Methodenartikel

Reinigung von Maus-Hirngefäße

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DOI:

10.3791/53208

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10. November 2015

 ,  ,  , 
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie, Université Paris Diderot

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll, das die Reinigung des Gefäßkompartiments des Mäusegehirns ermöglicht. Zu den isolierten Hirngefäßen gehören Endothelzellen, die durch Tight Junctions verbunden und von einer durchgehenden Basallamina umgeben sind, Perizyten, vaskuläre glatte Muskelzellen sowie perivaskuläre Astrogliamembranen.

Zusammenfassung

Im Gehirn, die meisten der Gefäßsystem besteht aus einem selektiven Schranke, die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Austausch von Molekülen und Immunzellen zwischen dem Gehirn und dem Blut reguliert. Darüber hinaus erfordert die große neuronale metabolischen Bedarf einen Moment zu Moment Regulation des Blutflusses. Bemerkenswert ist, Anomalien dieser Regelungen sind ätiologische Markenzeichen der meisten Hirnerkrankungen; einschließlich Glioblastom, Schlaganfall, Ödeme, Epilepsie, degenerative Erkrankungen (Beispiel: Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit), Hirntumoren sowie entzündlichen Erkrankungen, wie Multiple Sklerose, Meningitis und Sepsis-induzierten Hirnfunktionsstörungen. So, das Verständnis der Signalwege Modulation der zerebrovaskulären Physiologie ist eine große Herausforderung. Viel Einblick in die zellulären und molekularen Eigenschaften der verschiedenen Zelltypen, die den zerebrovaskulären System besteht aus einer Primärkultur oder Zellsortierung von frisch gewonnenen Hirngewebe gewonnen werden. Jedoch,Eigenschaften wie die Zellpolarität, Morphologie und inter Beziehungen nicht in solchen Zubereitungen gehalten. Das Protokoll, das wir beschreiben soll Hirngefäß-Fragmente zu reinigen, während die strukturelle Integrität. Wir zeigen, dass isolierte Gefäße bestehen aus Endothelzellen durch Tight Junctions, die durch eine kontinuierliche Basallamina umgeben sind versiegelt. Perizyten bleiben glatten Muskelzellen sowie die perivaskuläre Astrozyten Endfüßen Membranen Endothelschicht befestigt. Schließlich beschreiben wir, wie Immunfärbung Experimente an gereinigt Hirngefäße durchzuführen.

Einleitung

Die einwandfreie Funktion des zentralen Nervensystems (ZNS) erfordert einen stark regulierten extrazellulären Umgebung, und seine metabolischen Anforderungen sind riesig im Vergleich zu anderen Organen 1. Das ZNS ist auch extrem empfindlich gegenüber einer Vielzahl von Chemikalien, in der Regel unschädlich für periphere Organe, sondern sie neurotoxische. Um eine einwandfreie Funktion zu gewährleisten, bildet der größte Teil der CNS 'Gefäßsystem eine Endothelbarriere; die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Fluss der Moleküle und Ionen sowie die Passage von Immunzellen, die zwischen dem Blut und dem Gehirn steuert, wodurch die richtige Homöostase 2 beibehalten, sondern auch die Eingabe von therapeutischen Arzneimitteln einschränkende Weise behindern Behandlungen neurologische Störungen 3. Auf zellulärer Ebene ist die BBB hauptsächlich durch umfangreiche tight junctions zwischen Endothelzellen, polarisierte Expression von Efflux-Transporter und einem sehr niedrigen Transzytose Rate 4 aufrechterhalten. Eigenschaften und Funktionen der BBB sind meist von ne induzierteighboring Zellen 4. Insbesondere spielen Perizyten eine wichtige Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung des BBB 5,6. Als kontraktilen Zellen Perizyten, regulieren auch die Durchblutung 7 als die glatten Muskelzellen umgebenden großen Gefäßen zu tun. Schließlich Astrozyten, die großen gliale Zellen des Gehirns, zu senden große Prozesse Endfüßen herum gestattet meisten Gehirngefäß 8 und modulieren BBB Integrität und Immun quiescence 9, den Transfer von Stoffwechselprodukten der Neuronen 10 und induzieren die enge Kopplung von neuronaler Aktivität und Blutung 11,12.

Die Fähigkeit, die molekularen und zellulären Eigenschaften des zerebrovaskulären Systems zu studieren, ist entscheidend, um eine bessere Charakterisierung ihres Beitrags zur Gehirnphysiologie und Arzneimitteltherapie. Um diese Frage anzugehen, Strategien, um das Gehirn die zerebrovaskuläre System zu isolieren sind entwickelt worden, die für die Herstellung von intakten Gehirn Schiffes Fragmente zu ermöglichen. Hirngefäßes purification wurde anfänglich unter Verwendung von Rinder Gehirne 13 beschrieben und verbessert und an andere Spezies, insbesondere Nagetieren 14. In dieser letzten Untersuchung wurde die Verwendung von Filtern unterschiedlicher Größe eingebracht, um den Hirngefäßen in den Fraktionen in Gefäße unterschiedlicher Durchmesser angereichert trennen. Interessant ist, dass in solchen Zubereitungen, hielt Endothelzellen ihren metabolischen Eigenschaften 15, Transporter Funktionen 16 und 17 Polarisations. Hier beschreiben wir im Detail dieses Protokoll und weiter zu zeigen, dass isolierte Gefäße behalten die meisten ihrer in situ-Strukturen. Endothelzellen bleiben tight junctions verbunden und durch eine kontinuierliche Basallamina umgeben. Perizyten und Zellen der glatten Muskulatur bleiben der Endothelschicht sowie perivaskuläre Astrozyten Membranen angebracht. Jedoch Astrozyten Mikroglia-Zellen, Neuronen und Oligodendrozyten eliminiert. Schließlich beschreiben wir ein Verfahren durchzuführen Immunfärbung auf isolierte Hirngefäße.

Bis jetzt die meisten der molekularen und zellulären Untersuchungen zur zerebrovaskulären Systems haben auf gereinigt Hirngefäßzellen durch distanzierte geführt Zellsortierung unter Verwendung von zellspezifischen Reportermausstämmen oder Immunfärbung basierte Verfahren 18,19. Obwohl diese Techniken können zur Isolierung von fast reinem zerebrovaskulären Zellpopulationen, isolierte Zellen vollständig verlieren ihre in situ Morphologie und Wechselwirkungen, die wiederum stark ihre molekularen und zellulären Eigenschaften betrifft. Das hier beschriebene Protokoll, so dass für die Isolierung von Gesamt zerebrovaskulären Fragmente ohne Notwendigkeit von spezifischen Antikörpern oder transgene Maus Flecken, bietet eine gute Alternative, da die Gesamtstruktur der isolierten Hirngefäße konserviert somit Verminderung Auswirkungen auf ihre molekularen Eigenschaften. Isolated Schiffe könnten dann für die Untersuchung der Genaktivität, Proteinsynthese und Regulierung an der BBB verwendet werden, wie kürzlich beschrieben 20,21 . Schließlich, im Vergleich zu Laser Mikrodissektion 22,23 Dieses Protokoll ist kostengünstig, einfach durchzuführen und in jedem Labor schnell anpassungsfähig.

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Protokoll

1. Lösungen und Materialien

  1. Bereiten Isolationsgefäß Lösungen: B1, fügen Sie 1,5 ml HEPES 1M zu 150 ml HBSS; B2, fügen 3,6 g Dextran zu 20 ml B1; B3, wird 1 g BSA in 100 ml B1.
  2. Ändern Sie den Filterhalter durch das Schneiden des Boden off der oberen Verschraubung Teil.
  3. Bereiten Immunfärbung Lösungen: Fixierungslösung, 4% Paraformaldehyd in PBS pH 7,4; Permeabilisierung / Blockierlösung, verdünnter Ziegenserum zu 5% und Triton X100 auf 0,25% in PBS pH-Wert 7,4.
    Anmerkung: Die Fixierung ist abhängig von der Art der primären Antikörper verwendet.

2. Dissection

Anmerkung: Sterile Bedingungen nicht erforderlich ist, es sei denn, Schiffe für Zellkulturzwecke verwendet.

  1. Bereiten ein 150 ml Becherglas mit 20 ml B1. Halten Sie auf dem Eis geben und mit Parafilm um die Luftverunreinigung zu vermeiden.
  2. Die Maus tief betäuben unter einer Haube mit einer kleinen Papiertuch in 1 ml reinem Isofluran, die int hinzugefügt wird eingeweichto den Käfig. Anästhesie wird durch eine fehlende Reaktion auf eine Zehe pinch verifiziert. Tötet die Maus durch Genickbruch.
    Hinweis: Diese Schritte werden in Übereinstimmung mit nationalen und institutionellen Regelungen durchgeführt.
  3. Optional: intrakardiale Perfusion mit 20 ml PBS 1x, die Blut-Gehalt 24 zu eliminieren.
  4. § die Haut mit einem Skalpell aus dem Hals auf die Nase und ziehen Sie sie. Entfernen Sie alle verunreinigenden Haare mit PBS 1x.
  5. Um den Schädel zu öffnen, erste Schereneinsatz nach vorn, um den Riechkolben, und öffnen Sie die Schere, um den Schädel in zwei Teile brechen.
  6. Das Gehirn mit einem Hirn Spachtel vorsichtig entfernen. Präparieren Sie die Plexus choroideus der Seitenventrikel, wie sie das Blutgefäß Vorbereitung 38 kontaminieren würde.
    HINWEIS: Optional: Die letzten Vorbereitungen werden parenchymalen und Hirnhäute Gefäße enthalten. Wenn nicht gewünscht wird, kann im Anschluss an die Meningen off von 38 beschriebene Verfahren abgezogen werden.
  7. Transfer das Gehirn in das Becherglas mit B1-Lösung auf Eis. Bis zu 8 Köpfe zusammen behandelt werden.

3. Gehirngewebe Homogenisierung

  1. Mit Hilfe von zwei Skalpelle, manuell und kräftig zu schlagen, das Gehirn in der B1-Lösung anschließend Erhalt kleine Stücke von etwa 2 mm.
  2. Homogenisieren, die Vorbereitung mit einem automatisierten Dounce Homogenisator, die Durchführung 20 Hübe bei 400 Umdrehungen pro Minute. Sicherzustellen, dass die Glasröhre wird in Eis und dass der obere Teil des douncer in Lösung ist, wenn und ab bewegt, um so die Bildung von Lufttaschen zu verhindern, gehalten. Wenn mehrere Proben hergestellt, waschen Sie die douncer mit ionisiertem Wasser zwischen jeder Homogenisierung.

4. Vessel Reinigung

  1. Übertragen des Homogenisats in einen 50-ml-Kunststoffrohr und gehen in die Zentrifugation bei 2.000 g für 10 min bei 4 ° C. Eine große weiße Schnittstelle (meist Myelin), werden am oberen Ende des Behälters Pellet (Rot bilden, wenn keine Perfusion erfolgte).
  2. Überstand verwerfen. Das Gefäß und das Pellet weiß Schnittstelle miteinander verbunden bleiben. In 20 ml eiskaltem B2-Lösung und manuell und kräftig schütteln Sie das Röhrchen 1 min.
  3. Verfahren zur zweiten Zentrifugation bei 4.400 g für 15 min bei 4 ° C. Das Myelin wird nun eine dichte weiße Schicht auf der Oberfläche des Überstandes.
  4. Vorsichtig abziehen der Myelinschicht von den Rohrwänden durch Halten des Rohres und langsam drehen, damit der Überstand, um an den Wänden bestehen. Verwerfen Myelin mit dem Überstand. Das Pellet, das die Gefäße bleibt an der Unterseite des Rohres angebracht ist.
  5. Tupfen Sie die Innenwand des Rohres mit einem saugfähigen Papier um eine 5 ml Plastikpipette eingewickelt und entfernen Sie alle Restflüssigkeiten und berühren nicht die Gefäß Pellet. Halten Sie das Röhrchen kopfüber auf ein saugfähiges Papier um Restflüssigkeiten zu entleeren.
  6. Hängen Sie das Pellet in 1 ml eiskaltem B3-Lösung durch Auf- und Abpipettieren mit Low-Bindung Tipps, keeping die Röhrchen auf Eis, fügen Sie dann weitere 5 ml B3-Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Schiffe sind so weit wie möglich verteilt und keine Aggregate bilden.

5. Filtration

  1. Bereiten Sie ein Becherglas auf Eis mit 30 ml eiskaltem B3-Lösung. Deckel mit Parafilm um die Luftverunreinigung zu vermeiden.
  2. Legen Sie eine 20 & mgr; m-Sieb-Filter auf einer modifizierten Filterhalter auf der Spitze eines becker Kolben und ins Gleichgewicht, indem 10 ml eiskaltem B3-Lösung.
  3. Gießen Sie das Gefäß Vorbereitung auf dem Filter und spülen Sie die Gefäße mit 40 ml eiskaltem B3-Lösung.
  4. Recover den Filter mit sauberer Pinzette und sofort eintauchen in das Becherglas mit dem B3-Lösung. Trennen Sie die Geräte vom Filter von ihr leichtes Schütteln.
  5. Gießen des Bechers Gehalt in einem 50 ml Kunststoffröhrchen und Zentrifugation bei 2.000 g für 5 min bei 4 ° C.
  6. Hinweis: Alternativ können die Hirngefäße "Suspension aus Schritt 4.6 auf eine 100 & mgr; m-Sieb-Filter gefiltert werden.In diesem Fall werden größere Gefäße vorzugsweise auf dem Filter zurückgehalten, während die Durchfluss enthält Mikrogefßen (hauptsächlich Kapillaren), die dann auf einem 20 & mgr; m-Mesh-Filter, wie oben filtriert werden.
  7. Das Pellet von Mikrogefäßen in 1 ml eiskaltem B3-Lösung und überträgt es durch Pipettieren es in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Zentrifugation bei 2.000 g für 5 min bei 4 ° C.

6. Fixierung, Permeabilisierung und Blocking

  1. Transfer Gefäße durch Pipettieren in 0,2 ml PCR-Röhrchen mit PBS unter Verwendung einer 1,0 ml geringe Bindungsspitze. Darauf achten, nicht zu berühren die Gefäße, da sie nach außen Teil der Spitze halten. Führen Sie alle folgenden Schritte unter einem Binokular.
  2. Für jede der folgenden Mediums ändert, lassen Sie die Röhrchen auf Eis, bis die Schiffe haben den Boden erreicht, und Pipetten die meisten der Flüssigkeiten mit langen und etwas Gel-Loading-Pipettenspitzen.
  3. Entfernen Sie die meisten der PBS und fügen Sie 200 ul der Fixierlösung.Suspend die Gefäße durch leichtes Schütteln und Inkubation für 20 min bei RT.
  4. Pipettieren Sie die Fixierungslösung und ersetzen Sie es mit 200 ul 1x PBS (erste Wäsche), Inkubation für 5 min bei RT und wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal. Jedes Mal, wenn Sie sicher, dass Schiffe, korrekt auf den Boden der Röhrchen und Pipette aus 1x PBS versenkt, wodurch die Behälter nicht berührt.
  5. Nach dem letzten Wasch ersetzen 1x PBS durch die Permeabilisierung / Blockierlösung und Inkubation 1 h bei RT, Resuspendieren der Schiffe, die von sanft von Zeit zu Zeit schütteln.

7. Immunfärbung

  1. Ersetzen Sie die Permeabilisierung / Blocking-Lösung mit der Mischung aus primären Antikörpern (siehe Referenzen der in der Materialvorlage Tabelle verwendet und Verdünnungen Antikörper) in der Permeabilisierung / Blockierlösung verdünnt, und Inkubation bei 4 ° CO / N.
  2. Nach 3 Waschschritten in PBS bei RT inkubieren die Gefäße mit der Mischung aus Sekundärantikörper in PBS für 2 Stunden verdünntbei RT.
  3. Hinweis: Wir empfehlen dringend, Kernfärbung mit Hoechst (1: 2.000) oder DAPI (1: 2000), um die Schiffe vor möglichen verunreinigenden Haare oder Staub unter dem Mikroskop zu unterscheiden.
  4. Nach 3 Waschungen in PBS, Resuspendieren der Gefäße in 50 ul PBS.

8. Montage und Beobachtung

  1. Bereiten Sie eine Spitze mit einem silikonisierten Glaskapillare: schneiden Sie ein P200 Pipettenspitze mit einem Skalpell und stellen Sie die Kapillare im Inneren. Das ungefähre Volumen der Kapillare 40 ul.
  2. Übertragen Sie die Schiffe auf einem Glasobjektträger mit dem silikonisierten Glaskapillare und entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit einem Stück saugfähigem Papier.
  3. Tragen Sie einen einzigen Tropfen Eindeckmedium auf die Schiffe, und halten Sie ein Deckglas bei 45 ° so dass der Tropfen, um entlang der Kante der Schlupf zu verbreiten. Lassen Sie aus dem Deckglas und lassen mittel- bis langsam ausbreiten. Lassen Sie es trocken O / N bei RT unter Lichtschutz. Schiffe unter einer fluoreszier beobachtenent konfokalen Mikroskop.

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Ergebnisse

Hier haben wir ein Protokoll, so dass für die mechanische Isolierung des Hirngefäße 14 zu beschreiben. Abbildung 1 fasst die wichtigsten Schritte dieser Technik. Die Architektur der Hirngefäße ist komplex und umfasst mehrere Zelltypen, dh, Endothelzellen von tight junctions verschlossen und von Perizyten, glatte Muskelzellen und Astrozyten Fußfortsätzen 9 umgeben. So nach der Isolierung der Gehirngefäße, war es unser Ziel, die Struktur des gereinigten Gefäße durch Immunfär...

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Diskussion

Die Blut-Hirn-Schranke regelt den Durchgang von physiologischen Substanzen in und aus dem ZNS und schützt sie vor im Blut vorhandenen möglicherweise schädlichen Substanzen. Es wird in verschiedenen ZNS-Erkrankungen beteiligt, darunter neurodegenerative Erkrankungen 2 und Hirntumoren 28. Der extrem niedrige Durchlässigkeit des BBB behindert auch den Durchgang von Therapeutika gezielt Nervenzellen und die Entwicklung von Methoden der Absicht, reversibel öffnen Sie die BBB ohne nachteilige Folgen für ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Labex MemoLife und durch die ARSEP unterstützt (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en Plaques)

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Tissue-Grinder Größe CThomas scientific3431E25
Zentrifuge 5415  REppendorf
Zentrifuge 5810 REppendorf5811000320
Leistungsstarkes, modulares StereomikroskopLeicaMZ6
Compact System bietet hochwertige Leica LED1000LeicaLED1000
Low-Binding-Spitzen (P1000)Sorenson BioScience14200T
Swinnex 47 mm Filterhalter PP 8/PkMilliporeSX0004700
Netzfilterscheibe aus Nylon Hydrophil 20 & micro; m 47 mm 100/PkMilliporeNY2004700
Netzfilterscheibe aus Nylon Hydrophil 100 & Mikro; m 47 mm 100/PkMilliporeNY1H04700
Standardwandige BorosilikatrohreSutter InstrumentB150-86-7.5
ObjektträgerThermo Scientific1014356290F
Deckgläser, Dicke 1Thermo ScientificP10143263NR1
0,2 ml Dünnwandige Tuben und gewölbte KappeThermo ScientificAB-0266
  PARAFILM M (Rollengröße 4 Zoll & mal 125 ft)SigmaP7793-1EA
HBSS, kein Kalzium, kein Magnesium, kein PhenolrotLife-Technologie14175-129
HEPES (1M)Life-Technologie15630056
Dextran von Leuconostoc spp. Herr ~70.000Sigma31390
RinderserumalbuminSigmaA2153
10x PBSEuromedexET330
16% Formaldehyd (w/v), Methanolfrei Thermo Scientific28908
Triton X-100SigmaX100
bisBenzimid H 33342 Trihydrochlorid (Hoechst)Sigma14533
Eindeckmedium Fluormount-GSouthern Biotech0100-01
Isolektin GS-IB4 Aus Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Konjugat; Verdünnung 1/100Life technologyI21411
Agrin (Kaninchen) ; Verdünnung 1/400freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (Maus, Klon 1A12)Life technology33-9100Verdünnung 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (Maus, Klon 1A4)SigmaA2547  Verdünnung 1:500
Anti GFAP (Maus, Klon GA5)SigmaG3893  Verdünnung 1:500
Anti AQP4 (Kaninchen)SigmaA5971  Verdünnung 1:500
Anti Cx43 (Maus, Klon  2)BD Biosciences610061  Verdünnung 1:500
Anti Olig2 (Kaninchen)MilliporeAB9610  Verdünnung 1:200
Anti NF-M (Maus)zur Verfügung gestellt von Dr. Beat M. Riederer, Universität Lausanne, Schweiz.  Verdünnung 1:10
Anti Iba1 (Kaninchen)Wako019-19741  Verdünnung 1:400
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG (H+L) AntikörperLife TechnologieA11029  Verdünnung 1:2.000
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 KonjugatLife-TechnologieA11034  Verdünnung 1:2.000
Alexa Fluor 555 Ziege Anti-Maus IgG (H+L) AntikörperLife TechnologieA21424  Verdünnung 1:2.000
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555 KonjugatLife-TechnologieA21429  Verdünnung 1:2.000

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