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Methodenartikel

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

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DOI:

10.3791/53197

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10. Oktober 2015

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1Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, 2CNRS URA 2182 'Genes, synapses and cognition', Institut Pasteur, 3Human Genetics and Cognitive Functions, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Plateforme d' Imagerie Dynamique, Imagopole, CiTech, Institut Pasteur, 5Neuroplasticity and Therapeutics, CECS, I-STEM, AFM, Evry

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.

Zusammenfassung

Dendriten sind kleine Vorsprünge, die mit den postsynaptischen Kompartimente von exzitatorischen Synapsen des zentralen Nervensystems zu entsprechen. Sie sind entlang den Dendriten verteilt sind. Ihrer Morphologie ist weitgehend abhängig von der neuronalen Aktivität, und sie dynamisch sind. Dendritenfortsätzen exprimieren glutamatergen Rezeptoren (AMPA und NMDA-Rezeptoren) auf ihrer Oberfläche und auf der Ebene der postsynaptischen Dichten. Jeder Dorn ermöglicht das Neuron seine staatlichen und lokalen Aktivität unabhängig zu steuern. Wirbelsäulen Morphologien wurden ausgiebig in glutamatergen Pyramidenzellen der Hirnrinde untersucht, wobei sowohl in-vivo-Ansätzen und neuronale Kulturen aus Nagetiergewebe erhalten. Neuropathologischen Bedingungen können zu veränderten Wirbelsäule Induktion und Reifung verbunden werden, weil in Nagetier kultivierten Neuronen und eindimensional quantitative Analyse. 1 gezeigt Die vorliegende Arbeit beschreibt ein Protokoll für die 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien mit menschlichen Cortial Neuronen aus neuralen Stammzellen (späten kortikalen Vorläuferzellen) stammt. Diese Zellen wurden ursprünglich von pluripotenten Stammzellen erhalten. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse der Wirbelsäule Morphologien bei unterschiedlichen Kulturperioden und mit möglichen Vergleich zwischen pluripotenten Stammzellen, die aus Kontroll-Individuen mit denen von Patienten mit psychiatrischen Erkrankungen erhalten wird.

Einleitung

Dendritischen Dornen kortikaler Pyramidenzellen sind klein und dünn Vorsprüngen, die entlang der basalen und apikalen Dendriten dieser neuronalen Subtypen in Nagetier, Primaten und menschliche Gehirn verteilt sind. Sie sind die Websites der meisten Synapsen und Anzeige Tastenfunktionen beim Lernen und kognitive Prozesse. Die detaillierten Strukturen der menschlichen dendritischen Dornen wurden technisch durch Elektronenmikroskopie 2 untersucht. Allerdings ist eine solche Vorgehensweise zeitaufwendig und stellt hohe Arbeitsbelastung. In jüngerer Zeit hat eine dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Morphologie der dendritischen Dornen in menschlichen Hirnrinde mit spezifischer Software kombiniert werden, um große manuelle Wirbelsäulenanalyse 3 gemeldet.

Green Fluorescence Protein (GFP) Technologie, um Immun gekoppelt stellt ein genaues Werkzeug für die Wirbelsäulen Identifizierung und Formmessung durch Fluoreszenzmikroskopie. Diese Vorgehensweise kann leicht an kultivierten Neuronen angewendet werden. However, haben keine Angaben über die Analyse der Wirbelsäule Reifung und Morphologie auf die menschliche Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) abgeleitet gemeldet.

Das Ziel dieser Studie war es, ein Protokoll, das dendritischen Dorn Abbildungs ​​aus kultivierten menschlichen Nervenzellen in vitro ermöglicht beschreiben. GFP-Markierung, die konfokale Mikroskopie und 3D-Analyse mit dem Filament Tracer-Modul von Imaris Software wurden in dem vorliegenden Protokoll verwendet. Kultur Schritte, die erforderlich sind, um kortikale glutamatergen Neuronen der Schichten II bis IV von neuralen Stammzellen (NSC) zu erhalten sind, sind auch hier kurz beschrieben. Das gesamte Protokoll für den menschlichen NSC Produktion hat bereits an anderer Stelle 4 veröffentlicht.

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Protokoll

1. Neuronale Kultur

Hinweis: Fibroblast Umprogrammierung in pluripotente Stammzellen, die Verpflichtung zu der dorsalen Telencephalon Abstammung, Abstammung, Amplifikation und Banken der späten kortikalen Vorläuferzellen (LCP) wurden in BOISSART et al 4 beschrieben. Neuronale Differenzierung von LCP-ähnlichen Zellen wurde ebenfalls nach BOISSART et al 4 mit leichten Modifikationen durchgeführt. Andere Verfahren sind für direkten Reprogrammierung von Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen gefolgt von deren Differenzierung in Neuronen entwickelt. Dieses Protokoll wurde beibehalten, da es die selektive Herstellung von pyramiden glutamatergen Neuronen.

  1. Gönnen 6-Well-Kulturplatten mit Deckgläschen mit Poly-Ornithin (1/6 in DPBS verdünnt, Lager-Konzentration 0,01%) O / N gefolgt von drei Wäschen in DPBS. Dann fügen Laminin (Stammkonzentration 1 mg / ml, in DPBS verdünnt 500 mal) für mindestens 10 Stunden unter der Flow-Haube .
  2. Platte und Versand NSC bei niedriger Dichte (50.000 Zellen / cm 2) in 6-Well-Kulturplatten mit Deckgläschen in 3 ml Kulturmedium, bestehend aus DMEM / F12 (500 ml), 2 Fläschchen (je 5 ml) von N2 zu ergänzen, 2 Fläschchen (jeweils 10 ml) von B27 Supplement, 10 ml Pen-Streptomycin (Penicillin = 10.000 Einheiten / ml und Streptomycin = 10.000 Einheiten / ml), 1 ml 2-Mercaptoethanol (Stammlösung: 50 mM) und Laminin (1 / 500) ohne Wachstumsfaktoren. Entscheidender Schritt: Führen Sie diesen Schritt vorsichtig durch Zugabe von Zellen, die mit langsamen Drehbewegungen um Zellclusterbildung zu reduzieren.
  3. Entfernen Sie das Kulturmedium. Add frischen N2B27 Medium, das 2 & mgr; g / ml frischem Laminin-Lösung, um das Neuron auf den Deckgläsern befestigt zu halten und Klumpenbildung zu vermeiden. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage. Halten einige der verbleibenden Medium (200 ul) vor der Zugabe von frischem Medium, um die Zelle vor dem Trocknen zu verhindern. Alternativ gehen Sie schnell und ändern Sie das Gesamtvolumen (3 ml).
e_title "> 2. Lentivirale Transduction

Hinweis: GFP lentiviralen Vektoren wurden freundlicherweise von Dr. Uwe Maskos Labor am Institut Pasteur (Paris) zur Verfügung gestellt und nach der veröffentlichten Protokoll 5 hergestellt. GFP-Expression durch die Maus Phosphoglyceratkinase (PGK) Promotor angetrieben. Für diese Studie wurde von 400 ng / ul (Stammlösung in PBS 1x) Virustiter.

  1. Transduktion menschlicher iPSC abgeleiteten Neuronen in jeder Stufe der Reifung von Viruspartikeln durch Zugabe von 1 ul der Stammlösung, die 40 ng des GFP lentiviralen Vektor pro Kulturvertiefung (6-Well-Platten) und Inkubation für 48 Stunden in frischem Kulturmedium. Hinweis: Bei diesem Protokoll wird die Dauer der Inkubation ermöglicht eine gute Kennzeichnung von Wirbelsäulenstrukturen.

3. Immunfluoreszenz

Anmerkung: Um die Kennzeichnung der gesamten Wirbelsäule Morphologie zu verbessern, wurde Immunfluoreszenz-Markierung unter Verwendung eines anti-GFP-Antikörper in permeabilisierten Bedingungen.

  1. Entfernen Kulturmedium und fixieren transduzierten Zellen auf Deckgläsern in 4% Paraformaldehyd für 10 min bei RT, dann waschen 3 Mal in 1x PBS (jeweils 10 Minuten).
  2. Immerge Deckgläser in PBS, ergänzt mit 0,05% Triton (100x) und 10% Pferdeserum, 1 h bei RT, dann 3 x waschen in 1x PBS.
  3. 100 ul 1x PBS, ergänzt mit 4% Pferdeserum und primärem Antikörper (1 / 1.000) gegen GFP angehoben und um einen Faktor von 1,000 auf jedem Deckglas verdünnt. Inkubieren in einer dunklen Box O / N bei 4 ° C, dann waschen 3 Mal mit 1x PBS.
  4. Verdünnter Alexa Fluor 488-konjugiertem Antikörper (1/200) in PBS, ergänzt mit 0,5% Tween 20 und Inkubation für 1 h bei RT. Dann waschen 3 Mal in 1x PBS und montieren Deckgläser auf Glasobjektträger mit Eindeckmittel für die Fluoreszenzmikroskopie.

4. dendritischen Dorn Imaging

  1. Führen konfokale Bildgebung durch ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop.
  2. Wählen Sie gesunde Neuronen mit pyramidenförmigen Morphologie einnd eine vollständige dendritischen Verzweigung, und zu quantifizieren, mindestens 10 Neuronen pro Bedingung aus getrennten Versuchen. Quantifizierung von 60 bis 100 & mgr; m pro Dendriten.
  3. Erwerben Sie Bilder mit einem 40x Öl NA = 1.3 Objektiv und eine 488 nm Laserlinie für die GFP-Anregung mit einer typischen Spitzenleistung auf Sample-Ebene etwa 20 & mgr; W. Set Pixelgröße etwa 80 nm, um richtig zu probieren dendritischen Dornen.
    Hinweis: Die nachfolgende Analyse Forderung nach einem Bild, in dem der Lärm nicht die richtige Segmentierung von Dendriten und Dornen zu kompromittieren. Mit den genannten räumlichen Abtastung und Leistungseinstellung, haben wir beobachtet, dass ein Pixel-Verweilzeit von 3,15 & mgr; s ist ausreichend, um genügend Photonen auf ein solches Bild aufbauen zu sammeln. Für trübe Proben, kann die Bildqualität durch Mittelung 2-4 Scans verbessert werden. Die Übernahme von mehreren XY Fliesen erforderlich sein, um den interessierenden Bereich, die dann vor der Verarbeitung zusammengenäht werden, zu decken.
  4. Zur Probe das gesamte Neuronenvolumen, eine Z-Stapel zu erwerben, miteine Z Abstand im Bereich von 150 nm bis 300 nm, wodurch 20 bis 30 Z-Scheiben.
    Hinweis: Die laterale räumliche Auflösung mit diesen Einstellungen wird erreicht, 234 nm und die axiale Auflösung von 591 nm. Die hier gewählte Abtastrate ist ausreichend, aber die axiale Auflösung größer ist als die kleinste Größe der Stacheln abzubildenden die Analyse begünstigt die Stacheln, die sich seitlich von den Dendriten erstrecken.

5. 3D-Quantifizierung von dendritischen Dornen

Anmerkung: Die folgenden Abschnitte beschreiben speziell die Verwendung des Imaris Software für die Analyse. Alternative Implementierungen gibt, einschließlich NeuronStudio 15 oder Metamorph 8, die ähnliche Ergebnisse liefern kann.

Verwenden Sie die folgenden Tasteneinstellungen:

  1. Als Vorverarbeitungsstufe, verwenden Gauss-Filterung durch die Bildverarbeitungseinrichtungen von der Software angeboten. Führen Gauss-Filterung über die Bildverarbeitung> SmooSache> Gauß-Filter. Stellen Sie die Filterbreite gleich der Pixelgröße in XY sein.
  2. Führen Sie eine halbautomatische Rückverfolgung von Dendriten, mit dem Filament Tracer-Modul der Software.
    1. Zunächst schätzen den Dendriten Durchmesser, durch eine Distanz Tool auf der Registerkarte Scheibe der Software.
    2. In der Registerkarte Surpass, klicken Sie auf den Fäden Werkzeug. Für eine bessere Robustheit, stützt sich dieses Protokoll auf halbautomatischen Spurhaltung; klicken Sie auf Weiter automatische Erstellung. Die Modulschnittstelle zeigt nun die Registerkarte ziehen. Wählen Sie hier AutoPath als eine Methode, Dendrite als eine Art, und geben Sie die geschätzten Dendriten Durchmesser.
    3. Verwenden Sie den Auswahlmodus des Zeigers, drehen Sie den Cursor in eine Box. Umschalt-Rechtsklick auf den Dendriten Ausgangspunkt. Hinweis: Die Software führt ersten Berechnungen.
    4. Bewegen Sie den Mauszeiger entlang der Dendriten. Vom Ausgangspunkt (vertretened als blaue Kugel), eine gelbe Linie, die die wahrscheinlichste Dendriten Pfad gezeigt. Umschalt-Linksklick auf den Dendriten Endpunkt.
  3. Führen Sie die automatische Stacheln Segmentierung. Hinweis: Die Stacheln auf dem Dendriten zurückzuführen sind, die von der Modulschnittstelle automatisch gefunden.
    1. In der Modulschnittstelle, klicken Sie auf die Registerkarte Erstellen. In der Rebuild der Dropdown-Liste, wählen Sie Rebuild Dendrite Durchmesser und überprüfen Sie die Fried Feld. Klicken Sie dann auf Neu erstellen.
    2. Stellen Sie den Schwellenwert, so dass der segmentierte Volumen entspricht dem aktuellen Dendriten Volumen. Als ein Algorithmus, wählen Kürzeste Entfernung Entfernung Karte. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter.
    3. Bestimmen Sie die kleinste Wirbelsäule Kopfdurchmesser und die maximale Länge, erneut unter Verwendung des Abstands Tool auf der Registerkarte Scheibe der Software, dann wieder auf die Registerkarte Surpass kommen und geben Sie die Parameter. Foder dieses Protokoll, Werte um 200 bis 300 nm für minimale Durchmesser und 4 & mgr; m für die maximale Länge sind gute Ausgangspunkte. Aktivieren Sie das Allow Niederlassung Spines Feld. Klicken Sie auf Weiter.
    4. Stellen Sie die Seed-Punkte Threshold so dass die blauen Punkte, die Stacheln zu lokalisieren, um tatsächlichen Wirbelsäule Köpfe. Klicken Sie auf Weiter. Hinweis: Die Eckpunkte für die Berechnung ist nun fertig und kann langwierig sein.
  4. Klassifizieren Stacheln, indem Sie auf der Registerkarte Extras der Modulschnittstelle. Klicken Sie auf Classify Spines. In der Sie dazu aufgefordert Benutzeroberfläche, stellen Sie sicher, dass es vier Klassen, von ihrer Morphologie wie folgt definiert: Stubby: Länge <1 & mgr; m; Pilz: Länge (Wirbelsäule)> 3 und Max Breite (Kopf)> bedeuten Breite (Hals) x 2; Lange dünne: Mittlere Breite (Kopf) ≥ mittlere Breite (Hals); Filopodien artig: Länge ≤ 4 & mgr; m (ohne Kopf).
    Hinweis: Die modul Schnittstelle erzeugt vier neuen Filament Objekte enthält die Ergebnisse der Klassifizierung.
  5. Export Statistische Daten: auf jeder dieser vier Objektschnittstellen, auf die Registerkarte Statistik zu gehen.
    Klicken Sie auf die Export Alle Statistiken to Datei.
    Hinweis: Weitere statistische Werte können für Dendriten exportiert werden (. ZB Länge, Fläche, mittlerer Durchmesser, Zweigtiefe, Verzweigungswinkel, Lautstärke, etc.) Und für die Stacheln (zB Geradheit, Bereich der Befestigung, Länge und Volumen der verschiedenen Wirbelsäulenteile, Wirbelsäule Durchmesser, Dichte, etc.)

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Ergebnisse

Die vorliegende Studie beschreibt ein standardisiertes Protokoll für die Wirbelsäule Quantifizierung der kultivierten Dendriten der Pyramidenzellen aus iPS abgeleitet. Dieses Protokoll erlaubt die Analyse der Wirbelsäule Reifung auf die menschliche Neuronen und ihre möglichen Vergleich mit der Reifung von Stacheln in Standard-Nagetier neuronalen Kulturen als auch in in vivo Tiermodellen.

1A stellt ein Schema der verschiedenen Schritte der Kultur, die die Produ...

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Diskussion

Die Quantifizierung der morphologischen Merkmale der Pyramidenneuronen stützte sich auf die Software. Das Filament Tracer Oberfläche wurde für die Segmentierung von Neuronen und Dorne verwendet, und die XT-Modul wurde für die Analyse verwendet.

Um die Genauigkeit der unsere Technik analysieren wir zunächst Vergleich der gemessenen morphologischen Parameter (Länge, Fläche, und die Gesamtmenge der Wirbelsäule, wenn zutreffend), mit denen veröffentlichte unter Verwendung von Ratten reife Pyrami...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde gefördert durch das Institut Pasteur, die Bettencourt-Schueller-Stiftung, das Centre National de la Recherche Scientifique, die Universität Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), der Conny-Maeva Charitable Foundation, der Cognacq Jay Foundation, der Orange Foundation und der Fondamental Foundation. L.G. wird durch ein Stipendium des Gesundheitsministeriums unterstützt. Wir danken BitPlane, insbesondere Georgia Golfis, für die Hilfe in der Anfangsphase dieser Arbeit.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
D-PBS (1x), ohne Calcium, Magnesium und Phenol RotGibco/ Life Technologies14190169
Poly-L-Ornithine Solution BioreagenzSigma AldrichP4957
Maus LamininDutscher Dominique354232
N2 SupplementGibco/ Life Technologies17502048
B-27 Supplement ohne Vitamin A (50-fach)Gibco/ Life Technologies12587010
DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-IGibco/ Life Technologies31331028
Neurobasal Med SFMGibco / Life Technologies21103049
2-MercaptoethanolGibco / Life Technologies31350-010
Penicillin-SteptomycinGibco / Life Technologies15140-122
GFP Kaninchenserum Polyklonaler AntikörperGibco / Life TechnologiesA-6455
PferdeserumGibco/ Life Technologies16050130
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen Gibco/ Life TechnologiesA11034
Polyklonales Anti-betaIII-Tubulin-AntikörperMilliporeAB9354
Deckglas 13 mmVWR631-0150
Prolong Gold Antifade Reagenz mit DAPIGibco/ Life TechnologiesP36931
Tween(R) 20 Bioextra, viskose FlüssigkeitSigma Aldrich ChimieP7949
Triton X-100Sigma Aldrich ChimieX100-100ML
Humane FibroblastenCoriell Cell Line BiorepositoryGM 4603 und GM 1869Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopZeiss (Deutschland)LSM 700
Imaris SoftwareBitplane AG, ZürichVersion 6.4.0 FilamentTracer und Imaris XT Module sind erforderlich
Huygens SoftwareHuygens Software, SVI, NiederlandePro-VersionOptional (für Dekonvolutionstests)

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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