Methodenartikel

Modellierung Enzephalopathie praematurorum Mit Prenatal Hypoxie-Ischämie mit Intra-Frucht Lipopolysaccharide bei Ratten

DOI:

10.3791/53196

⸱

20. November 2015

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1Department of Pediatrics, University of New Mexico, 2Department of Neurosciences, University of New Mexico, 3Department of Neurosurgery, Boston Children's Hospital, 4Department of Neurology, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Frühgeborenen-Enzephalopathie umfasst die Anomalien des Zentralnervensystems, die mit Verletzungen durch Frühgeburten verbunden sind. Dieser Bericht beschreibt ein klinisch relevantes Rattenmodell der in utero transienten systemischen Hypoxie-Ischämie und der intraamniotischen Lipopolysaccharid-Verabreichung (LPS), das die Chorioamnionitis nachahmt, und den damit verbundenen Einfluss von infektiösen Reizen und Plazenta-Unterperfusion auf die ZNS-Entwicklung.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enzephalopathie bei Frühgeborenen (EOP) ist eine Bezeichnung, die das zentrale Nervensystem (ZNS) umfasst Anomalien mit Frühgeburt assoziiert. Um beste Voraus translationale Ziele und entdecken Sie neue therapeutische Strategien für Hirnverletzung mit Frühgeburt assoziiert, müssen präklinischen Modellen EoP ähnliche Mechanismen gehören der pränatalen globalen Verletzungen bei Menschen beobachtet und beinhalten mehrere Komponenten der mütterlichen Plazenta und Fötus-System. Im Idealfall sollten Modelle ein ähnliches Spektrum von funktionellen Defiziten in der reifen Tier zu produzieren und zu rekapitulieren mehrere Aspekte der Pathophysiologie. Die menschliche systemische Plazentaperfusion Fehler, Minder Plazenta und / oder Chorioamnionitis mit pathogen-induzierten Entzündung in der frühen Frühgeburt assoziiert imitieren, entwickelten wir ein Modell der pränatalen transiente systemische Hypoxie-Ischämie (TSHI) in Kombination mit intraFrucht Lipopolysaccharid (LPS). Bei trächtigen Sprague Dawley Ratten, TSHI über Gebärmutterarterien-Okklusionsvorrichtung on embryonalen Tag 18 (E18) induziert eine abgestufte Plazentaminder Defekt mit zunehmender ZNS-Schäden in den Fötus verbunden. Wenn bei innerFrucht LPS-Injektionen kombiniert wird Plazenta Entzündungen erhöht und ZNS-Schäden ist mit assoziierten weißen Substanz, Gang- und Abbildungs ​​Anomalien verschärft. Pränatale TSHI und TSHI + LPS pränatalen Beleidigungen treffen mehrere der Kriterien eines EoP Modell einschließlich rekapituliert die intrauterine Beleidigung, was zu Verlust von Neuronen, Oligodendrozyten und Axone, Verlust der Anschlussplatte und Funktionsdefizite bei erwachsenen Tieren, die denen bei Kindern extrem geboren beobachtet imitieren Früh. Darüber hinaus ermöglicht die Präparation der Entzündung, die durch divergierende Verletzungstypen induzierten dieses Modell.

Einleitung

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Mit über 12% der Kinder in den Vereinigten Staaten vor der 37. Woche geschätzt Gestationsalter 1 geboren, ist perinatalen Hirnschädigung (PBI) von Frühgeborenen eine wesentliche Ursache für bleibende Behinderung. PBI von Frühgeburten, die auch als Enzephalopathie praematurorum (EOP), wirkt das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS). ZNS-Verletzung oft beginnt in utero und durch vorgeburtliche Verfahren einschließlich chorioamnionitis und postnatalen Komplikationen wie Hypoxie und Sepsis verstärkt. PBI von systemischen Beleidigungen ändert Entwicklung des Nervensystems und führt zu Zerebralparese, Epilepsie, kognitive Verzögerung und zahlreichen neuropsychiatrischen Störungen, die emotionale Regulation, Gedächtnis und exekutive Funktion 1,2. Obwohl große Fortschritte erzielt wurden, bleibt, wie die zellulären und molekularen Folgen der ZNS-Verletzung von Frühgeburten zu übersetzen, um die Vielzahl der neurologischen Folgen bei Kindern, die Frühgeborenen geboren werden ein begrenztes Verständnis. Dieser Mangel an Wissen HinterInnen Echtzeit-Diagnose von ZNS-Verletzungsschwere und informierte Dosierung von Schwellen Interventionen. Zusätzlich altersgerechte therapeutische Strategien für diese gefährdete Patientengruppe bleibt schwer fassbar.

Intrauterine Entzündung ist sehr häufig in extremen Frühgeburt und eine komplexe fetalen-mütterlichen Plazenta-Entzündungskaskade 3. Intrauterine Infektion oft subklinisch. Spezifische Plazenta Ergebnisse stehen im Einklang mit einer akuten Entzündung oder histologische Chorioamnionitis, sind entscheidend für den fetalen Entzündungsreaktion und fallen mit Hirnverletzung mit Frühgeburt 3-5 verbunden. Tatsächlich hat die fetale Entzündungsreaktion deutliche klinische Implikationen für die langfristigen Ergebnisse von Frühgeburten. Säuglinge, die klein für das Gestationsalter (SGA), der Erfahrung oder Infektion sind besonders anfällig für neurologische Defizite 3,4. Chorioamnionitis ist eine typische pathologische Diagnose folgenden Frühgeburt 6,7, und die histologische Untersuchung zeigt Anzeichen einer Entzündung in 70% der Plazenten von Säuglingen sehr frühgeborenen 4 geboren. Ferner wird Chorioamnionitis mit kognitiven Beeinträchtigungen nach zwei Jahren 8 verbunden. Der Nachweis der mütterlichen Gefäßminder in der Plazenta von Säuglingen extrem Frühgeborenen geboren wird auch mit zerebraler Lähmung in der Kindheit 9 verbunden. Die synergistische Wirkung der Chorioamnionitis und Plazenta Perfusionsdefekte ist gut mit dem bemerkenswert hohen Risiko für abnorme neurologische Ergebnisse in dieser Patientengruppe bei zwei Jahren 10,11 dargestellt.

Die menschliche systemische Plazentaperfusion Mängel und Chorioamnionitis mit pathogen-induzierten Entzündung zu imitieren, entwickelten wir ein Modell der pränatalen transiente systemische Hypoxie-Ischämie (TSHI) in Kombination mit intraFrucht Lipopolysaccharid (LPS) bei Ratten. Unser Ziel war es unser Modell der TSHI allein bei Ratten 12-16 Anpassung an intrauterine Entzündung sind,In den präklinischen Modellierung von ZNS-Verletzung mit Frühgeburt assoziiert zu erleichtern. TSHI allein hat anhaltende Verlust von Oligodendrozyten Linie Zellen, kortikalen Neuronen zeigte, erhöhte Zelltod und erhöhten proinflammatorische Zytokin Ebenen, mit fortschrittlichen ischämischen Intervalle, die zu einer abgestuften Verletzungsmuster im Einklang mit der pränatalen Hirnverletzung 16. Änderungen an den ischämischen Komponenten dieses Modells haben auch gezeigt, Defizite in der Speichercodierung, Kurz- und Langzeitgedächtnis und einem milden Muskel-Skelett-Veränderungen bei Ratten, wenn sie 17-19 altern. In der Tat haben wir bereits gezeigt, dass die Kombination von TSHI + LPS rekapituliert die pathophysiologischen Markenzeichen EoP, einschließlich Oligodendrozyten und Neuronenverlust, axonalen Schädigung, zelluläre Entzündung und Funktionsstörungen 20.

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Protokoll

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Institutional Care und Verwenden Ausschüsse an beiden Boston Kinderkrankenhaus und der Universität von New Mexico Health Sciences Center stimmten allen experimentellen Verfahren.

HINWEIS: Vor Beginn des Verfahrens, Dichtung, Sterilisieren und Autoklavieren alle chirurgischen Instrumenten und OP-Abdeckungen. Darüber hinaus bereiten postoperative Medikamente in sterile Fläschchen einschließlich 0,125% bipivucaine und 0,1 mg / kg Buprenorphin. Auch bereiten das Lipopolysaccharid (LPS) Lösung steril: 0,04 mg / ml LPS (0111: B4) in steriler Kochsalzlösung mit verdünnter Evans blauen Farbstoff.

1. Anästhesie

  1. Induzieren Anästhesie in einem embryonalen Tag 18 (E18) schwangere Sprague Dawley Ratten mit einem Gemisch aus 3% Isofluran ausgeglichen 70% Stickstoff und 30% Sauerstoff.
  2. Entfernen Ratte aus der Induktionskammer und legen Sie die Ratte in Rückenlage auf drapiert chirurgische zirkulierende Wasser Decke bei 37 ° C eingestellt. Bringen Anästhesie Bugnase und reduzieren isoflurane Ebene, um 2%.
  3. Augensalbe sanft gelten für jedes Auge zu Hornhaut Austrocknen zu verhindern. Während des Verfahrens kontinuierlich überwacht Temperatur, Atemfrequenz und die Herzfrequenz des Tieres. Mütterlichen Physiologie sollten während des gesamten Verfahrens stabil bleiben.

2. Surgical Prep und Scrub

  1. Mit Hilfe von kleinen Tierschermaschinen nehmen Sie das gesamte Haar in der unteren Bauchregion. Shave in einem rechteckigen Muster mit Sorgfalt zu vermeiden Nicking die Brustwarzen oder Erzeugung gestochen Hautausschlag, der irritierend sein kann für die künftige Pflege der lebend geborenen Welpen.
  2. Bereiten Bauchhaut durch abwechselnde Anwendung von PVP-Jod und 70% Ethanol-Peeling mit sterilen Wattestäbchen. Wiederholen Sie den Peeling, dass PVP-Jod und 70% Ethanol jeweils angewendet 3x abwechselnd. Trocknen lassen.
  3. Bestätigen Narkosetiefe über Abwesenheit von Zehen Prise Reflex. In Abwesenheit von Reflex und Reize, um Schmerzen zu reduzieren Isofluran Ebene bis 1%.
  4. Mit einer sterilen Operationstücher,drapieren das Tier. Achten Sie darauf, die Vorhänge in einem geeigneten Winkel zu platzieren, so dass sie die Menge an Spülflüssigkeit absorbieren sie zwar nicht zu behindern den Blutfluss in die Gebärmutterhörner zu maximieren.

3. Bauch Laparotomie

  1. Mit einem Skalpell einen 3 cm Mittellinienschnitt in der vorbereiteten Bauchhaut. Stumpf sezieren die Hautschicht von der Bauchbinde mit einer Schere. Mit einer Pinzette und chirurgische Scheren, heben die Bauch Faszienschicht und einen Einschnitt der avaskulären Linea alba, um Zugriff auf die Bauchhöhle zu gewinnen.
  2. Platzieren chirurgische Gaze an der Außenseite des Einschnittes und befeuchten mit steriler Kochsalzlösung. Verwendung stumpfen Pinzette und externe Druck auf den Bauch, entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutterhörner aus der Bauchhöhle und vereinbaren auf der befeuchteten Gaze.
  3. Verschränkung sorgfältig zu vermeiden und mit Darm zu kontaktieren. Vereinbaren Föten mit einer Pinzette, indem Sie nur das Muskelgewebe in zwischen einzelnen Fruchtblasen.Aufzudecken und zu isolieren, die 4 Gebärmutterarterien mit stumpf.
    HINWEIS: Es muss darauf geachtet, um die Gebärmutterarterien sezieren werden. Umliegende Gewebe und Gefäße selbst sind sehr empfindlich. Schäden an mütterlichen Gefäßen kann zu Blutungen, und in schweren Fällen, fetalen und Müttersterblichkeit.

4. Platzierung von Aneurysmen Clips

  1. Legen Sie eine Ratte 30 G Aneurysmen-Clip auf jedem Gebärmutterarterie. Sicherzustellen Aufhören des Blutflusses, einschließlich proximaler und distaler Impulsen und Verdunkelung der Uteringefäße einschließlich einzelner Plazenten. Decken Sie die freiliegende Hörner und gesamte Operationsfeld mit Gaze und Bewässerung mit steriler Kochsalzlösung. Achten Sie darauf, um das Feld zu feucht mit Bewässerung etwa alle 10 min zu halten.
  2. Nach 60 min, entfernen Sie die Gaze und Bewässerung das Feld. Stellen Sie sicher, dass die Gebärmutterhörner und Behälter ausreichend für eine erfolgreiche Clip Entfernung befeuchtet. Entfernen Sie vorsichtig jede Aneurysmen-Clip mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, Trauma des Schiffes und maint verursachenain Gewebeintegrität während der Entnahme.
  3. Spülen Sie gründlich die Gebärmutterhörner und Feld, wobei darauf zu jede streunende Themen aus Gaze von den Fruchtblasen zu entfernen.

5. Die Injektion von Lipopolysaccharid in den Fruchtblasen

  1. An der Basis jedes einzelnen Fruchtblase, knapp vor die Plazentaplatte, injizieren 100 ul LPS (4 ug / EWG), verdünnt mit Evans-Blau-Farbstoff in den Fruchtwasser. Verwenden stumpfen Pinzette zu stabilisieren und zu drehen jeden Fruchtblase in einer optimalen Position für die Injektion. Verdünnter Evans blauen Farbstoff ist ein Kontrastmittel, die hilfreich bei der Bestätigung richtige Spritze Platzierung und Injektion ist.
    HINWEIS: Verwenden Sie nur eine ultrafeine 0,3 ml Insulinspritze mit aufgesetztem 8 mm 31 G-Nadel für die intraFrucht Injektionen. Verwendung größerer Gauge-Nadeln wird bei chronischen Fruchtwasserverlust, fetalen Tod und Wiederaufnahme von der Schwangerschaft führen. Geringe Mengen an Fruchtwasser Leckage beim Entfernen der Spritze kann mitig seinated durch direkten Druck auf die Fruchtblase. Einige Rattenföten in gewissen Maße eine Oligohydramnion tolerieren. Allerdings akuten Fruchtwasserverlust durch Punktion mit großem Gauge-Nadeln, oder versehentliche Punktion mit nachfolgender chronischer Flüssigkeitsaustritt führt zu Fehlgeburten und in schweren Fällen, Verlust des Nachbar Schwangerschaften.
  2. Spülen Sie die Gebärmutterhörner 3x mit steriler Kochsalzlösung.

6. Schließen der Laparotomie

  1. Mit Hilfe einer Pinzette, die Gebärmutterhörner sorgfältig in die Bauchhöhle zurück. Sicherstellung einer angemessenen Raum zwischen den Fruchtblasen und der Mittellinienschnitt, Wieder annähernd den musculofascial Schicht Kanten mit Hilfe eines Lauf 3-0 Seidennaht. Achten Sie auf die Platzierung der Fruchtblasen beim Schließen des Muskel Einschnitt. Seien Sie vorsichtig, um nicht in oder durch einen Sack nähen.
  2. Re-nähern der Hautschicht, mit einem Lauf 3-0 Seidennaht, Schließen der Hautschicht.
    HINWEIS: Der Bauchschnitt sollte in zwei Schichten von kontinuierlichen Fäden, damit geschlossen werdenfür Haut und Muskel-Expansion mit zunehmender Trächtigkeit. Kontinuierliche Nähte ermöglichen gleichmäßig verteilt Wunde Spannung. Nähten sind weniger erwünscht als mehrere Knoten sind irritierend und kann leicht mit der Ratte nach der Genesung von Anästhesie gekaut werden. Chirurgischen Klammern sind nicht erwünscht. Schwänze der chirurgischen Knoten sollte sehr kurz (<3 mm) geschnitten werden.
  3. Injizieren Sie 1 ml 0,125% Bupivacain subkutan rund Wundränder mit einer 26 G-Nadel. Eine Dosis von 0,1 mg / kg Buprenorphin subkutan im Nacken.
  4. Schalten Sie Isofluran und abtrocknen Ratte nach Bedarf. Legen Sie in einem sauberen Käfig und Überwachung aus der Narkose. Stellen Sie sicher, Ratte nicht unterkühlt zu werden.

7. postoperative Erholung und Pflege

  1. Überwachen Sie die Ratten alle 8-12 h für 72 Stunden und dann täglich bis Jungtiere geboren werden (ungefähr E22 oder E23). Verabreichen zusätzlichen Dosen von Buprenorphin q8-12 h / 72 h oder prn wie vom IACUC diktiert.
  2. Überwachen Ratten Anzeichen von Schmerzen, Beschwerden, Blutungen aus der Scheide oder Blutungen von der Operationsstelle. Untersuchen Sie die Nähte und Schnittführung und darauf achten, Ratte ist nicht kauen oder Entfernen von ihren Nähten vorzeitig. Obwohl außerordentlich selten, Ratten, die ihre Nähte Kompromiss mit einem Risiko für Wunddehiszenz.
    HINWEIS: Gelegentlich Ratten können übermäßige Mengen von Bettzeug oder Non-Food-Produkte einnehmen, genannt pica, als Nebenwirkung von Buprenorphin Verwaltung. Obwohl sehr selten, müssen Ratten pica und mögliche anschließende Darmverschluss überwacht werden.

8. Gewebeverarbeitung und Kryoschneiden

  1. Um Hematoxylin & Eosin (H & E) Färbung der postnatalen Gehirn vorzubereiten, Jungtiere von ihren eigenen Käfig zu entfernen am postnatalen Tag 2 (P2). Verwendung chirurgische Scheren enthaupten Rattenjungen und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn aus dem Schädel.
  2. Drop fix Gehirn in einem konischen 15 ml-Röhrchen mit 7 ml 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung(PBS). Zeigen Gehirn bei 4 ° C und 72 Stunden zu beheben.
  3. Nach 72 Stunden, Transfer Gehirn in ein steriles PBS-Lösung, die 30% Saccharose (w / v) und zum 4 ° C.
    HINWEIS: Sobald Gehirn fallen in der Saccharose-Lösung sie bereit sind, auf einem Kryostat geschnitten werden sollen.
  4. Schnell einfrieren Gehirne und Montage auf Kryostaten Stampfe für Übernahme von gefrorenen Koronalschnitte. Cut 20 um gefrorene Koronalschnitte und montieren Sie auf Objektträger. Stellen Sie sicher, Abschnitte seriell gesammelt.
  5. Die Objektträger bei Raumtemperatur über Nacht trocknen. Objektträger bei 20 ° C.

9. Hematoxylin & Eosin-Färbung

  1. Nehmen Schlitten montiert Gefrierschnitten und auf Raumtemperatur erwärmt.
    HINWEIS: Bereiten Sie alle Lösungen frisch.
  2. Die Objektträger auf einer Folie wärmeren Satz bis 50 ° C für 2 Stunden.
  3. Objektträger auf eine Färbung Rack. Dip Slides 10x in doppelt destilliertem entionisiertem Wasser (ddH 2 O).
  4. Objektträger in 100% Hämatoxylin Inkubation für 5 min. Timich in Hämatoxylin kann je nach Grad der lila Färbung optimiert werden.
  5. Dip Slides 4x in Leitungs H 2 O, und stehen lassen in sauberem Leitungs H 2 O für 1 min.
  6. Die Objektträger 15x in saurem Alkohol (250 ml 70% igem Ethanol + 1 ml konzentrierte Chlorwasserstoffsäure).
  7. Dip Slides 4x in Leitungs H 2 O, und stehen lassen in sauberem Leitungs H 2 O für 1 min.
  8. Inkubieren in 1% Lithiumkarbonat für 2 min.
  9. Dip Slides 4x in Leitungs H 2 O, und stehen lassen in sauberem Leitungs H 2 O für 1 min.
  10. Inkubieren in 95% Ethanol für 1 min.
  11. Dip Slides 7x in 100% Eosin. Anzahl der Einbrüche in Eosin kann je nach Grad der rosa Färbung geändert werden.
  12. Dip Slides 5x in 95% Ethanol.
  13. Dip Schiebe 5x in einem frischen Wechsel 95% Ethanol.
  14. Objektträger in 100% Ethanol nach 1 min.
  15. Die Objektträger in eine frische Änderung von 100% Ethanol für 1 min.
  16. Objektträger in 100% Xylol Proben für 15 min.
    HINWEIS: Xylol Schritte undEindecken sollte in einem Abzug erfolgen.
  17. Inkubieren Objektträger in frischen Veränderungen Xylol für 15 min.
  18. Deckglas mit Permount und trocknen lassen in Abzug.
  19. Bildträger mit einem Lichtmikroskop.

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Ergebnisse

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Folgende TSHI + LPS bei E18, Hämatoxylin und Eosin-Färbung zeigt deutliche histopathologische Anomalien sowohl in der Plazenta (Figur 1) und im Gehirn (Figur 2). Plazenten auf E19 und E21 untersucht sind grob ödematösen mit Mikro-Blutungen und Nekrose der gesamten decidua und des Labyrinths. Signifikante Entzündungsinfiltrat und erhöhte Durchblutung wird auch beobachtet. Brains auf P2 sucht offenbaren Ventrikulomegalie sowie weißen Substanz und Anschlussplatte Verlust von Nervenzellen i...

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Diskussion

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Enzephalopathie bei Frühgeborenen ist schwierig, bei Tieren aufgrund der komplexen Zusammenspiel von Ursachen, neurologische Entwicklungszeit natürlich, Kompliziertheit der menschlichen Hirnnetzwerkbildung, überlappenden Mechanismen der Schädigung zu modellieren und die diversen Phänotypen von CNS beleidigt manifest in der menschlichen Frühgeborenen. EOP mit spezifischen Zelltyp Lücken zugeordnet (dh unreifen Oligodendrozyten) 21, sowie verschiedene entwicklungsregulierte Wege (dh Unterplatt...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Dan Firl, Chris Corbett und Jesse Denson, PhD. Die Finanzierung wurde von NIH NINDS R01 NS060765 SR vorgesehen, die P30 Cobre Pilotprogramm zur LJ und die Kindergesundheit Signature-Programm zu LJ an der Universität von New Mexico.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kochsalzlösung, 0,9%SigmaS8776
LPS 011B4SigmaL2630
Evan's Blue DyeSigmaE2129
OP-HandschuheBiogel40870
ODER HandtücherCardinal Health287000-008Sterile
PDI AlkoholvorbereitungspadsFisherbrand06-669-62
Mini Arco Wiederaufladbare HaarschneidemaschineKent Scientific Corp.CL8787
Betadine OP-PeelingPurdue Products L.P.67618-151-17
AugenschmiermittelRefresh Lacri Lube00023-0312
Stumpfe PinzetteRobozRS-8100
SchereRobozRS-6808
Chirurgische SchereRobozRS-5880
Chirurgische SchereF.S.T.14002-16
SpritzeBD3096281 ml
NadelBD30512225G 5/8
NadelBD30512830G 1
Applikatoren mit WattespitzeFisherbrand23-400-114Kleiner, 6 Zoll steriler
Baumwoll-MullschwammFisherbrand22-362-178
NadelhalterKent Wissenschaftliche Kor.INS60010912,5 cm STR
GefäßklemmenKent Scientific Corp.INS60012030G Druck
3-0 Perma HandseidennähteEthicon1684GSchwarz geflochten, 3-0 (2 metrisch), 18", nicht resorbierbar,  PS-1 24 mm Nadel, 3/8 Kreis
InsulinspritzenBD3284380,3 cc 3 mm 31G
Pentobarbital
Buprenorphin
Bupivacain
Isofluran
LithiumcarbonatAcros Chemicals554-13-2
Superfrost Plus ObjektträgerVWR48311-703
HämatoxylinLeica3801521Surgipath Gill II Hämatoxylin
EosinLeica3801601Surgipath Eosin
XyloleFisherbrandX3S-4Histologischer Grad
PermountFisherbrandSP15-100
DeckglasFisherbrand12-548-5PFisher Finest Premium Deckglas

Referenzen

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Verschluss der Arteria uterinatransiente systemische Hypoxie Isch mieplazentare UnterperfusionChorioamnionitis ModellSprague Dawley RattenEmbryonaltag 18Gehirnverletzungsmodell

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