Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Zusammenfassung

Dieses Manuskript bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Gewinnung und Erhaltung menschlicher Keratinozyten aus gezupftem Haar und die anschließende Erzeugung von integrationsfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) durch episomale Vektoren.

Zusammenfassung

Jüngste Fortschritte in der Reprogrammierung ermöglichen es uns, somatische Zellen in humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) umzuwandeln. Die Krankheitsmodellierung mit patientenspezifischen hiPS-Zellen ermöglicht die Untersuchung des zugrundeliegenden Mechanismus der Pathogenese und bietet auch eine Plattform für die Entwicklung von In-vitro-Wirkstoffscreenings und Gentherapien zur Verbesserung der Behandlungsoptionen. Das vielversprechende Potenzial von hiPSCs für die regenerative Medizin zeigt sich auch an der steigenden Zahl von Publikationen (>7000) zu iPSCs in den letzten Jahren. Verschiedene Zelltypen aus unterschiedlichen Abstammungslinien wurden erfolgreich für die Erzeugung von hiPSCs verwendet, darunter Hautfibroblasten, hämatopoetische Zellen und epidermale Keratinozyten. Während Hautbiopsien und Blutentnahmen in vielen Labors routinemäßig als Quelle für somatische Zellen für die Erzeugung von hiPSCs durchgeführt werden, wird die Entnahme und anschließende Ableitung von Haarkeratinozyten seltener verwendet. Aus Haaren gewonnene Keratinozyten stellen einen nicht-invasiven Ansatz dar, um Zellproben von Patienten zu gewinnen. Hier skizzieren wir eine einfache nicht-invasive Methode zur Gewinnung von Keratinozyten aus gezupftem Haar. Wir bieten auch Anweisungen für die Wartung von Keratinozyten und die anschließende Reprogrammierung zur Erzeugung integrationsfreier hiPSC unter Verwendung episomaler Vektoren.

Einleitung

Die Entdeckung der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) hat das Gebiet der regenerativen Medizin revolutioniert und bietet eine praktikable Methode zur Erzeugung von patientenspezifischen Stammzellen ^1-3. hiPSCs wurden erfolgreich aus verschiedenen Zelltypen, einschließlich Fibroblasten, ^{4,5, 6,7} hämatopoetischen Zellen, Nieren-Epithelzellen aus Urin ⁸ und Keratinozyten ^9,10 erzeugt. Bisher Haut-Fibroblasten und blutbildenden Zellen stellen die am häufigsten verwendeten Zellquellen zur Erzeugung von patientenspezifischen iPSCs. Dies mag auf die Tatsache zurückzuführen, dass Hautbiopsien und Blutentnahme sind Routine medizinischen Verfahren und großen Biobanken von Patienten Blut oder Hautproben wurden in vielen Ländern etabliert.

Im Gegensatz zu den Blutzellen und Hautfibroblasten, die invasive Extraktionsmethoden erfordern, Keratinozyten stellen eine leicht zugängliche Zelltyp für hiPSC Generation. Keratinocytes sind Keratin-reiche Epithelzellen, die das Äußere epidermalen Barriere der Haut zu bilden und werden auch in Nägel und Haare ¹¹ gefunden. Insbesondere kann auf die Keratinozyten der äußeren Haarwurzelhülle (ORS) Haarfollikel von einer externen Zellschicht, die den Haarschaft zusammen mit dem inneren Wurzelscheide (IRS) Zellen ^(12, Figur 1) abgedeckt ermittelt werden. Wie Haar Sammlung ist ein einfaches Verfahren, das nicht die Unterstützung des medizinischen Personals erfordert, bietet es eine Chance für die Patienten zu sammeln und zu ihren eigenen Haarproben an Laboratorien, die die Sammlung von Patientenproben für hiPSC Generation erheblich erleichtern würde. Epidermiskeratinocyten auch eine höhere Wirksamkeit und eine schnellere Anpassung Umprogrammierung Kinetik im Vergleich zu Fibroblasten, zusätzlich zu den Vorteilen der Verwendung von Keratinozyten, wie die Ausgangszellen für die Erzeugung hiPSC ^9,13. Weiterhin kann hiPSCs auch mit anderen Zellpopulationen in der Haarfollikel erzeugt werden,einschließlich der dermalen Papillenzellen an der Basis des Haarfollikels ^14,15 entfernt.

Frühere Berichte des iPSC Generation mit Haar-abgeleiteten Zellen verwenden häufig retroviralen oder lentiviralen-basierte Verfahren der Reprogrammierung ^9,14,15. Allerdings sind diese virale Verfahren einzuführen unerwünschte genomische Integration ausländischer Transgenen während Neuprogrammierung. Im Vergleich dazu ist die Verwendung von episomalen Vektoren, eine Möglichkeit, die nicht-virale Verfahren zum Umprogrammieren Integration freien iPSCs ⁴ zu erzeugen. Wir haben bereits eine einfache, kostengünstige und nicht-virale Verfahren zur effizienten umprogrammieren Keratinozyten in hiPSCs mit episomalen Vektoren ¹³ entwickelt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von Keratinozyten stamm hiPSCs, einschließlich der Ableitung von Keratinozyten aus gezupften Haare, Erweiterung und Wartung der Keratinozyten und anschließender Neuprogrammierung zu hiPSCs generieren.

Protokoll

Die Sammlung der menschlichen Haarprobe von Personen erfordert ethische Genehmigung durch die menschliche Forschung Ethik-Kommission in den Gasteinrichtungen und sollten in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt werden.

1. Isolierung von Keratinozyten aus Zupfinstrumente Haar

1. Tau-extrazellulären Matrix (ECM) Lösung (dh Matrigel) auf Eis O / N.
2. Verwendung vorgekühlte Pipettenspitzen, fügen Sie 200 ul ECM-Lösung zu 12 ml gekühltes DMEM / F12-Medium. Coat eine 12-Well-Platte mit 1 ml verdünnter ECM-Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die beschichtete Platte O / N bei 37 ° C. Waschen Sie die beschichtete Platte mit vorgewärmten DMEM / F12-Medium vor der Verwendung.
3. Sammeln primären menschlichen Haares von der individuellen Kopf, indem die Finger in der Nähe der Wurzel des Haares und Zupfen Sie die Haare in eine schnelle und gleichmäßige Bewegung. Überprüfen Sie, um zu bestätigen, dass jeder gesammelten Haaren enthält eine intakte Haarfollikel und bestimmen die Wachstumsphase der Haare unDer einem Binokular (Abbildung 1).
   1. Sammeln 5-10 Anagenhaare von jedem einzelnen auf Keratinozyten zu extrahieren. Verfahren gezupften Haare so schnell wie möglich zu einer erfolgreichen Ableitung Keratinozyten sicherzustellen.
      ANMERKUNG: Abbildung 1 zeigt die Morphologie der Haare in unterschiedlichen Phasen des Wachstumszyklus. Anagenhaare ist in der Wachstumsphase mit einer sichtbaren äußeren Epithelschicht die Länge der Haare, da die ORS bekannten Umgebung. Auf der anderen Seite, Telogen Haar stellt Haare in der Ruhephase und muss nicht eine sichtbare ORS, aber hat eine klare Kugel von Zellen für den Wurzel des Haares, als Telogen Ausbuchtung bekannt.
4. Platzieren Sie die Haarprobe in eine Petrischale, die 10 ml mit Antibiotika Mix für 5 min bei RT waschen.
5. Verwendung sterilisiert Schere und Pinzette, schneiden Sie übermäßigen Haarwelle, so dass ein Haar-Fragment mit einer intakten Haarfollikel und um 0,5 bis 1 cm von Haarschaft.
6. Sorgfältig transfer 1 Haar-Fragment in jeder Vertiefung der ECM-beschichtete Platte mit einer Pinzette.
7. Unter Verwendung einer 1 ml Pipette ca. 3 Tropfen Knockout Serum Replacement (KSR), Medium (~ 100 bis 200 & mgr; l) zu den Haarproben.
   Hinweis: Halten Sie das Haar-Fragmente in engem Kontakt zur Plattenoberfläche, um für die Befestigung und die anschließende Keratinozyten Auswuchs zu ermöglichen. Hinzufügen von Seiten übermäßig in diesem Schritt kann bewirkt, dass die Haar-Fragmente zu schweben, und verringert die Chance einer erfolgreichen Haar Befestigung.
8. Die Haarproben in einer 37 ° C-Inkubator mit 5% CO ₂ inkubieren und lassen die Haarfollikel O befestigen / N. Am folgenden Tag, sanft weiteren hinzufügen 3 Tropfen KSR Medium (~ 100 bis 200 & mgr; l), um die Haarproben feucht zu halten.
9. Beachten Sie die Haarproben täglich, um zu bestätigen, dass die Haarfollikel erfolgreich angeschlossen. Generell Befestigung der Haarfollikel ist offensichtlich innerhalb von 1-3 Tagen. Dicke Haare sind in der Regel leichter zu befestigen, verglichen mit feinen Haaren, wie feinen Haaren höher habenTendenz zu schweben, die die Befestigung behindern.
   1. Sobald das Haar haben auf die beschichtete Platte befestigt ist, fügen Sie 500 ul KSR Medium zum Brunnen. Seien Sie besonders vorsichtig beim Hinzufügen des Mediums als Haarproben möglicherweise nicht fest angeschlossen haben. Von diesem Punkt zu ändern Medien alle 2 Tage.
      Hinweis: Keratinozyten Auswüchse sollten von der ORS Bereich der Haar-Fragment nach 3-7 Tagen (2A-B) zu sehen sein. Lassen Sie die Keratinozyten bis zu 14 Tage vor aufwachsen Passagieren der Zellen, wie im nächsten Abschnitt beschrieben.

2. Wartung und Passagieren von Keratinozyten

1. Vorstrich eine 6-Well-Platte mit der Beschichtungsmatrix Kit. Fügen Sie 680 ul des Verdünnungsmedium aus dem Kit in jede Vertiefung, gefolgt von 6,8 & mgr; l Beschichtungsmatrix-Lösung. Schütteln Sie die Platte um eine gleichmäßige Verteilung der Beschichtungsmatrix-Lösung auf der Platte sicherzustellen.
2. Lassen Sie den beschichtete Platte für 30 min bei RT inkubieren. Entfernendie Beschichtungsmatrix-Lösung vor dem Beschichten von Keratinozyten.
3. Dissoziieren Keratinozyten in eine Einzelzellsuspension mit 500 ul 0,25% Trypsin pro Vertiefung für 2-5 Minuten bei 37 ° C. Inaktivierung des Trypsins mit 500 ul Medium, das Serum enthält (beispielsweise fötales Rinderserum (FBS) mittel) und Sammeln in ein steriles 15 ml Röhrchen. Entfernen Sie die Haare Fragment mit sterilisierten Pinzette.
4. Bestimmen Sie die Anzahl der geernteten Zellen mit einem Hämozytometer.
5. Zentrifugieren der Zellen für 3 min bei 200 x g. Die Zellen mit PBS und wiederholen Zentrifugation waschen. Saugen Sie das PBS und Zellpellet in frischem Keratinozyten-Medium.
6. Platte um 4 x 10 ⁴ Keratinozyten in ein Well ECM-beschichtete Platte in Gegenwart von Keratinozyten-Medium. Halten die Keratinozyten in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO ₂ (Abbildung 2C). Ändern Medien jeden Tag und Passage-Zellen, wenn die Kultur ist ~ 80% konfluent, which kann etwa 2-7 Tage dauern, je nach Durchgang Nummer und Proliferationsrate der Keratinozyten. Die abgeleiteten Keratinozyten sollte erweitert werden, um ausreichend gefroren Aktien unter Verwendung von Standard langsam Einfrieren Kryokonservierung Methoden ¹⁶ zu erzeugen.
   Anmerkung: Die hier beschriebenen Kulturbedingungen unterstützt die Ausdehnung des homogenen Population von Keratinozyten mit typischen Kopfsteinpflastermorphologie (Abbildung 2C). Gelegentlich können ein paar differenzierten Keratinozyten, mit großen und flachen Morphologie und haben replikative Potential verloren, in der Kultur zu beobachten. Charakterisierung von Keratinozyten durch Immunfärbung mit Antikörpern gegen Cytokeratin 14 durchgeführt werden, wie zuvor beschrieben ^17. Gegründet Keratinozyten-Zelllinien sollte auch auf Mykoplasmen nach 1-3 Passagen mit kommerziell erhältlichen Kit getestet werden.

3. Erzeugung von hiPSCs von Keratinozyten Mit Episomale Vektoren

1. Vorstrich eine 6-Well-Platte mit0,1% Gelatine (2 ml / Vertiefung). Gelatine mit Mantel für mindestens 20 min bei RT.
2. Umprogrammierung Experiment Verwendung Keratinozyten spätestens Gang 6 Dissociate Keratinozyten in eine Einzelzellsuspension mit 1 ml 0,25% Trypsin pro Vertiefung für 2-5 Minuten bei 37 ° C. Inaktivierung von Trypsin mit 1 ml Medium, das Serum (zB FBS-Medium) und sammeln Sie in einem 15-ml-Tube.
3. Zentrifuge Zellen für 3 min bei 200 xg und resuspendieren Zellen in Keratinozyten-Medium. Platte 1 × 10 ⁵ -1.5 × 10 ⁵ pro Vertiefung Keratinozyten in einer gelatinierten Platte O / N.
4. Am folgenden Tag (Tag 0), überprüfen Sie die Platte, um sicherzustellen, Zellen 50-60% konfluent.
   Hinweis: Wenn Keratinozyten weniger als ~ 50% konfluent sie nicht gut nach der Transfektion wachsen könnte.
5. Am Tag 0, führen Transfektion der episomalen Vektoren Neuprogrammierung auf die Keratinozyten mit einem Verhältnis von 8 & mgr; Transfektionsreagenz bis 2 & mgr; g Gesamt-Plasmid-DNA.
   1. Nehmen 0,5 ug für jeden der 4 Plasmide (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOCT3 / 4-shP53F, pCXLE-hSK, pCXLE-HUL) und in 100 & mgr; l reduziert Serum-Medium (zB OPTI-MEM) verdünnt.
      Hinweis: Das Plasmid pCXLE-eGFP verwendet, um die Transfektionseffizienz in Keratinozyten zu überwachen und ist nicht für eine erfolgreiche Neuprogrammierung erforderlich.
   2. Sie 8 ul Transfektionsreagenz zu der verdünnten DNA. Mischen Sie durch Schwenken des Rohres. Lassen Sie die DNA-Reaktionsmischung bei RT 15 min ungestört zu entspannen.
   3. Ersetzen Sie die Keratinozyten-Medium durch frisches Medium.
   4. Fügen Sie vorsichtig die DNA-Reaktionsmischung zu Keratinozyten-Kultur und Inkubation in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO ₂ für 4 Stunden.
      Hinweis: Es wird nicht empfohlen, längeren Transfektion O / N in Keratinozyten durchzuführen, da sie geringe Überlebens nach der Transfektion aufweisen.
   5. Nach 4 Stunden nach der Transfektion, ersetzen Sie die Keratinozyten-Medium durch frisches Medium.
6. Am Tag 1 (1 Tag nach der transfection), ändern Sie die Keratinozyten-Medium und prüfen Transfektionseffizienz durch Schätzung der Anteil der eGFP positiven Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Typischerweise> 60-70% Transfektionseffizienz für primären Keratinozyten unter Verwendung dieses Protokolls festgestellt.
7. Am Tag 2 wiederholen Transfektion, wie in Schritt 3.5 beschrieben. Zwei aufeinanderfolgenden Transfektionen typischerweise erreichen würde> 90% Transfektionseffizienz. Keratinocytenkultur Regel erreicht Mündung bis zum Ende der zweiten Transfektion.
   1. Bereiten Sie eine 10 cm Schüssel mit embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder für jede Neuprogrammierung Reaktion. Bereiten mitotisch inaktivierten MEF Feeder wie zuvor beschrieben ^18.
   2. Precoat-10-cm-Schale mit 5 ml 0,1% Gelatine für mindestens 20 min. Platte 4 x 10 ⁶ mitotisch inaktivierten MEF pro 10 cm Schale in FBS-Medium. Lassen Sie die Zellen absetzen und befestigen Sie O / N in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO _2.
8. Am Tag 3, harWeste die Keratinozyten mit 0,25% Trypsin, wie in Schritt 3.2 und 3.3 beschrieben. Resuspendieren der Keratinozyten in KSR Medium und die Platte 90% der Keratinozyten aus 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte in eine 10 cm MEF Feeder-Gericht mit KSR Medium.
9. Von Tag 4 ab, jeden Tag ändern Sie die KSR Medium.
   1. Alternativ nach Tag 18, ersetzen Sie jeden zweiten Tag Kulturmedium.
      Hinweis: Nicht-Keratinozyten umprogrammiert wird aufhören zu vermehren, während hiPSC Kolonien mit definierten Grenze, die menschliche embryonale Stammzellen (hES) ähneln wird ab Tag 14 entstehen - 21.
10. Isolieren hiPSC Kolonien durch manuelle Dissektion von Tag 21 ab. Vermeiden hiPSC Kolonien, die eng zusammen gruppiert sind und nur hiPSC Kolonien, die sich deutlich von den anderen getrennt werden pflücken.
    Anmerkung: hiPSC Kolonien können früher aufgenommen werden, aber die Kolonie mit definierten Grenzen möglicherweise nicht zu früheren Zeitpunkten offensichtlich, angesichts der geringen Koloniegröße. Neuprogrammierung Effizienzen zwischen diff variierenErent Patienten Keratinozyten und wird auch durch andere Faktoren wie beispielsweise Durchlaufhäufigkeit bzw. Proliferationsrate der Keratinozyten beeinflusst.
    1. Für die manuelle Präparation der hiPSC Kolonien, verwenden Sie eine 26G Nadel hiPSC Kolonien unter einem Binokular geschnitten. Schneiden Sie ein hiPSC Kolonie in kleine Stücke rund 300 bis 600 & mgr; m in der Länge. Übertragen Sie die Stücke von einem hiPSC Kolonie in einen neuen MEF Feeder-Platte (2,5 x 10 ⁴ MEF / cm ^2), um eine klonale Linie der hiPSCs etablieren. Zu Beginn jeder Kultur hiPSC klonalen Linie in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte oder Organkulturschalen, erweitern Sie dann bis 6 Well-Plattenformat.
    2. Pflegen etablierten klonalen Linien hiPSCs in KSR Medium auf MEF Feeder. Sobald der Kultur zu erreichen 70-80% Konfluenz mit hiPSC Kolonien ~ 1,5 mm Durchmesser, Durchgang hiPSCs mit Standard-enzymatische Methoden Passagieren (Accutase, Dispase oder Collagenase IV) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
11. Charakterisieren gegründet hiPSC Linies Pluripotenz und ihre Fähigkeit, in Zellen Vertreter der drei Keimblätter in vitro und / oder in vivo ^13,19 differen bestätigen. Auch routinemäßig etablierten Test hiPSC Linien für Mykoplasmen mit kommerziell erhältlichen Kits zu gewährleisten, dass sie pathogen-frei sind. Genomische Stabilität hiPSC Linien durch Karyotypisierung oder Array-basierte Kopienzahl Variation (CNV) Analyse routinemäßig zu überwachen.

Ergebnisse

Das Haar durchläuft drei verschiedene Phasen des Wachstumszyklus: Anagenphase (Wachstumsphase), catagen (die Regressionsphase) und Telogen (die Ruhephase) ^20,21. Das Anagen Haarfollikel enthält mehrere Schichten von Epithel; Diese Schichten sind die ORS, IRS und den Haarschaft (Abbildung 1). Anagenhaar schließlich einen Übergang zu dem catagen Phase, die durch Apoptose der ORS und Beendigung der Haarschaft Differenzierung gekennzeichnet ist. Schließlich catagen Haar Übergang in die Telogenpha...

Diskussion

Erzeugung von patientenspezifischer hiPSCs bietet einen einzigartigen Ansatz für die Untersuchung der Pathogenese in den erkrankten Zelltypen in vitro, und stellt auch eine Plattform zum Wirkstoff-Screening, neue Moleküle, die die Krankheitsphänotypen retten kann identifizieren. Diese Krankheit Modellansatz mit hiPSCs vielversprechende Ergebnisse für eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Long-QT-Syndrom, Huntington-Krankheit, Parkinson-Krankheit und amyotrophe Lateralsklerose ²² ergab. Mehrer...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antibiotika-Mix:
250 ng/ml Antimykotisches Amphotericin B	Sigma	A2942-20ml	Antibiotika-Mix ist aus PBS hergestellt.
1X Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
PBS (-)	Invitrogen	14190-144
Knockout Serum Ersatz (KSR) Medium:			Das KSR-Medium wird vor der Verwendung mit Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) filtriert. bFGF wird dem Medium vor der Verwendung frisch zugesetzt.
20% Knockout-Serumersatz (KSR)	Invitrogen	10828-028
DMEM/F12 mit Glutamax	Invitrogen	10565-042
1&mal; MEM nicht-essentielle Aminosäure	Invitrogen	11140-050
0,5& mal; Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
0,1 mM β-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985
bFGF (10 ng/ml, frisch zugesetzt)	Millipore	GF003
Keratinozyten-Medium:
EpiLife mit 60  &Mikro; M Calcium	Invitrogen	M-EPI-500-CA
1 mal Nahrungsergänzungsmittel für humane Keratinozyten (HKGS)	Invitrogen	S-001-5
Fötales Kälberserum (FBS) medium:			Das FBS-Medium wird vor der Verwendung mit Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) filtriert.
10% fötales Rinderserum (FBS)	Invitrogen	26140079
DMEM	Invitrogen	11995-073
0,5x Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
2 mM L-Glutamin	Invitrogen	25030
0,25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
Extrazelluläre Matrix (ECM):
Matrigel	Corning	354234	Aliquot Matrigel lagern und lagern in -80°; C nach Hersteller" s Anweisungen. Die Stammkonzentration von Matrigel variiert leicht von Charge zu Charge (~9 mg/ml). Wir empfehlen die Verwendung von 200µ l Matrigel zum Beschichten einer 12-Well-Platte (~150µ g/well).
Beschichtungsmatrix-Kit	Invitrogen	R-011-K
Plasmide:			Beachten Sie, dass pCXLE-eGFP nur zur Überwachung der Transfektionseffizienz verwendet wird und nicht für die Reprogrammierung erforderlich ist.
-                  pCXLE-eGFP	Addgen	27082
-                  pCXLE-hOct3/4-shP53F	Addgen	27077
-                  pCXLE-hSK	Addgen	27078
-                  pCXLE-hUL	Addgene	27080
Transfektionsreagenz Fugene HD	Promega	E231B
Gelatine (aus Schweinehaut)	Sigma	G1890	Besteht aus 0,1 % Gelatine in destilliertem Wasser. Vor Gebrauch autoklavieren.
Reduziertes Serummedium: OPTI-MEM	Invitrogen	31985062
Accutase	Sigma	A6964-100ml
embryonale Fibroblasten (MEF) Feeder			MEF kann durch Mitomycin C-Behandlung oder Bestrahlung inaktiviert werden, wie zuvor beschrieben 16.
26G-Nadel	Terumo	NN2613R
6-Well-Platte (Gewebekultur behandelt)	BD Biosciences	353046
12-Well-Platte (Gewebekultur behandelt)	BD Biosciences	353043
10 cm Schale (Gewebekultur behandelt)	BD Biosciences	353003
Dispase	Invitrogen	17105-041	Anwendung bei 10 mg/ml
Kollagenase IV	Invitrogen	17104-019	Anwendung bei 1 mg/ml
TRA-160 Antikörper	Millipore	MAB4360	Anwendung bei 5 &; Mikro; g/ml
OCT4 Antikörper	Santa Cruz	SC-5279	Anwendung bei 5 & Mikro; g/ml
NANOG Antikörper	R& D Systems	AF1997	Einsatz bei 10 & Mikro; g/ml
MycoAlert Detektionskit	Lonza	LT07-418