Wenn nicht perfekt ausgerichtet sind, kann der Winkel des dichroitischen Spiegels oder der Position jeder Kamera einzustellen, bis die beiden Bilder ausgerichtet sind.

2. Ernten, Perfusion und Farbstoffbeladung von Kaninchen-Herz

1. Sichern Sie das Kaninchen in einem zugelassenen Rückhalte Kaninchen. Tief anästhesiert über eine intravenöse Injektion (marginale Ohrvene) von Natriumpentobarbital (50 mg / kg) und Heparin (1000 IU).
   1. Als die Kaninchen Displays fehlt der nozizeptiven Reflexen, stellen Sie eine Mittellinie Hautschnitt, um den Brustbein und Rippen freizulegen. Schnitt durch das Brustbein mit stumpfen Spitze chirurgische Scheren aus dem Schwertfortsatz, um den Hammergriff. Achten Sie darauf, das Herz schädigen beim Öffnen des Brustbeins. Verbreiten Sie die Rippen, um das Herz freizulegen.
   2. Schnell auszuschneiden das gesamte Herz-Lungen-Block durch schnelles Schneiden aller Gefäße und Bindegewebe. Immediadig legen Sie die Herz-Lungen-Block in Lösung eiskalten Tyrodes.
2. Suchen Sie die Aorta für die retrograde Perfusion. Schneiden Sie den aufsteigenden Aorta proximal der drei Zweige des Aortenbogens. Kanülieren die Aorta in eine 8 G Kanüle in das Perfusionssystem verbunden. Verwenden Sie ein Stück USP 0 Seidenfaden, um die Aorta auf die Kanüle zu sichern.
3. Sorgfältig sezieren die Luftröhre, Lunge und epikardialen Fett aus dem Herzen. Mit einem scharfen Pinzette und Schere Dissektion, suchen Sie die Mitralklappe und sorgfältig beschädigen oder entfernen Sie eine Broschüre zur Lösung Staus in der linken Herzkammer zu verhindern.
4. Tauchen Sie die Herzen in der Glasmantel Perfusionskammer horizontal mit der anterioren Oberfläche des Herzens nach oben für die Bildgebung. Sichern die Kanüle in einem Stück Sylgard mit U-förmigen Stifte auf dem Silizium Boden der Schale, um die Bewegung des Herzens während der Zuordnung (Figur 1D) zu verhindern. Falls gewünscht, legen Sie ein kleines Insekt Stift an der Spitze des Herzens für stasierung.
5. Position Elektrokardiogramm (EKG) Elektroden, die in dem Bad an der rechten und linken Seite des Herzens. Vollständig versenken die Elektroden im Bad und sicherzustellen, dass sie nicht in Kontakt mit der Herzoberfläche, um ein Volumen-EKG durchgeführt analog zu einem Lead I Konfiguration bereitzustellen. Stellen Sie sicher, eine normale Ableitung I EKG-Morphologie. Einstellen der Strömung (25 - 35 ml / min), um sicherzustellen, dass der Aortendruck wird bei 60 gehalten - 70 mmHg.
6. Schalten Sie die Raumbeleuchtung und fügen Sie 0,3 bis 0,6 ml blebbistatin Stammlösung (Schritt 1.2) zum Perfusat (Endkonzentration 10 - 20 & mgr; M).
   1. Schalten Sie die Raumbeleuchtung zu Photoinaktivierung blebbistatin vermeiden. Falls erforderlich, kann ein kleines Spotlight oder Stirnlampe verwendet werden, um Arbeitsplatzbeleuchtung bereitzustellen.
      Hinweis: blebbistatin ist ein Myosin-ATPase-Inhibitor und eine Erregung und Kontraktion Entkoppler. Weil Fluo-5N Lade erweiterten (60 min) RT (Hypothermie) Bedingungen erfordert (siehe Schritte 2,8-2,10), Herz-Energieproduktion beeinträchtigt sein kann. Therefore, Zugabe von blebbistatin in das Perfusat vor dem Laden Farbstoff kann den Energiebedarf ¹⁶ Verringerung und Beseitigung von Bewegungsartefakten bei der nachfolgenden optischen Aufnahmen ^17.
7. Bei Kontraktion des Herzens aufgehört hat (10 bis 15 min, auf der Aortendruck Aufzeichnung überprüft), um kleinvolumigen rezirkulierenden Perfusion (siehe Schritt 1.4.1) wechseln.
8. Bereiten Sie und laden Fluo-5N AM Beladungslösung: In 0,25 ml Fluo-5N AM-Stammlösung (Schritt 1.3) zu 0,25 ml warmem 20% Pluronic F127. 0,5 ml warmem Tyrodelösung zu der Mischung, gut mischen, und fügen Sie der kleinvolumigen Umlauf Perfusionssystem.
9. Kontinuierlich Perfusionsdruck und EKG-Überwachung und den Fluss ggf. einstellen. Farbstoffbeladung dauert ca. 1 h bei RT. 45 Minuten nach dem Laden begonnen hat, schalten Sie den zirkulierenden Wasserbad Erwärmung der Perfusionssystem und Perfusat auf 37 ° C zu beginnen.
10. Nach 60 min Fluo-5N AM Laden, switch die Perfusion des größeren Volumens Umlauf Perfusionssystem (siehe Schritt 1.4).
11. Verdünnte 50 ul spannungsempfindlichen Farbstoff RH237 Stammlösung (Stufe 1.3) in 1 ml warmem Tyrodelösung und langsam (über ~ 5 min) in eine Injektionsöffnung proximal der Kanüle.

3. Optische Mapping

1. Während der letzten Momente der Farbstoffbeladung, positionieren Sie den Herzen und konzentrieren sich die optischen Abbildungskameras, um die entsprechende Sichtfeld für das Experiment zu gewährleisten.
2. Falls gewünscht, eine bipolare Schrittmacherelektrode an der epikardialen Oberfläche des Herzens zur Stimulierung.
3. Legen Sie eine Kunststoff- oder Glasdeckglas auf der Oberfläche der Perfusionskammer, um Bewegungsartefakte auf der Flüssigkeitsoberfläche, die vorhanden sein können, aufgrund von Rückführung des Perfusat zu reduzieren.
   Hinweis: Als Alternative zu einem Deckglas mit einem sauberen Plastik 50 mm Petrischale Cover.
4. Fokus der Lichtleiter gleichmäßig die Oberfläche des Herzens mit e beleuchtenxcitation Licht. Verwenden blauen Leuchtdiode (LED) Lichtquellen und das Licht weiter zu filtern mit einem 475-495 nm Bandpassfilter (Abbildung 1A).
5. Sammeln emittiert Fluoreszenz mit einer Makroskops und zwei komplementären Metall-Oxid-Halbleiter (CMOS) optische Abbildungskameras. Teilen Sie das emittierte Licht mit einer dichroitischen Spiegel bei 545 nm.
   1. Langpaßfilter langwelligeren Gruppierung, enthaltend die V _m Signal bei 700 nm. Bandpassfilter die kürzeren Wellenlängen-Einheit, mit dem SR ^Ca 2+ Signal, 502 bis 534 nm (Abbildung 1A). Stellen Sie die Frequenz des optischen Datenerfassung, um 0,5 bis 1 kHz.
6. Für jeden optischen Aufzeichnungs zunächst initiieren die gewünschte Stimulationsprotokoll, schalten Sie das Anregungslicht, und sammeln 1-4 sec von Daten. Falls gewünscht, synchronisieren die Stimulationsprotokolle und Datenerfassung.
   Anmerkung: Es ist nicht möglich, wieder laden, Fluo-5N AM, also das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) wird decrease während des Versuchs infolge einer Leckage aus dem SR färben. Begrenzen experimentelle Protokoll auf 1 - 2 h, hohe SNR-Werte zu gewährleisten.
7. Nach dem Versuch, wäscht den Perfusionssystem in der Sequenz von DI-Wasser, 70% Reagensalkohol und nochmals mit DI-Wasser.
8. Filtern jedes Datensatzes mit einer Orts Gaußfilter (Radius 3 Pixel) unter Verwendung von im Handel erhältlichen Software-Paketen gemäß dem Protokoll des Herstellers.
9. Falls erforderlich, räumlich ausrichten V _m und SR ^Ca 2+ Datensätze. Wie in Schritt 1.6, Overlay-Bilder von jeder Kamera, und überprüfen Sie, dass die anatomischen Strukturen des Herzens (dh., Koronargefäße, Kanten der Atrien oder Ventrikel) oder andere Gegenstände in das Blickfeld (dh Kanüle, Schrittmacherelektrode) genau, überlappen. Falls nicht, wird räumliche Ausrichtung der Datensätze notwendig.
10. Schieben Sie die Top-transparentes Bild in der x- und y-Richtung, bis genaue Überdeckung erreicht wird, unter Nennung der Anzahl der Pixelmuss das Bild in jeder Richtung verschoben werden. Die gesamte Datenmenge entsprechend dem oberen Bild (entweder _m oder V SR ^Ca 2+) ist dann bestimmt durch die Anzahl von Pixeln in jeder Richtung verschoben werden, um eine genaue Ausrichtung zwischen dem V _m und SR ^Ca 2+ Datensätze zu gewährleisten.

Ergebnisse

1A zeigt eine schematische Darstellung der optischen Anordnung für Dual V _m und SR ^Ca 2+ Kartierung. Mit diesem Setup, gibt es komplette spektrale Trennung der V _m und SR ^Ca 2+ Signale (Abbildung 1B). Ein Diagramm des Dual-Schleifen Perfusionssystem für Fluo-5N Farbstoffbeladung verwendet wird, in Figur 1C veranschaulicht. Figur 1D zeigt die horizontale Ausrichtung des Herzens in das Perfusionssystem Schale. V...

Diskussion

Die Schlüssel zur erfolgreichen Fluo-5N Farbstoffbeladung sind der kleinvolumige rezirkulierenden Perfusion Einrichtung, die für eine hohe Fluo-5N-Konzentration ermöglicht, ohne die Notwendigkeit für große Mengen an Farbstoff, der Länge der Ladezeit (1 h) und Ausführen des Lade bei RT. Wenn das Laden bei physiologischen Temperaturen, zellulären Enzymaktivität schnell spaltet die -AM-Tag, wenn der Farbstoff kreuzt die Zellmembran, Einfangen der Farbstoffmoleküle in das Cytosol und nicht so dass sie die Membran zu durchqu...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NaCl	Fisher Scientific	S271-1	Bestandteil der Tyrode-Lösung
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500	Bestandteil der Tyrode-Lösung
KCl	Fisher	Scientific S217-500	Bestandteil der Tyrode-Lösung
MgCl2 (6H2O)	Fisher Scientific	M33-500	Bestandteil der Tyrode-Lösung
NaH2PO4 (H2O)	Fisher Scientific	S369-500	Bestandteil der Tyrode-Lösung
NaHCO3	Fisher	Scientific S233-3	Bestandteil der Tyrode-Lösung
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1	Bestandteil der Tyrode-Lösung
95 % O2 5 % CO2	AirGas	carbogen	Für die Sauerstoffversorgung und den pH-Wert der Tyrode-Lösung
Blebbistatin	Tocris Bioscience	1760	Anregungs-Kontraktions-Entkoppler
RH237	Biotium	61018	Spannungsempfindlicher Farbstoff
Fluo-5N AM	Invitrogen	F-26915	Ca2+-Indikator mit geringer Affinität; Alternativ: Invitrogen F-14204; Die Beladung muss bei Raumtemperatur durchgeführt werden
Pluronic F127	Biotium	59004	Für die Beladung des Ca2+ Indikators; Vor Gebrauch erwärmen, bis die Lösung klar ist
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Zum Auflösen von Blebbistatin und Farbstoffen
Filter	EMD Millipore	NY1104700	11 μ m Inline-Filter
Druckmessumformer	WPI	BLPR2	Zur Messung des Perfusionsdrucks
Transbrückenmessumformer Verstärker	WPI	SYS-TBM4M	Zur Übertragung/Verstärkung von Drucksignalen; PowerLab kann auch mit entsprechenden BioAmp
PowerLab 26T	ADInstruments		verwendet werden Zur kontinuierlichen Aufzeichnung von Druck- und EKG-Signalen
THT Makroskop	SciMedia		Makroskopischer optischer Aufbau. Details: 0,63X Objektiv (NA = 0,31), 2X Kondensationsobjektiv, resultierendes Sichtfeld = 3,1 cm x 3,1 cm, Tiefenschärfe = ~ 1,5 mm
MiCam Ultima-L CMOS	SciMedia		Optische Mapping-Kameras
Präzisions-LED-Spotlicht	Mightex	PLS-0470-030-15-S	LED-Lichtquelle