Translationale Krebsforschung ist auf die Extraktion von menschlichem Gewebe angewiesen. Viel Arbeit wurde in die Optimierung der Extraktionsmethoden für die ex vivo-Analyse gesteckt. Hier beschreiben wir Gewebeaufbereitungsmethoden, die eine maximale Datenausgabe aus begrenzten Proben ermöglichen.
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Methodenartikel
Arbeiten mit menschlichen Geweben für Translationale Krebsforschung
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Medizinische Forschung zum Nutzen des Menschen wird durch die Notwendigkeit menschlicher Gewebe und Probanden stark behindert. Bei der Einholung der Zustimmung für menschliche Proben müssen wertvolle Proben jedoch mit größter Sorgfalt behandelt werden, um die Integrität von Organen, Geweben und Zellen in höchstem Maße zu gewährleisten. Leider erfordert die Gewebeverarbeitung per definitionem die Extraktion von Geweben aus dem Wirt, eine Veränderung, die großen zellulären Stress verursachen und große Auswirkungen auf nachfolgende Analysen haben kann. Diese Spannungen könnten dazu führen, dass die Probe nicht mehr repräsentativ für die Stelle ist, an der sie entnommen wurde. Daher muss bei der Verarbeitung dieser Proben ein strenges Protokoll eingehalten werden, um die Repräsentativität zu gewährleisten. Der/die gewünschte(n) Assay(s) muss ebenfalls berücksichtigt werden, um sicherzustellen, dass eine optimale Technik für die Probenverarbeitung verwendet wird. Hier wird ein Protokoll für die Gewebegewinnung, -verarbeitung und verschiedene Analysen skizziert, die an aufbereitetem Gewebe durchgeführt werden können, um die nachgelagerte Produktion von begrenzten Gewebeproben zu maximieren.
Einleitung
Medizinische Forschung immens aus dem Studium der sowohl menschliche Zelllinien und Tiermodellen profitiert. Zelllinien ermöglichen eine bessere Steuerung der Komponenten in einem System, sowie die Verwendung von Zellen aus dem richtigen Organismus. Arbeiten mit menschlichen Zellen, während repräsentativer, präsentiert eine drastisch vereinfacht Momentaufnahme der Mechanismen, die für die Gesundheit und Krankheit verantwortlich sein können, denn Zelllinien möglicherweise nicht die Auswirkungen von anderen Zellen, Stromazellen Komponenten und Organe, die Reaktionen 1 auswirken können rekapitulieren. Auf der anderen Seite, Tiermodelle, die aber nicht völlig ....
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Protokoll
Ethik-Anweisung: Dieses Protokoll wird von der University of Texas MD Anderson Cancer Center genehmigt.
1. Probenbeschaffung
- Sammeln Forschung Gewebeproben von Tumorüberschuss und damit verbundene normale Gewebe 10-12. Lagern Sie die Proben auf nassem Eis, um Autolyse zu vermeiden.
- Senden Sie alle Gewebe, medizinische Geräte und Fremdkörper während eines chirurgischen Eingriffs an der Abteilung für Pathologie für notwendige Untersuchung entnommen, um eine pathologische Diagnose zu erleichtern.
- Griff Gewebe für die Forschung in Übereinstimmung mit den geltenden Forschung und Gewebebanken Richtlinien und Verfahren zugeo....
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Ergebnisse
Die Ergebnisse angezeigt unten zeigen Durchflusszytometrie Gating-Strategie für die breite Immun Phänotypisierung auf einem verarbeiteten Melanomtumor. Der Tag der Färbung wurde Gewebeprobe unter 225 RPM Dreh verdaut und homogenisiert mit Collagenase I und DNase I Inkubation für 60 min bei 37 ° C. Nach dem Verdau wurde die Zellsuspension durch ein 70 um Sieb filtriert, um Zelltrümmer zu beseitigen, und die Zellen wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern Durchflusszytometrie für die Immunzelle Phänotypisierung .......
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Diskussion
Letztlich müssen die Verfahren zur Verarbeitung von durch die gewünschte Hypothese diktiert und erwarteten technischen Assays (Figur 1) ausgeführt werden kann. Der folgende Abschnitt dient als Überblick über potenzielle Assays, die auf solchen Gewebeschnitten durchgeführt werden können, zu beschreiben. Es ist keineswegs eine erschöpfende Übersicht, sondern soll Führungsprobenverarbeitungsmethoden und Wahl der Downstream-Assays mit der Beschreibung Techniken und Listing ihre Stärken und Schwächen zu helf.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der philanthropischen Beiträge der John G. und Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grants # 0727033) und dem Melanoma Research Alliance unterstützt. Die Autoren danken der University of Texas MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank (ITB) für die Koordinierung der Gewebeverteilung und Sammlung und die Erleichterung der translationalen Forschung, wie Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, dem MD Anderson Cancer Center Department of danken, sowie Pathologie und der Melanom-Mond-Schuss-Programm. Schließlich sind die Autoren danken allen Patienten und Familien, die von Melanom betroffen anzuerkennen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Nadeln | BD | 305167 | |
| Einwegskalpelle | aus Edelstahl Miltex | 4-410 | |
| Gewebekulturschale | Corning | 353003 | |
| Biopsiekassetten | Thermo Fisher | 58931 | |
| RNA-stabilisierende Lösung | Ambion | AM7021 | |
| 1,5 ml Eppendorf Röhrchen | Phenix | MAX-815 | |
| 50 ml | Tuben Corning | 430290 | |
| 10% neutral gepuffertes Formalin | StatLab Medical Products | 28600-5 | |
| Formalinbehälter | Fisher Scientific | 23-032-059 | |
| Optimale Schnitttemperatur Lösung (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura Finetek | 4557 | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Kollagenase I | Roche | 11088793001 | |
| 70μ m Zellsiebe | BD Bioscience | 352350 | |
| 96 Well runde Bodenplatten | Corning | 3799 | |
| Lebende/Tote Fleckenlösung | Life Technologies | L34957 |
Referenzen
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Cell Biology. Fixing problems with cell lines. Science. 346, 1452-1453 (2014).
- van der Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies. , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).
- McCabe, P. M., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
