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Methodenartikel

A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien

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DOI:

10.3791/53204

⸱

3. August 2015

 , 
1Department of Biomedical Science, Graduate School of Medicine, Korea University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) zu vermehren, indem nur konditionierte Medien aus der menschlichen Plazenta in einer mit Gelatine überzogenen Schale verwendet werden, ohne zusätzliche exogene Supplementierung oder hPSC-spezifische synthetische Substrate.

Zusammenfassung

Die Vermehrung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in konditioniertem Medium, das aus menschlichen Zellen unter feederfreien Kulturbedingungen gewonnen wurde, war von Interesse. Dennoch wurde keine ideale, humanisierte ex vivo Feeder-freie Vermehrungsmethode für hPSCs entwickelt; Derzeit werden allen Nährmedien zusätzliche exogene Substrate zugesetzt, einschließlich des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF), eines Master-hPSC-erhaltenden Faktors, und synthetische Substrate wie Matrigel oder Laminin werden in allen feederfreien Kulturen verwendet. Vor kurzem hat unsere Gruppe ein einfaches und effizientes Protokoll für die Vermehrung von hPS-Zellen entwickelt, bei dem nur konditionierte Medien aus der menschlichen Plazenta auf einer mit Gelatine überzogenen Schale verwendet werden, ohne zusätzliche exogene Supplementierung oder synthetische Substrate, die für hPS-Zellen spezifisch sind. Dieses Protokoll wurde bisher noch nicht berichtet und könnte es Forschern ermöglichen, hPSCs effizient unter humanisierten Kulturbedingungen zu vermehren. Darüber hinaus verhindert dieses Modell das Risiko einer hPSC-Kontamination durch tierische Produkte wie Viren oder unbekannte Proteine. Darüber hinaus ermöglicht dieses System die einfache Massenproduktion von hPSCs unter Verwendung der Gelatinebeschichtung, die einfach zu handhaben ist und die Gesamtkosten für die Ex-vivo-hPSC-Wartung drastisch senkt.

Einleitung

Das Ziel dieses Protokolls ist die Vermehrung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), einschließlich humaner embryonaler Stammzellen (hESCs) und humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs), unter vollständig humanisierten ex vivo feederfreien Bedingungen, ohne dass zusätzliche exogene Supplementierung und synthetische Substrate erforderlich sind. Bisher war die Entwicklung von ex vivo hPSC-Kulturmodellen, die die Einführung von Kulturprodukten in die Klinik ermöglichen, ein großes Anliegen in der Stammzellforschung. Konkret müssen zwei kritische Probleme angegangen werden. Zunächst wird ein humanisiertes ex vivo-Kultursystem für die Vermehrung von hPSCs benötigt, das das Risiko einer Kontamination durch tierische Zellprodukte eliminiert. Zweitens ist ein Feeder-freies Kulturmodell erforderlich, um eine einfache und wirtschaftliche Massenproduktion von hPSCs zu ermöglichen. Für therapeutische Anwendungen von hPS-Zellen ist es notwendig, die Faktoren zu identifizieren, die ihre Selbsterneuerung und Differenzierung regulieren.

Seit Xu et al. ursprünglich über die Machbarkeit der Verwendung von konditionierten Medien (CM) berichteten, die aus embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF) gewonnen wurden, um hESCs auf Matrigel1 zu züchten, haben viele Studien optimale ex vivo Vermehrungsmethoden für hPSCs2-4 untersucht. Ein ideales humanisiertes ex vivo Feeder-freies hPSC-Vermehrungssystem wurde jedoch nicht entwickelt, da die derzeitigen Methoden zusätzliche exogene Substrate wie bFGF und Insulin, bekannte hPSC-erhaltende Faktoren, in den Nährmedien5-7 erfordern. Darüber hinaus werden in allen feederfreien Kulturen synthetische Substrate wie Matrigel oder Laminin verwendet.

Die Begründung für die Entwicklung und Verwendung dieses Protokolls basiert auf unseren früheren Studien, die zeigen, dass menschliche Plazenta-Chorionzellen die Vermehrung von hPSCs ohne bFGF-Supplementierung hervorragend unterstützen8-11. Dieses Protokoll hat eine Reihe von Vorteilen, darunter seine Einfachheit in Bezug auf die Handhabung und seine Kosteneffizienz, und es ist eine nahezu perfekte humanisierte Kultur, die die Vermehrung von hPSC ohne exogene synthetische Substrate ermöglicht. Die Anwendung von humanen Plazenta-abgeleiteten CM (hPCCM) bei hPSCs umfasst 3 Schritte. Zunächst werden Chorionzellen aus der menschlichen Plazenta isoliert und kultiviert. Zweitens wird hPCCM aus kultivierten Zellen hergestellt. Drittens werden hPSCs mit hPCCM kultiviert und ihre Eigenschaften werden bestätigt.

Dieses Protokoll wird die klinische Anwendung von hPSCs und die Untersuchung der Mechanismen der hPSC-Proliferation und -Bindung erleichtern. In dieser Arbeit wird das Protokoll für die erfolgreiche Vermehrung von hPSCs in hPCCM auf einer gelatinebeschichteten Schale vorgestellt.

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Protokoll

Ethics Statement: Die menschlichen Plazenta Studie wurde prospektiv durchgeführt, mit Zustimmung des Institutional Review Board für die menschliche Erforschung der Korea University (AN09085-001). Alle Experimente wurden in einem Rein Germ Zimmer Anlage am Korea University Medical Center durchgeführt. Der Versuchsaufbau und Verfahren mit hPSCs wurden von der Institutional Review Board der Korea University Medical Center (AN12277-003) zugelassen.

1. Herstellung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte

  1. Coat alle Kulturschalen mit 0,1% Gelatine. Autoklav phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Pinzette. Sterilisieren chirurgischer Scheren, Mikrozentrifugenröhrchen, und Gaze bei 121 ° C unter £ 15 psi über 15 min.
  2. Vorbereitete vorgewärmten 0,25% Trypsin-Ethylenamin tetra-essigsäure (Trypsin-EDTA), und vorgewärmte filtrierten Kulturmedium (DMEM), das 20% fötales Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 100 g / ml streptomycin vor Beginn der Verfahren.

2. Zellisolierung aus menschlicher Plazenta

  1. Erhalten Plazentagewebe nach Kaiserschnitt Lieferung, die von gesunden schwangeren Frauen, die sich normal oder therapeutische Abtreibung in 7-32 Wochen der Schwangerschaft nach schriftlicher Einwilligung.
  2. Haben die geburtshilflichen Fach chirurgisch getrennten menschlichen Plazenta chorionic Platten (HPC) aus der Plazenta; inkubieren diese in 0,25% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 20 min und dann mit 5 ml PBS waschen.
  3. Isolieren Chorionzotten von HPC mit einer Schere; Blatt vor den Zotten und waschen Sie sie dreimal mit 1 ml PBS. Nach dem Zerkleinern, legen Sie die Chorionzotten in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Pipettenspitze; waschen Sie die Proben mit 500 ul PBS durch Auf- und Abpipettieren und zentrifugieren die Rohre für 120 × g für 3 min. Zweimal waschen Gewebe mit 500 ul vorgewärmtes Kulturmedium.
  4. Kulturzellen in einem Medium auf Gelatine-beschichteten Platten bei 37 ° C in 5% CO 2 und unter 95% Luftfeuchtigkeit. Precoat- alle Platten mit 0,1% Gelatine für 1 Stunde bei 37 ° C. Kolonien von Fibroblasten-ähnlichen Zellen zu bilden, und adhärente Wachstum ungefähr 5-7 Tage nach Beginn der Kultur in dem gleichen Medium.
  5. Tauschen Sie das Medium alle 2-3 Tage bis zum dritten Durchgang. Während der Kultur, das Entfernen von Zelltrümmern schwebend in dem Kulturmedium; wachsenden Plazenta Fibroblasten wird an der Platte zu befestigen. Kultur die Fibroblasten-ähnliche Zellen aus dem HPC up abgeleitet, um dem 10. Durchgang und dann ernten sie für hESC-Kulturen nach Trypsinisierung und Mitomycin-C (10 ug / ml) Behandlung.
  6. Vor dem Einfrieren HPC als Lager Proben verwenden reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), um zu bestätigen, dass HPC nicht mit Krankheitserregern, die häufig infizieren die Plazenta, einschließlich Mycoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginine, M verunreinigt . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,und M. capricolum), und die Bakterienspezies, Ureaplasma urealyticum, durch die Verwendung eines Mycoplasma Detection Kit.
    1. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um RT-PCR durchzuführen, verwenden alle Primer und Mischungen im Kit enthalten. Benutzen Sie die Überstände der Zellen, die für 36 Tage auf Mykoplasmen Nachweis kultiviert wurden. Werden 3 ul dieser Proben an die PCR-Ansätze und führen die 1. PCR-Verfahren für 35 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 2 min und 72ºC für 1 min.
    2. 0,5 ul der 1. PCR-Produkt sorgfältig in den PCR-Ansatz und führen Sie die 2. PCR-Verfahren für 30 Zyklen unter den gleichen Bedingungen wie zuvor. Analysieren der amplifizierten Produkte von 1% Agarose-Gelelektrophorese; Anwendung 10 ul jeweils der 1. und der 2. PCR-Produkte in den Gelen.
  7. Wenn HPC gefunden werden, um mit Krankheitserregern kontaminiert sind, beseitigen dieseVerwendung einer Kombination von Antibiotika (BM-Cyclin) gemß den Anweisungen des Herstellers. Fügen neue Medium, das 10 ug / ml BM-Cyclin 1 für 3 Tage, und dann Behandlung der Zellen mit 5 ug / ml BM-Cyclin 2 für weitere 4 Tage. Wiederholen Sie diesen Zyklus zweimal und dann für Mycoplasmenkontamination überprüfen erneut.

3. Ernten Menschliche Plazenta abgeleiteten Zellen konditioniertem Medium (hPCCM)

  1. Nach Ausschluss der Kontamination, behandeln die anhaftenden Zellen (85-90% Zusammenfluss; (1,5 x 10 7 Zellen / Kolben) mit Mitomycin-C (10 ug / ml) für 2 Stunden und 30 Minuten, und dreimal mit 10 ml gewaschen der Zellen PBS. die Zellen mit vorgewärmten Medium inkubiert ohne Mitomycin-C für 24 Stunden.
  2. Einen Tag nach der Behandlung, Inkubation Zellen in 10 ml Medium (DMEM-F12 mit 20% Knock-Out Serumersatz [KOSR] ergänzt, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 1% NEAA und 1% Penicillin-Streptomycin). Nach 24 Stunden Inkubation Ernte CM in einem 15 ml konischen Rohr undfiltern die CM mit einem 0,22 um Spritzenfilter.
  3. In weitere 10 ml der neuen Medium und Inkubation. Sammle alle Überstände der Kulturen täglich für 1 Woche und frieren das geerntete Medium bei -80 ° C. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.

4. Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) und Induktion von pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

  1. Erhalten Menschliche embryonale Stammzelllinien, H1 und H9-Zellen (in der NIH hESC-Registrierung unter dem Namen WA01 WA09 und aufgeführt, respectively) und induzierten pluripotenten Stammzellen iPS-1: iPS (Vorhaut) -1 und iPS-2 (IISH1i- BM) von der WiCell Research Institute (Madison, WI, USA). Zellen sollten aufgetaut und kultiviert werden nach Herstelleranweisungen.
  2. Für die Kontrollgruppe, die Kultur Zellen auf Basalmembranmatrix-beschichteten Schalen in weit verbreiteten feeder freien und serumfreien definierten Kulturmedium bei 37 ° C in 5% CO 2. Zunächst Saatgut 80-100 Klumpen von hPSCs in 35-mm-Gerichte. Wachsen Zellen in diesen Gerichten, bis 70-80% Konfluenz und routinemäßig Gang Zellen für Unter Kultivierung einmal alle 5-6 Tage, mit mechanischen oder enzymatischen Verfahren (Dispase). Wasche die Zellen zweimal mit Medium und der Platte sie in einem Verhältnis von 1: 4. Jeden Tag Ersetzen des Mediums mit frischem Medium.
  3. Für die experimentellen Gruppen, Kulturzellen in hPCCM auf Geschirr mit 0,1% Gelatine vorbeschichtet, und führen Routine Passagierung einmal alle 5 Tage, entweder mechanisch oder enzymatisch. Plattenzellen bei Verhältnissen im Bereich von 1: 6-1: 10. hPSCs heften sich an die Gelatine innerhalb von 2 Tagen nach der Übertragung. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium täglich.

5. Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzellen

HINWEIS: Charakterisieren Sie hPSCs mit verschiedenen Methoden, wie alkalische Phosphatase-Färbung, Immunzytochemie, Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) und Western Blot.

  1. Immunfluoreszenzfärbung
    1. Für immunofluorescencE-Färbung, Kultur hPSCs und fixieren Sie die Zellen in 8-well slide Kammern mit 4% (w / v) Paraformaldehyd für 10 min; Dann permeabilisierten Zellen mit 0,1% (v / v) Triton-X100 für 15 min, und blockieren die Zellen für 1 Stunde mit 3% (v / v) normales Pferdeserum in PBS, enthaltend 0,1% (v / v) Tween- 20. Zweimal waschen PBS für 5 Minuten zwischen jedem Schritt.
    2. Zellen, die mit dem primären Antikörper (OCT-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, Verdünnung von 1: 1000) inkubieren O / N bei 4 ° C und mit dem sekundären Antikörper.
    3. Vor der Montage inkubieren Zellen mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 5 Minuten in der Dunkelheit. Wash Zellen stringent dreimal für jeweils 5 min und Trockenzellen völlig im Dunkeln. Preserve Zellen im Fluoreszenz Eindeckmedium und unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachten.
  2. qRT-PCR
    1. Isolieren Gesamt-RNA aus Zellen unter Verwendung eines RNeasy Mini Kit nach Herstellerangaben und Quantifizierung der extrahierten RNA mit Hilfe eines Nano-Tropfen-Spektralphotometer.
    2. Synthetisieren cDNA durch Zugabe von 2 & mgr; g der Gesamt-RNA zu einer 20 ul-Reaktionsmischung, die Oligo (dT) Primern und Superscript II Reverse Transkriptase; folgen Sie den Anweisungen des Herstellers in diesem Verfahren.
    3. Verstärken die synthetisierte cDNA mit einem Bio-Rad iCycler iQ-System, mit iQ SYBR Green qPCR Master Mix und die in Supplemental Tabelle S1 beschriebenen Primer-Sequenzen. Normalisieren die Zyklusschwellenwerte der Gene von Interesse, die denen von Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH).
  3. Alkalische Phosphatase (AP) -Färbung
    1. Detektieren die AP-Aktivität mit Hilfe des ES-Zell-Charakterisierung Kit nach Vorschrift des Herstellers.
    2. Am Tag 5 aspirieren die Medien und fixieren die hPSCs mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 12 min. Sie overfix nicht; Fixierung von Zellen länger als 2 min wird bei der Inaktivierung der alkalischen Phosphatase führt. Saugen Sie das Fixierungsmittel und spülen Sie mit 1x Rinse Buffer. Unterlassen SieDie Vertiefungen dürfen zwischen den Schritten zu trocknen.
    3. Fügen Sie genug Farblösung in jede Vertiefung (1 ml pro Vertiefung einer 35-mm-Schale) zu decken. Platten im Dunkeln inkubieren bei RT für 15 min.
    4. Nach der Inkubation spülen mit 1x Rinse Buffer. Cover-Zellen mit 1x PBS, um das Trocknen zu verhindern und zu prüfen und die Bild gefärbten Zellen unter Verwendung eines Olympus-Mikroskop.
  4. Western Blot
    1. Western Blot-Analyse durchführen, wie zuvor in 9 beschrieben. Kurz gesagt, bestimmen die Proteinkonzentrationen in Zellysaten. Lösen gleiche Mengen Protein auf einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) -Gel und den Transfer der Proteine ​​auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran.
    2. Blockieren Sie den Blot zu sondieren und es O / N mit unterschiedlichen primären Antikörper bei 4 ° C; anschließend Inkubation des Blots mit HRP-konjugierten Sekundärantikörper für 1 Std. Dreimal für jeweils 10 Minuten Zeit zwischen Inkubationen Waschen Sie die Membran. Erfassen Signale mit einem ECL-Reagenz.
  5. Short Tandem Repeat (STR) Analyse
    1. hPSCs wurden aus der Kontroll- und Versuchsgruppen gleichzeitig Gang, eingesammelt. Genomische DNA wurde unter Verwendung eines DNA Micro Kit extrahiert, entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
    2. Verstärken die genomische DNA für 16 verschiedene Genloci mit der AMPF / STR PCR Amplification Kit nach den Angaben des Herstellers und Kapillarelektrophorese wurde unter Verwendung eines Genetic Analyzer.

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Ergebnisse

Ein Vorteil dieser HPSC Ausbreitungsverfahrens ist, dass es Bauteile aus menschlichen Zellen sekretiert verwendet. Eine am meisten ciritical Schritt im Protokoll ist die Isolierung und Kultur von menschlichen Plazenta-abgeleitete Zellen. Dies erfordert und präzise Präparation von einer genauen Teil der HPC Platte Zotten. 1 zeigt die Vorgehensweise der menschlichen Plazenta abgeleitete Zellisolierung. Dieses Verfahren ist einfach und für die Isolierung von Zellen, und kann leicht innerhalb von 1 h durchg...

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Diskussion

Dieses Modell wurde entwickelt, um hPSCs erfolgreich zu verbreiten, unter Beibehaltung ihrer Eigenschaften, in humanisierter Einzug freien Kulturbedingungen ohne Zusatz von exogenen rekombinanten Wachstumsfaktoren, wie bFGF oder Insulin, so dass die Manipulation von hPSCs in einem humanisierten Mikroumgebung. Exogenem bFGF Ergänzung ist üblich und die Anwendung von Substraten wie Matrigel oder Laminin ist für Feeder-freien Kultur von hPSCs 14.

Dieses Protokoll ist einfach und leic...

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Offenlegungen

Die Autoren zeigen, keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren möchten Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., Associate Professor, Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe, Medical College Korea University) für die Bereitstellung von Plazentagewebe danken. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse (R1211902) von der National Research Foundation of Korea (NRF), Republik Korea unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Mitomycin-CSigma-Aldrich CorporationM428710 μ g/ml
Mykoplasmen-NachweiskitTaKaRa Bio Inc.#6601
MatrigelBD Biowissenschaften#354277
mTeSR1STEMCELL Technologies Inc.#05850
DispaseWorthington Biochemical CorporationLS021001 mg/ml
GelatineSigma-Aldrich CorporationG25000,10
BM-CyclinRoche799 05010 μ g/ml
RNeasy Mini-Bausatz Qiagen74104
Nano-Drop-SpektralphotometerThermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix Bio-Rad Laboratories#170-8882AP
ES-ZellcharakterisierungskitChemicon International, Inc.,SCR001
Power cDNA-Synthesekit iNtRON Biotechnologie25011
QIAamp® DNA-MikrokitQiagen56304
AmpF/STR® Identifiler® PCR-AmplifikationskitApplied Biosystems Inc.
Angewandte Biosysteme® 3130xl Genetischer Analysator Applied Biosystems Inc.
% 4322288

Referenzen

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