Label-fri enda molekyl Detection Använda Microtoroid optiska resonatorer

Abstract

Upptäcka små koncentrationer av molekyler ner till enda molekyl gränsen har inverkan på områden som tidig upptäckt av sjukdomen, och grundläggande studier av beteendet hos molekyler. Enstaka tekniker molekyl upptäckt utnyttjar ofta märkningar såsom fluorescerande taggar eller kvantprickar, men etiketterna inte alltid tillgängliga, öka kostnaden och komplexiteten, och kan störa de händelser som studeras. Optiska resonatorer har dykt upp som ett lovande sätt att upptäcka enstaka molekyler utan användning av etiketter. För närvarande den minsta partikeln detekteras av en icke-plasmonically utökad nakna optisk resonator systemet i lösning är en 25 nm polystyren sfär ^1. Vi har utvecklat en teknik som kallas Frequency Låsa optisk Whispering Evanescent Resonator (BLOMMA) som kan överträffa denna gräns och uppnå etikett fria enda molekyl upptäckt i vattenlösning ^2. Som signalstyrkan skalor med partikelvolymen representerar vårt arbete a> 100x improvement i signal-brusförhållandet (SNR) jämfört med den nuvarande teknikens ståndpunkt. Här förfaranden bakom BLOMMA presenteras i ett försök att öka dess användning i fält.

Introduction

Enda molekyl experiment upptäckt är användbara för att minska mängden analyt som används i biosensorer, för tidig upptäckt av sjukdomen, och för att undersöka de grundläggande egenskaperna hos molekyler ^3. Sådana experiment utförs typiskt med användning av etiketter, dock etiketter är inte alltid möjligt att erhålla för ett särskilt protein, öka kostnaden, kan störa de händelser som studeras, och kan vara obekvämt, särskilt för realtid på plats experiment eller point-of vård diagnostik.

Den aktuella guldnormen för etikettfritt biosensing är ytplasmonresonans ^4, men de kommersiella ytplasmonresonans system har normalt en typisk lägre detektionsgränsen i storleksordningen nM. På senare tid har optiska resonatorer dykt upp som en lovande teknik för etikettfritt enda molekyl biodetection ^5. Optiska resonatorer arbete utifrån de långsiktiga (ns) inneslutning av ljus ^6,7. Ljuset är övergåendekopplas in dessa anordningar typiskt via en optisk fiber. När våglängden för ljuset som går genom fibern matchar resonansvåglängden hos resonatorn, tända effektivt kopplad till resonatorn. Detta kopplat ljus totalt internt reflekterar inom resonatorn hålighet generera en evanescent fält i närheten av omkretsen av resonatorn. Som partiklarna kommer in det evanescenta fältet och binder till resonatorn, resonansvåglängden hos resonatorn ändras i proportion till partikelns volym ^8.

När det gäller detekteringsförmåga, har mikrosfärer resonatorer tidigare använts för att detektera enstaka influensa A viruspartiklar (100 nm) ^9,10. Nyligen har plasmonically-förstärkt mikrosfär optiska resonatorer använts för att detektera enstaka bovinserumalbumin molekyler ^{11 och} 8-mer oligonukleotider ^12, men detta tillvägagångssätt begränsar partikelinfångningsområdet till 0,3 ^ m ² per device. Större biosensorer fånga området är idealiska för att maximera chansen att partikeldetektering. Aktuella lösningsbaserade märkningsfria biosensing teknik med stora (> 100 ^ m ²⁾ infångningsområdena har varit begränsade till detektering av polystyrenpartiklar ≥ 25 nm.

Vi har utvecklat en etikett fritt biosensing system baserat på optisk resonator teknik som kallas frekvens Låsning Optisk Whispering Evanescent Resonator (blomma) ¹³ (figur 1) som är kapabel att tidsupplöst detektering av enstaka molekyler i lösning. BLOMMA använder långa fotonen livstid microtoroid optiska resonatorer i kombination med frekvenslåsningsåterkopplingsstyrning, balanserad detektering och beräknings filtrering för att upptäcka små partiklar ned till enskilda proteinmolekyler. Användningen av frekvenslåsning tillåter systemet att alltid spåra växlings resonans av microtoroid som partiklar binder, utan behov av att sopa eller skanna laservåglängden överstora områden. Principerna för BLOMMA kan användas för att förbättra detekteringsfunktioner i andra tekniker inklusive plasmoniska förbättring. I det följande är de förfaranden för att utföra BLOMMA beskrivits.

Protocol

1. experimentuppställning och Provberedning

1. Tillverka microtoroids använder litografi, etsning och smältande procedur som beskrivits tidigare ^6. Tillverka microtoroids ovanpå en kiselskiva (chip) som vanligtvis har en större diameter av 80 till 100 | im, och en mindre diameter av 2 pm.
2. Varva ner ungefär en meter single-mode optisk fiber (125 pm beklädnad, modfältsdiameter 4,3 um) från sitt fiberpolen.
3. I mitten av den avlindade delen av den optiska fibern, skala ett litet segment (2,5 cm) hos polymerbeläggningen runt den optiska fibern med hjälp av Avisoleringstänger. Anmärkning: Detta är den del av den optiska fibern som kommer att användas för att övergående koppla ljus in i microtoroid.
4. Rengör avskalade fibern med isopropanol alkohol och en luddfri torka.
5. Håll denna del av fibern på plats med hjälp av en fiberhållare gjord av magnetiska klämmor.
6. Tunna den avskalade fibern till ~ 500 nm med Melting och dra med hjälp av en vätebrännare och två stegmotorer som rör sig i motsatta riktningar med 60 | j, m / min. Placera den optiska fibern inuti den övre delen av lågan, som bör vara ~ 10 mm hög. Sluta dra fibern när transmissionen genom fibern slutar fluktuerande, som kan övervakas antingen visuellt (genom att titta på ljuset som sprids i sidled från fiber blinkar på och av) ​​eller genom att ansluta fibern till en fotodiod som är fäst till ett oscilloskop .
7. Cleave ena änden av den optiska fibern och infoga den i en bar fiber adapter. Placera denna ände av fibern in i ingången hos fotomottagare.
8. Fiber koppla den andra änden av fibern spolen till lasern med hjälp av en fiberoptisk kopplare.
9. Placera microtoroid chip på toppen av en provhållare (rostfritt stål, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) med användning av antingen epoxi eller dubbelhäftande tejp.
10. Montera provhållaren på toppen av ett positioneringssteg som består av en tre-axlig nano positionering (nanocube) stadium (se utrustningslista) på toppen av en 3-axlig mikrometer. Utför alla experiment på en pneumatiskt isolerad optisk tabell för att minimera vibrationer.
11. Grov läge prov chip med hjälp av 3-axlig mikrometer.
12. Rikta in microtoroid innehållande chip parallellt med den optiska fibern med hjälp av nanolägesställare. Obs: Rikta in microtoroid inom ett avstånd av en våglängd av ingångsljuset (~ 633 nm). För visning av denna process använda två avbildnings kolumner (rör med objektiv och kamera, se utrustningslista) placerad på toppen och på sidan av chipet.
13. Optimera polarisering av laserljuset riktas genom den optiska fibern med hjälp av en in-line polariseringsstyrenhet (se utrustningslista) med en ratt för att justera polarisering. Obs: Optimal polarisering uppnås när den uppmätta dopp i överföringen av den optiska fibern visas den smalaste. Observera detta dopp på ett oscilloskop (se steg 2.2 för mer information).
14. Konstrueraen provkammare genom epoxying ett täckglas över provet steget med användning av ett mikroskopobjektglas som en distans. Anmärkning: En plexiglas hölje som täcker hela installationen kan vara användbart för att minimera luftströmmar. En liten öppning bör lämnas för att möjliggöra den lösning som skall pumpas i att använda slangen.
15. Termiskt jämvikt partikelsuspensioner eller enda molekyl vattenlösningar för ≥ 1 timme i en RT-vattenbad (~ 500 ml). Obs: Prover späddes till den önskade koncentrationen i mikrocentrifugrör med hjälp av de tillhörande buffertarna som anges av tillverkaren, t.ex. PBS eller HEPES. Om inga bindningshändelser detekteras, öka saltkoncentrationen i bufferten.
16. Vortex partikel innehållande lösningar (1 ml) kort för ~ 2 sek.
17. Injicera partikelinnehållande lösningar in i provkammaren vid en ml / min med användning av en 1 ml sprutpump.
18. Efter provkammaren har fyllt, stänga sprutpumpen.
19. Vänta 30 sekunder innan inspelning av data för att minimeraeffekterna av mekaniska vibrationer till följd av fluidflöde som kan påverka mätningen.

2. Frekvens Låsning

1. Åter par toroiden på den optiska fibern genom förflyttning av provhållaren med nanopositioner, eftersom kopplingen kommer att störas på grund av injektion av fluid.
2. Lokalisera resonansvåglängden för den microtoroid genom avsökning av datorstyrda ingångs lasern genom en mängd olika våglängder. Utföra detta steg genom att skicka en triangulär spänningsvågform signal till ett piezoelektriskt element i laser styrenhet som reglerar laserns våglängd. Utför experiment med användning av synligt ljus (635 nm ± 2,5 nm) som det finns låg absorption av ljus i vatten vid denna våglängd.
3. Mäta ljustransmissionen genom den optiska fibern genom att koppla utsignalen från den optiska fibern in i en auto-balanserad fotomottagare. Anslut utgången från fotomottagare i ett oscilloskop med hjälp av en BNC-kabel. Observera on oscilloskopet att vid resonansvåglängden för den microtoroid, droppar överföring genom den optiska fibern.
4. Fäst produktionen av fotomottagare till huvudingången på frekvenslåsningsåterkopplingsstyrenheten (se utrustningslista) via en kabel.
5. Kör frekvenslåsningsåterkopplingsstyrenheten i autolock-läge med top-of-topp låsning med en vibrationsfrekvens på 2 kHz och en amplitud av våglängd svängning 19 fm. Empiriskt ställa in proportionell-integral-derivata inställningar i fönstret programvara med Ziegler-Nichols tuning regler ^14. Anmärkning: Dessa värden behöver endast fastställas en gång i början av alla experiment.
6. Auto låsa laserns våglängd till resonansvåglängden hos microtoroid. Utför detta steg efter fyllning av provkammaren. Obs: Om våglängdsförändringen är för stor, då återkopplingsstyrenheten kommer att förlora lås och automatiskt växla till scanning för att lokalisera resonansvåglängd platsen. Detta occurs för våglängd skift större än ungefär en linjebredd (minst 600 fm för alla system som undersökts här).
7. Registrera utsignalen från återkopplingsstyrenheten vid 20 kHz med användning av en 24-bitars datainsamling kort. Exportera data som en textfil via datainsamling programvara.

3. Data Processing & Analysis

1. Fouriertransformen data i MATLAB.
2. Låg passera data med hjälp av en "brick-wall" filter med en cutoff vid 1 kHz för att ta bort den pålagda vibrationsfrekvensen 2 kHz (se Kompletterande Code File Screenshot 1).
3. Beräknings hack filtrera data med hjälp av en fönsterstorlek på 16 Hz. Obs: Detta görs för att avlägsna kända bullerkällor, i detta fall, 60 Hz elektroniska linjebrus och dess övertoner samt 100 Hz (som kommer från laser föraren) och dess övertoner (se Kompletterande Code File Screenshot 1).
4. Invers Fourier-transform data tillbaka till tidsdomänen.
5. Medianfilter data med hjälp av ett fönsterstorlek 1001 prover (se Kompletterande Code File Screenshot 2).
6. Leta stegändringar i resonansvåglängd med hjälp av steg hitta algoritm Kerssemakers et al. ^15.
7. Generera histogram av amplituden för varje bindningssteg.
8. Beräkna partikelstorlek med användning av Eq. (1) (se diskussion).

Representative Results

Partikelbindningshändelser är tydligt ses som stegliknande förändringar i resonansvåglängden för den microtoroid över tiden (figur 2A). Höjden på dessa steg visas som ett histogram i figur 2B. Figurerna 2-4 visar representativa spår från bindningen av exosomes (nanovesicles), 5 nm kiseldioxidpärlor, och ensamstående humana interleukin-2-molekyler, respektive. Det faktum att de stegliknande händelser skala med partikelstorleken visar att tekniken har utförts korrekt. Detta kan analyseras genom att generera ett histogram över steghöjder (figur 2B) och jämförelse av den maximala steghöjden observer teoretiska förutsägelser, såsom diskuteras nedan.

Figur 1. Blockschema för toroid sensorsystemet. Ljus från en avstämbar diodlaser är delad w ed en del skickas genom den optiska fibern att par ljus in i toroiden och den andra delen skickas direkt in i en ingång hos en auto-balanserad fotomottagare. Utsignalen från den optiska fibern skickas in i den andra ingången hos den automatiska viktad fotomottagare. Utsignalen från fotomottagare sänds till återkopplingsstyrenhet som modulerar laserljus för att lokalisera värdet på resonansvåglängden för den microtoroid. Som partiklar binder till toroid anges resonansfrekvensskift. Skillnaden mellan våglängd av laser och resonans våglängden för microtoroid skickas till en proportionell-integral-derivata styrenhet som gör att lasern för att matcha våglängden av toroiden så snabbt och smidigt som möjligt. Klicka här för att se en större version av denna figur.

p_upload / 53180 / 53180fig2.jpg "/>
Figur 2. Resonansvåglängdsändring över tiden som 20 nm pärlor binder till ytan av microtoroid. (A) Skift i resonans våglängden för microtoroid över tiden som 20 nm pärlor binder till ytan. (B) Histogram av höjderna (amplituder) av varje händelse resonansvåglängd steg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Resonansvåglängdsändring över tiden som individuella exosomer binder till ytan av microtoroid. Enskilda bindningshändelser ses som diskreta förändringar (steg) i resonansvåglängden över tiden."> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Resonansvåglängdsändring över tiden som 5 nm kiseldioxidpärlor binder till ytan av microtoroid. Partiklar följa toroidens yta via passiv adsorption. Partikelbindning händelser observeras som diskreta steg i resonansvåglängden toroidens över tiden. Desorption av en partikel ses som ett steg nedåt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Resonansvåglängdsändring med tiden, eftersom IL-2-molekyler binder till ytan av den microtoroid. Makromolekylära bindningshändelserses som diskreta steg i resonansvåglängden över tiden. Dessa steg liknar de i fig 4 som de två typerna av partiklar är av ungefär samma storlek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Som en partikel binder, resonans våglängd (λ) toroidens ökar. Om en partikel unbinds, motsvarande minskar resonans våglängd (en step-down händelse). Partikeldiametern (d) kan bestämmas genom histogram av amplituden för varje våglängdssteg. Höjden på varje våglängdssteg varierar på grund av storleksvariationer för den bundna partikeln och på grund av den plats på microtoroid där partikeln binds. Den maximala förändringen i resonansvåglängd (steg höjd) inträffar när partiklar binder vid ekvatorn av microtoroid där det elektriska fältet (E _{0, max)} är ett maximum. Denna maximala steghöjd (Δλ) är relaterad till partikeldiametern genom Eq. (1) ^8, där a är partikelradien, D är en dielektrisk konstant baserad på brytningsindex för den bundna partikeln och dess omgivande medium, är _Vm lägesvolymen light inom microtoroid fastställs genom finita elementsimuleringar ² och E ₀ (r _s) är amplituden av det elektriska fältet vid partikel ekvatorn också fastställas genom finita elementsimuleringar:

Invertering Eq. (1) indikerar att signalstyrkan (Δλ) skalor med partikelvolymen ^(3). Vår dielektriska faktor definieras som:

där är brytningsindex för det omgivande mediet, och är index refraktion av partikeln. Teoretiska beräkningar för partikelstorlek baserat på ekvation (1) samt ytterligare histogram och storlek calräkningarna presenteras i ^{2, 16.}

BLOM kan modifieras för snabbare spårning genom att öka frekvensen med vilken frekvens låsningsåterkopplingsstyrenheten spårar våglängden för microtoroid. Förfarandet Databehandlings kan modifieras genom användning av ett glidande medelvärde i stället för ett medianfilter, och bindningshändelser kan fortfarande återvinnas, men medianfiltret förorsakar stegkanter för att vara bättre bevaras. Begränsningar med denna teknik inkluderar det faktum våglängdsförskjutning av microtoroid vid partikelbindning beror på var på resonatorn partikel landar. Sålunda bekräftelse på bindningen av en enda partikel är beroende av genereringen av ett histogram för många diskreta bindningshändelser. Om inga distinkta bindnings händelser detekteras, ökning av saltkoncentrationen av lösningsmedlet hjälper.

Betydelsen av denna teknik med avseende på existerande metoder är att inga etiketter krävs för att utfråga målmolekylen.Selektiv bindning men kräver funktion sensorn med antikroppar. Andra fördelar är det faktum att sedan microtoroid resonatorer har större fånga områden jämfört med högkänsliga ytplasmonresonans metoder, partikel bindande händelser är mer sannolikt att inträffa. Dessutom, eftersom BLOMMA inte kräver fluorescerande taggar som kan ljusbleknings är BLOMMA kapabel av långa (> 10 sek) mätningar med snabb (millisekunder) tidsupplösning.

Kritiska steg i protokollet bland annat rikta den optiska fibern avsmalnande med microtoroid. När toroiden är nedsänkt i vätska, för mycket rörelse av fibern genom vätska kan orsaka avsmalningen att bryta, vilket slutade försöket. BLOMMA i sin nuvarande utformning är därför olämpliga för experiment på tidsskalan timmar. Dessutom, när den microtoroid har varit nedsänkt i flytande och partiklar binder, kvalitetsfaktorn (Q) sjunker oåterkalleligen över en tidsskala av timmar och topp locking kan så småningom bli instabil. I denna situation krävs en ny enhet. Eftersom vi dither vår laser frekvens i ett mycket litet område runt resonanstoppen, inte BLOMMA inte samtidigt skanna över hela resonansspektrumet och därför inte mäta förändringar i kvalitetsfaktorn i realtid som partiklar binder. Om man tittar på kvalitetsfaktorn före och efter bindning av endast ett fåtal partiklar, ser vi inte signifikant Q-faktor nedbrytning. Vi förväntar oss att detta beror på den ursprungliga orörda toroider har relativt låg Q-faktor (lastad Q i vatten ~ 1x10 ⁵ -5x10 ^6).

Vi noterar att laserinducerad fluktuation brus subtraheras med hjälp av auto-balanserad fotomottagare. Vi minimerar variationer i den optiska fibern mot toroidens genom att placera fibern i direkt kontakt på microtoroid. Dessutom, om PID-parametrar inte är korrekt inställda, kommer fluktuationer visas, det vill säga systemet kommer inte snabbt och Accurately spår våglängdsskift. Ziegler-Nichols inställnings regler kan användas för att korrekt ställa in PID inställningar ^14. Genom att följa de förfaranden som anges här bör det vara möjligt att detektera och storleksnanopartiklar som sträcker sig från hundratals nanometer ner till några nanometer, inklusive enskilda biologiska molekyler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tunable diode laser	Newport	TLB-6300
Laser controller	Newport	TLB-6300-LN
Frequency locking feedback controller	Toptica Photonics	Digilock 110
Auto-balanced photoreceiver	Newport	Model 2007
In-line polarization controller	General Photonics	PLC-003-S-90
24-bit data acquisition card	National Instruments	NI-PCI-4461
Recombinant human interleukin-2	Pierce Biotechnology	R201520
20 nm polystyrene beads	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage	Physik Instrumente	P-611.3
Optical table	Newport	VH3660W-OPT
Objective lens for imaging column	Navitar Machine Vision	1-60228
Imaging column (adaptor tube)	Navitar Machine Vision	1-60228
High-Res CCD camera for imaging column	Edmund Industrial Optics	NT39244