Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

Zusammenfassung

In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Methode zur Durchführung von Evans Blue Dye (EBD) Analysen an Zebrafischlarven. Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Charakterisierung der Integrität der Skelettmuskulatur und die Abgrenzung von Zebrafischmodellen für Muskeldystrophie und eine wertvolle Methode für die Entwicklung neuartiger Therapeutika.

Zusammenfassung

Das Zebrafischmodell ist ein aufstrebendes System zur Untersuchung neuromuskulärer Erkrankungen. Bei der Erforschung neuromuskulärer Erkrankungen ist die Integrität der Muskelmembran eine entscheidende Determinante für die Erkrankung. Bis heute zeigen zahlreiche neuromuskuläre Erkrankungen degenerierende Muskelfasern mit abnormaler Membranintegrität; Dies wird am häufigsten bei Muskeldystrophien beobachtet. Evans Blue Dye (EBD) ist ein lebenswichtiger, zelldurchlässiger Farbstoff, der schnell in degenerierende, geschädigte oder apoptotische Zellen aufgenommen wird. Im Gegensatz dazu wird es von Zellen mit einer intakten Membran nicht aufgenommen. Die EBD-Injektion wird häufig eingesetzt, um die Muskelintegrität in Mausmodellen für neuromuskuläre Erkrankungen zu ermitteln. Solche EBD-Experimente erfordern jedoch eine Muskeldissektion und/oder -sektion vor der Analyse. Im Gegensatz dazu wird die EBD-Aufnahme im Zebrafisch in lebenden, intakten Präparaten sichtbar gemacht. Hier zeigen wir eine einfache und unkomplizierte Methodik für die Durchführung von EBD-Injektionen und -Analysen in lebenden Zebrafischen. Darüber hinaus demonstrieren wir eine Co-Injektionsstrategie, um die Wirksamkeit der EBD-Analyse zu erhöhen. Insgesamt bietet dieser Videoartikel einen Überblick über die Durchführung von EBD-Injektionen und die Charakterisierung in Zebrafischmodellen für neuromuskuläre Erkrankungen.

Einleitung

Muskeldystrophien stellen eine Gruppe von weit verbreiteten und heterogenen menschlichen Muskelerkrankungen mit spezifischen histopathologischen Merkmalen^{dar 1,2}. Zu den typischen Symptomen, die mit dieser verheerenden Gruppe von Krankheiten in Verbindung gebracht werden, gehören Muskelschwäche, Muskeldegeneration, Verlust der Beweglichkeit und frühe Mortalität^1,3. Die primären Pathomechanismen von Muskeldystrophien sind der Verlust von Proteinen, die das Sarkolemma stabilisieren, Transmembrankomplexe verankern und die Zellsignalübertragung über die Membran^{vermitteln 4-6}. Zum Beispiel führt der vollständige Verlust des Proteins Dystrophin, eines primären Gerüstproteins des Dystrophin-Glykoprotein-Komplexes, zu einer Destabilisierung der Muskelmembran bei der Duchenne-Muskeldystrophie⁷. Aufgrund der Tatsache, dass die meisten Muskeldystrophien auf Mutationen in Proteinen zurückzuführen sind, die an der Verbindung zwischen der extrazellulären Matrix und dem sarkolemmalen Zytoskelett beteiligt sind, ist eine häufige Beobachtung auf zellulärer Ebene der Verlust der sakrolemmalen Integrität^8,9. Dieses Verständnis der primären Pathomechanismen, die mit Muskeldystrophien assoziiert sind, ist das Ergebnis langjähriger Forschung unter Verwendung von Tiermodellsystemen^2,10-15. Trotz Fortschritten auf diesem Gebiet gibt es jedoch immer noch begrenzte therapeutische Optionen für die Behandlung oder das Management des Spektrums der Dystrophie-Subtypen. Diese Einschränkung der praktikablen Therapien ist auf mehrere Schlüsselfaktoren zurückzuführen: 1) die Schwierigkeit der Gentherapiestrategien, 2) eine hohe Häufigkeit von De-novo-Krankheitsfällen und der entsprechende Mangel an übertragbaren Tiermodellen und 3) das Fehlen rigoroser Strategien, um die physiologischen Folgen mutmaßlicher Therapeutika mit klaren und reproduzierbaren Ergebnismaßen zu testen.

Um einige dieser Einschränkungen zu überwinden, verwenden zahlreiche Laboratorien, einschließlich unseres eigenen, den Zebrafisch als System, um menschliche neuromuskuläre Erkrankungen zu modellieren und zu untersuchen². Bisher haben sich Zebrafische als wertvolles Werkzeug in der Krankheitsforschung erwiesen. Das Zebrafischmodell wurde verwendet, um neuartige krankheitsverursachende Mutationen beim Menschen zu identifizieren und zu validieren^16,17, nicht charakterisierte krankheitsverursachende Mechanismen^{aufzuklären 17,18} und neue therapeutische Strategien^{zu identifizieren 12,19}. Diese Fortschritte wurden zum Teil durch die kanonischen Stärken des Zebrafischsystems erzielt, wie z. B. seine optische Klarheit, die einfache genetische Manipulation und die Fähigkeit, sich in großer Zahl zu vermehren²⁰. Zebrafische haben sich zusätzlich als geeignet für groß angelegte Wirkstoffscreenings^{erwiesen 21}, eine wertvolle Methode zur Identifizierung neuartiger Therapeutika^22-24. In Bezug auf die Erforschung von Muskelerkrankungen werden diese Stärken durch die Fähigkeit ergänzt, einzelne Skelettmuskelfasern des Zebrafisches über Dissoziation²⁵ zu isolieren, und durch die Fähigkeit, die Myofaserorganisation in vivo mit Hilfe des optischen Phänomens namens Doppelbrechung²⁶ zu untersuchen, das zusammen eine schnelle Bestimmung der makroskopischen Muskelintegrität ermöglicht. Unabhängig von diesen verfügbaren Dienstprogrammen ist eine kontinuierliche Weiterentwicklung des Tools erforderlich, um die Untersuchung voranzutreiben.

Wir und andere haben ein Protokoll für die EBD-Injektion und -Analyse im Zebrafischmodell angepasst. EBD ist ein lebenswichtiger, zelldurchlässiger Farbstoff, der von geschädigten, entarteten oder apoptotischen Zellen aufgenommen und dann unter Fluoreszenz^{sichtbar gemacht wird 27}. Bisher wurde die EBD-Analyse ausgiebig zur Analyse der Muskelmembranintegrität in Mausmodellen für Skelettmuskel- und Herzerkrankungen eingesetzt^8,9,27. Bei Säugetierpräparaten erfordert der entnommene Muskel jedoch in der Regel ein mühsames Schneiden oder Sezieren vor der Analyse. Beim Zebrafisch ist eine direkte Analyse in hoher Zahl mit lebenden und intakten Tieren möglich. In diesem Videoartikel zeigen wir die Methodik zur Durchführung von EBD-Injektionen und -Analysen in lebenden Zebrafischlarven mit repräsentativen Bildern der EBD-Aufnahme in der Zebrafischdystrophie-Mutantenlinie sapje^15,28. Darüber hinaus stellen wir eine Co-Injektionsstrategie vor, die eine bessere Quantifizierung von EBD-Präparaten ermöglicht.

Protokoll

1. Herstellung von Agar Injection Plates (Dauer: 45 min)

1. Kochen Sie 2% bis 3% Agarose in E3 Medien und ermöglichen Lösung leicht auf der Bank zu kühlen. Anmerkung: Die Anzahl der Einspritzplatten vorbereitet bestimmt die Menge an Agarose erforderlich. Jedes Injektionsplatte muss ca. 35 ml der Agarose-Lösung.
2. Nach dem Auskochen die Agarose zu kühlen, bis die gewünschte Temperatur erreicht ist (z. B. ⁴⁵ ° C) nach der Spritzgießform Herstellers.
3. Gib ca. 35 ml der Agarose in einen 100-mm-Schale abgekühlt.
4. Platzieren Sie ein Ende der bevorzugten Spritzgussform in Lösung, dann lag Rest der Form auf Agarose-Lösung (dies wird dazu beitragen, das Auftreten von Luftblasen).
5. Damit die Agarose-Lösung entweder bei RT ^oder bei 4 ° C für ca. 30 min verfestigt.
6. Verwenden Sie einen Spachtel, um ein Ende der Form aus dem festen Agarose zu trennen. Entfernen Sie langsam den Rest des m alt.

2. Herstellung von Evans Blue-Farbstoff (EBD) Injection Mix (Dauer: 30 min)

1. Einen 1% Vorrat an EBD in 1X Ringerlösung (155 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM CaCl _2; 1 mM MgCl _{2; 2} mM Na _{2 HPO 4,} 10 mM HEPES, 10 mM Glucose; pH 7,2), welches bei RT gelagert werden können.
2. Machen Sie eine Stammlösung von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -Dextran MW 10.000 kDa bei 25 mg / ml in 1X Ringer-Lösung und bei -20 ^{° C}
3. Bereiten Injektionsmischung durch Verdünnen EBD auf 0,1% direkt im Stammlösung von FITC-Dextran Lager (dh für eine endgültige Arbeitsvolumen von 100 & mgr; l. Mischen Sie 10 ul 1% EBD in 90 & mgr; l FITC-Dextran Lager).
4. Gründlich Wirbelinjektions Mix (es sollte grün) und vor direktem Licht zu halten durch Umwickeln Injektionsmischrohr mit Aluminiumfolie.

3. EBD Injektionspräparat (Dauer: ca. 30 min)

ent "> Hinweis: Protokoll funktioniert am besten mit Larven aus 3-7 Tage nach der Befruchtung (DPF).

1. Pre-warmen Einspritzplatte auf RT.
2. Einrichten Einspritzvorrichtung durch Anordnen von Mikromanipulator auf Metallplatte und stehen neben dem Mikroskop wird zur Injektion verwendet. Schalten Sie Luft angetrieben Mikroinjektion Controller. Hinweis: Die bevorzugte Injektionssystem wird von Labor variieren und sollte Ergebnis der Analyse nicht ändern.
3. Zurück zu füllen Injektionsnadel mit rund 2-4 ul der EBD-Mix.
4. Kalibrieren Injektionsvolumen etwa 5 nl der EBD-Mix. Hinweis: Injektionsvolumen Kalibrierung wird am Kalibrierungsverfahren abhängen. Ein Kolben angetrieben Injektion kann direkt an einen bestimmten Einspritzmenge eingestellt werden, wohingegen Gasdruck-Injektoren die Einspritzmenge über Volumen-Bolus mit dem Einsatz von einem Mikrometer kalibriert benötigen.
5. Wet Spritz Platte mit 1X Ringer-Lösung und entfernen Sie überschüssiges aus Brunnen.
6. Pre-Treat-Larven, die mit 0,04% Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat salt (Tricaine) in 1X Ringerlösung Larven vor dem Beginn der Einspritzung zu immobilisieren verdünnt. Hinweis: Die Gewährleistung der Larven sind komplett unbeweglich ist wichtig, da die Injektions ist schwierig mit jeder Restbewegung.
7. Zeigen anästhesiert Larven in die Vertiefungen der Agar-Einspritzplatten unter Verwendung einer Glaspipette. Stellen Sie sicher, dass die Larven sind vollständig in den Brunnen und auf ihrer Seite liegen. Anmerkung: Die Zahl der Larven pro Vertiefung bis zu den Experimentator.
8. Nach Larven werden in den Vertiefungen setzen, entfernen Sie überschüssige Ringer-Lösung, um Larven Bewegung innerhalb der gut zu minimieren. Lassen Sie eine Restmenge an Lösung, so dass Larven nicht zu dehydrieren.

4. Pericardial Injektion von Zebrafisch-Larven mit EBD (Time: Abhängig von der Anzahl der Larven injizierende, schätzungsweise 1-3 h)

1. Legen Sie die Einspritzplatte, die die Larven auf einem Binokular, wo die Injektionen durchgeführt.
2. Positionieren Sie die Injektionspipette Nadel enthält,die EBD-Mix über einen Zebrafisch-Larven.
3. Re-Position der Einspritzplatte durch Drehen, so dass die Injektionsnadel in der Nähe Herzen der Larven und ^etwa 45 ° ventral von der Vorwärts-Rückwärts-Achse.
4. Einfügen der Injektionsnadel in die gemeinsame Cardinalvene (CCV) im Bereich der Vene am vorderen Teil des Eigelbs, wo die Ader wird zunächst Drehen in dorsaler Richtung (Figur 1). Hinweis: Eine Vergrößerung von bis zu 40x kann nützlich sein, deutlich sehen, die CCV sein.
5. Injizieren Sie 5 nl der EBD-Mix und halten Injektionsnadel in Position für 5-8 Sekunden, um sofortige Leckage von EBD-Mix zu minimieren. Anmerkung: Eine gute Einspritzung Farbstofffärbung in den Herzkammern gesehen (Figur 1) aufweisen. Wenn EBD Mischung nicht im Herz beobachtet, dann Einspritzen einer zusätzlichen 5 nl des EBD Mischung kann ausreichen, um die Farbstoffaufnahme induzieren. Alternativ kann die Embryos verworfen.
   Hinweis: In einigen Situationen kann der Herzschlag zu stoppen. Wenn diese occurs, weiterhin die Larven für 20-40 sec überwachen. In der Regel nimmt der Herzschlag, wie der Farbstoff durch das Kreislaufsystem bewegt.
6. Gehen Sie zum nächsten Larven und wiederholen.
7. Identifizierung erfolgreich injizierten Embryonen durch Beobachten der Gegenwart von FITC-Dextran in die Vaskulatur unmittelbar nach der Injektion (Figur 2).

5. Inkubation und EBD Aufnahme (Time: 4-6 h)

1. Nachdem die gewünschte Anzahl von Larven injiziert Rück injiziert Larven auf 1X Ringerlösung ohne Tricaine in 100 mm-Schalen.
2. Halten Sie Speisen in Aluminiumfolie eingewickelt. Hinweis: Halten Sie injizierten Larven in der Dunkelheit deutlich erhöht Überlebensraten und gewährleistet die größte Konsistenz in der Signalstärke. Wickel in Aluminiumfolie ist besonders wichtig für die Zeitspanne, die die Larven sich außerhalb des Inkubators.
3. Erlauben Larven bei 28,5 ^{° C} für 4-6 Stunden inkubiert, um eine ausreichende EBD Aufnahme zu gewährleisten.

6. Visualisierung der EBD im Muskel (Time: Abhängig von der Anzahl der Larven injizierende und Art der Mikroskopie, geschätzte 0,5 bis 3 h)

1. Vor der Bilderzeugung, betäuben die Larven mit 0,04% Tricaine um Bewegung zu verhindern.
2. Ansicht Larven unter rote Fluoreszenz zu bestimmen, ob EBD-Aufnahme in Skelettmuskel (3) auftritt.

Ergebnisse

Die EBD Injektion Mischung wurde bei 3 dpf in die CCV von sapje homozygote Mutanten und Wildtyp-Geschwister injiziert. Injektionen, die den Herzkammern (1B) gefüllt wurden dann für eine erfolgreiche Injektion durch die Visualisierung von FITC-Dextran in die Vaskulatur unter grüne Fluoreszenz (Figur 2) untersucht.

Nach 4 Stunden Inkubationszeit wurde EBD Aufnahme an der Somitenstufe mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Wildtypgeschwister zeigte keine EBD Fluoreszenz innerhalb sichtbare Muskelfasern (3A), wohingegen die sapje homozygoten Mutanten zeigten EBD Aufnahme, was Schäden an der Muskelmembran ¹⁵ (3B).

Abbildung 1. Spritzen EBD Injektion Mischung in den gemeinsamen Kardinal Vene (CCV) eines Zebrafisch embryo. (A) nicht-injizierten Embryo. Pfeil zeigt den idealen Standort für CCV Injektion. (B) Erfolgreiche Injektion in den CCV. Der Farbstoff dringt in die Herzkammern (Pfeil) und beginnt, durch das Gefäßsystem gepumpt werden. (C) Ein erfolgloser CCV Injektion wird in einigen oder allen der Farbstoff Eingabe der Dottersack des Embryos (Pfeil) zur Folge haben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Die Embryos können für eine erfolgreiche Injektion durch Beobachtung FITC-Dextran Verteilung unter grüne Fluoreszenz im gesamten Gefäßsystem unmittelbar nach der Injektion und vor der EBD Aufnahme sortiert werden.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: EBD wird durch Fasern mit beschädigten Membranen (A) Wildtyp Geschwistern zeigt keine EBD Fluoreszenz in Muskelfasern entnommen werden.. (B) Sapje ​​homozygote Mutante mit EBD Fluoreszenz in mehreren Muskelfasern (Pfeile). Alle Larven wurden mit dem EBD Injektions Mischung injiziert und nach 4 h Inkubation bei 3 dpf analysiert. Geschwister und Mutanten wurden durch Muskelfaserablösung vor dem CCV Injektions sortiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Zebrafisch als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der neuromuskulären Erkrankungen ^2,29 Schwellen. Bis heute hat der Zebrafisch-System verwendet worden, um neue Muskel krankheitsverursachende Mutationen ^16,17,30 validieren, aufzuklären neue Pathomechanismen ^{18 und} identifizieren potenziell neue Therapeutika ^12,24. Diese gemeinsamen Anstrengungen haben den Nutzen der Zebrafisch die menschliche neuromuskuläre Krankheiten Modell etabliert. Doch trotz der Fortschritte mit Zebrafischen und Säugetieren Modellen, gibt es begrenzte Behandlungsmöglichkeiten für Patienten in das breite Spektrum der neuromuskulärer Krankheiten. Daher besteht eine hohe Nachfrage nach Therapieentwicklung für diese Gruppe von verheerenden Krankheiten. Parallel zu dieser Nachfrage nach Therapeutika ist die entsprechende Notwendigkeit einer laufenden experimentellen Innovationen sowie rigorose Analyse, neue Tiermodelle und vermeintlichen therapeutischen Strategien zu überprüfen.

EBD-Analyse wird häufig in Maus-Modellen verwendetStudie Gewebe und Zellschäden im Gehirn, Herz und Skelettmuskel ^27,31. Am auffälligsten ist, EBD ausgiebig in Mausmodellen von verschiedenen Muskeldystrophie Subtypen verwendet werden, um den Schweregrad der Muskelmembran Instabilität zeigen und ⁸ beschädigen. Die Verwendung von EBD, um Muskelmembranschäden aufzudecken ist eine unterstützende Parameter Gründung Ähnlichkeiten des Tiermodell für das menschliche Krankheitszustand ^9. Die Macht der EBD in Maus hat mehrere Labors, einschließlich unserer eigenen führte, zu entwickeln und anzuwenden, um EBD Zebrafisch Modelle von neuromuskulären Erkrankungen. Aufgrund der Anwendbarkeit der EBD-Analyse wird diese Technik aktiv umgesetzt, um Zebrafisch-Modelle auf den menschlichen Krankheitszustand ^{11,15,22,24,32} mauern. Larven mit beschädigten Muskelmembranen müssen EBD-Aufnahme und damit rote Fluoreszenz in Muskelfasern. Fluoreszenz in dem Raum zwischen den Fasern beobachtet, jedoch nicht im einzelnen Muskelfasern kann auch informative Faser Ablösen von der Basalmembran in t seiner Abwesenheit von Membranschäden, die nützliche diagnostische Details. EBD-Analyse hat mögliche Anwendung außerhalb Tiermodellvalidierung. Die Bemühungen von unserem Labor haben kürzlich gezeigt, dass EBD-Analyse ist von Vorteil bei der Validierung potenziell neuartigen Therapien ^24. Feststellung, ob potenzielle therapeutische Behandlungen reduzieren oder abzuschaffen EBD-Aufnahme in neuromuskuläre Erkrankung Modelle können relevante therapeutische Wirkung ⁸ bedeuten. Diese Art der Analyse kann helfen, die Mechanismus (n) von Therapeutika und dehnt die Anwendung der EBD-Analyse.

Wie bei vielen Techniken, hat EBD Analysen haben mehrere Einschränkungen, die während experimentellen Design und Praxis eingehalten werden. Zum Beispiel kann es schwierig sein, die CCV identifizieren aufgrund der Verdickung des Gewebes mit dem Alter. Zusätzlich ist es einfach zu Larven in Vorbereitung beschädigen vor und während des perikardialen Injektion Reduktions experimentellen Zählungen und erhöhen den Bedarf an einer großen Anzahl von Larven prep.Außerdem können mechanische Schäden die Larven während der Handhabung und Einspritzung erfolgen in false positives Ergebnis als beschädigt Muskel aufnehmen kann EBD. Um einige dieser Hindernisse zu überwinden, haben wir ein Co-Einspritzstrategie in diesem Video-Artikel, der eine einfache und zuverlässige Identifikation von Larven mit sofort erfolgreich Farbstoff Infusion nach der Injektion und vor der anschließenden Analyse erlaubt beschrieben. Die FITC-Dextran Coinjektion Steuerungen für erfolgreiche Injektion indem Bestätigung EBD im Gefäßsystem vor der Aufnahme durch die Muskelfasern. Dies kann besonders nützlich sein, da EBD Fluoreszenz wird nach mehreren Stunden, wenn nicht in den Muskelfasern gesammelt stark diffuse in Larven; Als solches ist es schwierig zu erkennen sein. Darüber hinaus fehlt der CCV und Injizieren EBD in den Dotter oder Körperhöhle kann nach der Inkubation ergeben diffuse rote Fluoreszenz ähnlich Embryonen zu steuern, noch mit der verringerten Wahrscheinlichkeit der Aufnahme durch beschädigte Muskelfasern. Gemeinsam sind diese Höhlenats vorschlagen EBD Injektion erfordert Geduld und Praxis, um konsistente und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.

In all beschreiben wir eine praktische und einfache Methode, um EBD-Analyse auf Zebrafisch-Larven durchzuführen. Bisher hat sich die Verwendung von Zebrafisch als Modellsystem, vor allem als Mensch Krankheitsmodell, wurde schnell wachsenden. Diese Expansion ist zum Teil auf die weitere Entwicklung und Veränderung der experimentellen Techniken, die auf den gegenwärtigen Vorteile der Zebrafisch-System zu verbessern. Die EBD Injektionstechnik stellt eine zusätzliche und leistungsfähiges Werkzeug, um eines Forschers Arsenal für die Validierung und Untersuchung der Zebrafisch Muskelkrankheitsmodellen. Die laufende Umsetzung und Änderung dieser Technik hat das Potenzial, zu helfen aufzudecken neuer Therapiestrategien sowie krankheitsverursachenden Mechanismen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran MW 10.000	Sigma	FD10S
Evan's Blue Dye	Sigma	E2129
Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz	Sigma	A5040
100 mm Petrischale	Fischerbrand	FB0875712	Spritzgussboden
Dünnwandige Glaskapillaren	World Precision Instruments	TW100F-4	Für Injektionsnadel
Agarose	Bioshop	AGA001	Spritzgussform
Mikrospritzgussform	Adaptive Science Tools	TU-1	Spritzgussform
Natriumchlorid	Bioshop	SOD001	Ringer-Lösung
Kaliumchlorid	Bioshop	POC888	Ringer-Lösung
Magnessiumchlorid-Hexahydrat	Sigma	M2670	Ringer-Lösung
Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat	Sigma	S9638	Ringer-Lösung
HEPES	Sigma	H4034	Ringer-Lösung
Glukose	BioBasic	GB0219	Ringer-Lösung
Calciumchlorid	Sigma	C1061	Ringer-Lösung