Method Article

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

DOI:

10.3791/53197

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October 10th, 2015

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1Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, 2CNRS URA 2182 'Genes, synapses and cognition', Institut Pasteur, 3Human Genetics and Cognitive Functions, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Plateforme d' Imagerie Dynamique, Imagopole, CiTech, Institut Pasteur, 5Neuroplasticity and Therapeutics, CECS, I-STEM, AFM, Evry

In This Article

Summary

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Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.

Abstract

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Dendriten sind kleine Vorsprünge, die mit den postsynaptischen Kompartimente von exzitatorischen Synapsen des zentralen Nervensystems zu entsprechen. Sie sind entlang den Dendriten verteilt sind. Ihrer Morphologie ist weitgehend abhängig von der neuronalen Aktivität, und sie dynamisch sind. Dendritenfortsätzen exprimieren glutamatergen Rezeptoren (AMPA und NMDA-Rezeptoren) auf ihrer Oberfläche und auf der Ebene der postsynaptischen Dichten. Jeder Dorn ermöglicht das Neuron seine staatlichen und lokalen Aktivität unabhängig zu steuern. Wirbelsäulen Morphologien wurden ausgiebig in glutamatergen Pyramidenzellen der Hirnrinde untersucht, wobei sowohl in-vivo-Ansätzen und neuronale Kulturen aus Nagetiergewebe erhalten. Neuropathologischen Bedingungen können zu veränderten Wirbelsäule Induktion und Reifung verbunden werden, weil in Nagetier kultivierten Neuronen und eindimensional quantitative Analyse. 1 gezeigt Die vorliegende Arbeit beschreibt ein Protokoll für die 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien mit menschlichen Cortial Neuronen aus neuralen Stammzellen (späten kortikalen Vorläuferzellen) stammt. Diese Zellen wurden ursprünglich von pluripotenten Stammzellen erhalten. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse der Wirbelsäule Morphologien bei unterschiedlichen Kulturperioden und mit möglichen Vergleich zwischen pluripotenten Stammzellen, die aus Kontroll-Individuen mit denen von Patienten mit psychiatrischen Erkrankungen erhalten wird.

Introduction

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Dendritischen Dornen kortikaler Pyramidenzellen sind klein und dünn Vorsprüngen, die entlang der basalen und apikalen Dendriten dieser neuronalen Subtypen in Nagetier, Primaten und menschliche Gehirn verteilt sind. Sie sind die Websites der meisten Synapsen und Anzeige Tastenfunktionen beim Lernen und kognitive Prozesse. Die detaillierten Strukturen der menschlichen dendritischen Dornen wurden technisch durch Elektronenmikroskopie 2 untersucht. Allerdings ist eine solche Vorgehensweise zeitaufwendig und stellt hohe Arbeitsbelastung. In jüngerer Zeit hat eine dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Morphologie der dendritischen Dornen in menschlichen Hirnr....

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Protocol

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1. Neuronale Kultur

Hinweis: Fibroblast Umprogrammierung in pluripotente Stammzellen, die Verpflichtung zu der dorsalen Telencephalon Abstammung, Abstammung, Amplifikation und Banken der späten kortikalen Vorläuferzellen (LCP) wurden in BOISSART et al 4 beschrieben. Neuronale Differenzierung von LCP-ähnlichen Zellen wurde ebenfalls nach BOISSART et al 4 mit leichten Modifikationen durchgeführt. Andere Verfahren sind für direkten Reprogrammierung von Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen gefolgt von deren Differenzierung in Neuronen entwickelt. Dieses Protokoll wurde beibehalten, da es di....

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Results

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Die vorliegende Studie beschreibt ein standardisiertes Protokoll für die Wirbelsäule Quantifizierung der kultivierten Dendriten der Pyramidenzellen aus iPS abgeleitet. Dieses Protokoll erlaubt die Analyse der Wirbelsäule Reifung auf die menschliche Neuronen und ihre möglichen Vergleich mit der Reifung von Stacheln in Standard-Nagetier neuronalen Kulturen als auch in in vivo Tiermodellen.

1A stellt ein Schema der verschiedenen Schritte der Kultur, die die Produktion .......

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Discussion

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Die Quantifizierung der morphologischen Merkmale der Pyramidenneuronen stützte sich auf die Software. Das Filament Tracer Oberfläche wurde für die Segmentierung von Neuronen und Dorne verwendet, und die XT-Modul wurde für die Analyse verwendet.

Um die Genauigkeit der unsere Technik analysieren wir zunächst Vergleich der gemessenen morphologischen Parameter (Länge, Fläche, und die Gesamtmenge der Wirbelsäule, wenn zutreffend), mit denen veröffentlichte unter Verwendung von Ratten reife Pyrami.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde gefördert durch das Institut Pasteur, die Bettencourt-Schueller-Stiftung, das Centre National de la Recherche Scientifique, die Universität Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), der Conny-Maeva Charitable Foundation, der Cognacq Jay Foundation, der Orange Foundation und der Fondamental Foundation. L.G. wird durch ein Stipendium des Gesundheitsministeriums unterstützt. Wir danken BitPlane, insbesondere Georgia Golfis, für die Hilfe in der Anfangsphase dieser Arbeit.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
D-PBS (1x), ohne Calcium, Magnesium und Phenol RotGibco/ Life Technologies14190169
Poly-L-Ornithine Solution BioreagenzSigma AldrichP4957
Maus LamininDutscher Dominique354232
N2 SupplementGibco/ Life Technologies17502048
B-27 Supplement ohne Vitamin A (50-fach)Gibco/ Life Technologies12587010
DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-IGibco/ Life Technologies31331028
Neurobasal Med SFMGibco / Life Technologies21103049
2-MercaptoethanolGibco / Life Technologies31350-010
Penicillin-SteptomycinGibco / Life Technologies15140-122
GFP Kaninchenserum Polyklonaler AntikörperGibco / Life TechnologiesA-6455
PferdeserumGibco/ Life Technologies16050130
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen Gibco/ Life TechnologiesA11034
Polyklonales Anti-betaIII-Tubulin-AntikörperMilliporeAB9354
Deckglas 13 mmVWR631-0150
Prolong Gold Antifade Reagenz mit DAPIGibco/ Life TechnologiesP36931
Tween(R) 20 Bioextra, viskose FlüssigkeitSigma Aldrich ChimieP7949
Triton X-100Sigma Aldrich ChimieX100-100ML
Humane FibroblastenCoriell Cell Line BiorepositoryGM 4603 und GM 1869Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopZeiss (Deutschland)LSM 700
Imaris SoftwareBitplane AG, ZürichVersion 6.4.0 FilamentTracer und Imaris XT Module sind erforderlich
Huygens SoftwareHuygens Software, SVI, NiederlandePro-VersionOptional (für Dekonvolutionstests)

References

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  1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
  2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J.

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