Das Ziel dieses Video ist zu zeigen, wie automatisierte DNA-Extraktion aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Referenz-Standard-Zelllinien und digitale Tröpfchen PCR (ddPCR) Analyse seltene Mutationen in einer klinischen Umgebung detektieren auszuführen. Nachweis von Mutationen in FFPE-Proben zeigt, die den klinischen Nutzen ddPCR in FFPE-Proben.
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Methodenartikel
Verwendung digitaler Droplet PCR zu BRAF V600E Mutationen in Formalin-fixierte Paraffin Reference Standard-Zelllinien Detect
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
ddPCR ist eine hochempfindliche PCR-Methode, die ein Wasser-Öl-Emulsionssystem verwendet. Mit Hilfe eines Tröpfchengenerators wird eine extrahierte Nukleinsäureprobe in ~20.000 nanogroße Wasser-in-Öl-Tröpfchen aufgeteilt, und die PCR-Amplifikation erfolgt in einzelnen Tröpfchen. Der ddPCR-Ansatz besteht in der Identifizierung von Sequenzmutationen, Veränderungen der Kopienzahl und ausgewählten strukturellen Umlagerungen, an denen Zielgene beteiligt sind. Hier demonstrieren wir den Einsatz der ddPCR als leistungsfähige Technik zur präzisen Quantifizierung seltener BRAF V600E-Mutationen in FFPE-Referenzstandardzelllinien, die bei der Identifizierung von Krebspatienten hilfreich ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die ddPCR-Technik das Potenzial bietet, die spezifischen seltenen Mutationen in verschiedenen Genen in verschiedenen Arten von FFPE-Proben genau zu profilieren.
Einleitung
Die Akkumulation von genetischen Mutationen in regulatorischen Schlüsselgenen verändert normalen Zellprogrammierung wie Zellproliferation, Differenzierung und das Überleben, die zu Krebs führen. 1 Die RAS-RAF-MAP-Kinase-Weg vermittelt zellulären Reaktionen auf Wachstumssignale. Onkogenen BRAF-Mutationen können vom Fahrer Mutationen des BRAF-Gens, der die BRAF oncoprotein verursachen können überaktiven 2 zu werden, zur Folge haben. Mutationen im BRAF-Gen auch in überaktiven nachgeschalteten Signal über MEK und ERK 3, die wiederum führt zu einer übermäßigen Zellwachstum und -proliferation unabhängig Wachstumsfaktor-ver....
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Protokoll
1. DNA-Extraktion aus FFPE Reference Standard-Zelllinien
Hinweis: Bei diesem Verfahren wurde die DNA-Extraktion aus FFPE Referenz-Standard-Zelllinien (HD598, HD593, HD617, HD273 und Wildtyp (WT)) unter Verwendung der FFPE Gewebe-DNA-Isolation Kit, wie in der unten beschriebenen Protokoll durchgeführt. Automatisierte DNA-Extraktion wurde nach Angaben des Herstellers für die gesamte DNA-Isolierung erreicht.
- Verwendung eines Mikrotoms und die ursprüngliche FFPE Block manuell frische Abschnitte vor der DNA-Extraktion und Analyse vorzubereiten, nach festgelegten Verfahren. Dass die Probe-Eingang für den Gewebeabschnitt (en) analysie....
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Ergebnisse
Für unsere ddPCR Analyse, untersuchten wir die BRAF-V600E-Mutation FFPE Referenz-Standard-Zelllinien. Die Tröpfchen Leser verbindet sich mit einem Laptop-Computer mit Datenanalyse-Software. Jeder einzelne Tropfen wird auf der Basis der Fluoreszenzamplitude als entweder positiv oder negativ definiert. Die vom Hersteller bereitgestellten Software ermöglicht außerdem ein benutzerdefinierter Grenz eingegeben werden, um den Grenzbereich zwischen der positiven und negativen Tröpfchen zu definieren. Die Anzahl der pos.......
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Diskussion
Hier beleuchten wir die Anwendbarkeit der ddPCR und DNA-Isolierung aus FFPE Referenzstandard Zelllinie Proben für eine bestimmte Genmutation Beurteilung. In dieser Studie wird TPS automatischen DNA-Isolierungsverfahren verwendet werden, der leicht angepasst werden kann, automatisiert, und kann bis zu 48 verschiedene Proben gleichzeitig unterzubringen, so dass für größeren Maßstab Experimente und niedrigere Variabilität. Eine der Beschränkungen der DNA-Isolierung in der vorliegenden Arbeit ist, dass jedes FFPE Probe ist .......
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Offenlegungen
Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim und Junge Deug Kim sind Mitarbeiter von ABION CRO.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der F & E-Programm für die Gesellschaft der National Research Foundation (NRF), durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (Grant No 2013M3C8A1075908) finanziert unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD-Gerät | Siemens | 10701001 | Automatisiertes DNA-Isolationsgerät |
| QX200 Tröpfchengenerator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Konventionelles PCR-Gerät mit Rampenzeiteinstellung | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR-Plattenversiegeler | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft-Software | Bio-Rad | ||
| DNA-Isolationskit | |||
| VERSANT Reagenzien für die Gewebevorbereitung Kasten 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Reagenzien für die Gewebevorbereitung Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE Tipps | Siemens | ||
| ddPCR Mutationsanalyse | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2-fache Konzentration |
| DG8 Kartusche | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Tröpfchengeneratoröl | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Dichtung | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Tröpfchen-Leseöl | Bio-Rad | BR-186-3004 |
Referenzen
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B.,
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Nachdrucke und Genehmigungen
