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Summary

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Abstract

Dysfunktionalen Skelettmuskel Mitochondrien spielen eine Rolle in Zusammenhang mit der Alterung, Übergewicht und Diabetes Typ II beobachtet veränderten Stoffwechsel. Mitochondriale respirometrischen Assays aus isolierten Mitochondrien Zubereitungen erlauben die Beurteilung der Mitochondrienfunktion sowie die Bestimmung des Mechanismus (en) der Wirkung von Arzneimitteln und Proteinen, die den Stoffwechsel modulieren. Aktuelle Isolierungsverfahren erfordern häufig große Mengen von Gewebe, um qualitativ hochwertige Mitochondrien für respirometrischen Assays notwendig ergeben. Die hier vorgestellten Methoden beschreiben, wie hohe Qualität gereinigt Mitochondrien (~ 450 & mgr; g) von geringen Mengen (~ 75-100 mg) von Maus-Skelettmuskel isoliert werden für den Einsatz in Hochdurchsatz-Atemmessungen. Wir stellten fest, dass unsere Trennung Verfahren ergibt 92,5 ± 2,0% intakte Mitochondrien durch Messung Citrat-Synthase-Aktivität spektralphotometrisch. Darüber hinaus Western Blot-Analyse in isolierten Mitochondrien führte das schwache Expression des cytosolic Protein, GAPDH und die robuste Expression des mitochondrialen Proteins, COXIV. Die Abwesenheit eines bekannten GAPDH Band in den isolierten Mitochondrien indikativ für kleine Verunreinigungen von nicht mitochondrialen Quellen während des Isolierungsverfahrens. Am wichtigsten ist, die Messung des _O 2 Verbrauchsrate mit Mikroplatte basierte Technologie und Bestimmen des respiratorischen Steuerungsverhältnis (RCR) für gekoppelte respirometrischen Assays zeigen hoch gekoppelt (RCR,> 6 für alle Assays) und funktionelle Mitochondrien. Im Ergebnis ist die Zugabe eines separaten Zerkleinern Schritt und Motor angetrieben Homogenisierungsgeschwindigkeit eines zuvor beschriebene Verfahren erheblich reduziert ist die Isolierung von hoher Qualität und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskel, in stark gekoppelt Mitochondrien, die mit hoher Funktions respire Ergebnisse führten während auf Mikrotiterplatte respirometirc Assays.

Introduction

The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis^1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes^3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies^3-5.

Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species^6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays.

Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several µg per well⁸. Therefore, we present a modification of previously published methods⁷ to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O₂ consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research^9,10.

Protocol

Tierexperimentelle Studien wurden im Rahmen einer genehmigten Protokoll von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee durchgeführt am Virginia Polytechnic Institute und State University. 1. Setup (Zeit: ~ 45 min) Tauwetter gefrorenen Filialen von 0,25% Trypsin, Isolation Puffer für Mitochondrien (IBM) 1 und IBM2 in einem 37 ° C Wasserbad. Spülen Sie Gläser und Sezieren Instrumente in 70% Ethanol, gefolgt von hochreinem Wasser. Bereiten 0,05% Trypsin-Lösung von 0,25% Trypsin Lager durch Verdünnen von 1 Teil Trypsin in 4 Teilen IBM1. Mischen Sie Protease und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail mit Zelllysepuffer (1: 100-Verhältnis) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss. Aliquots von 5 ml (5 ml / Maus) von 0,05% Trypsin in ein 15 ml Kunststoffröhrchen. Set Motor angetrieben Gewebehomogenisator zu 80 RPM. 2. Isolierung der Skelettmuskulatur Mitochondrien (Zeit: ~ 90 min) Euthanize eine Maus mit CO 2 </sub> Einatmen, gefolgt durch zervikale Dislokation. Entfernen Sie rote Muskel von der Quadrizeps und M. gastrocnemius, der die soleus (~ 75-100 mg insgesamt), wie in den folgenden Schritten beschrieben beinhaltet: Schälen Sie die Haut in Richtung der Maus. Entfernen Sie die Fettpolster über der Quadrizeps-Ursprungspunkt. Schneiden Sie die Quadrizeps-Sehne, die die Kniescheibe mit feiner Spitze Schere angebracht ist. Hinweis: Der Quadrizeps durch seine anatomische Position an dem vorderen Abschnitt des proximalen Femur identifiziert. Langsam schnippeln die Aponeurose zwischen dem Knochen und der Quadrizeps, unter Vermeidung der Oberschenkelschlagader, um die Quadrizeps aus dem Knochen zu befreien. Schneiden Sie die Sehne mit feiner Spitze Schere am Ursprungspunkt auf dem Femur um den Quadrizeps zu befreien und legen Sie die Quadrizeps in gekühltem PBS. Entfernen Sie sichtbaren Fettgewebe in den Quadrizeps mit einer Schere. Flip Quadrizeps um, so dass der Teil des Muskels, der über den Oberschenkelknochen wurde zugewandt ist uSeite Öffnen Sie die Quadrizeps mit einer Pinzette in einem pendelnden Bewegungen. Entfernen Sie die beiden sichtbaren roten Muskelabschnitte von jedem Lappen mit feiner Spitze Schere und in ein Becherglas mit 5 ml gekühlt IBM1. Hinweis: Quadrizeps als zwei Lappen mit einem Streifen aus roten Muskel in der Nähe der Seitenkante jedes Flügels angeordnet angezeigt. Schneiden Sie die Haut über der Achillessehne mit feiner Spitze Schere und schälen die Haut in Richtung der Maus. Schneiden Sie die freiliegenden Achillessehne und schälen die Muskeln auf den Körper der Maus. Schneiden Sie die Sehne am lateralen und medialen Kondylen des Oberschenkelknochens mit feiner Spitze Schere, um die gastrocnemius zu befreien und legen Sie die gastrocnemius, seine Sehnen in gekühltem PBS angeschlossen. Klappen Sie den gastrocnemius auf und ziehen Sie die Soleusmuskel und legen Sie in den Becher, die 5 ml gekühlt IBM1. Fan öffnen Sie die gastrocnemius. Entfernen Sie die drei visuellen roten Muskelabschnitte (zwei seitlichen und einem medialen oberflächliche rote Streifen) mit feinen Spitzen versehenen Scherens und übertragen diese zu dem Becherglas gegeben, 5 ml gekühlter IBM1. Entfernen weiteres ~ 75-100 mg von roten Muskel aus dem anderen Schenkel des Maus (wie in Schritt 2.2 beschrieben) und in einen 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und Zelllyse-Puffer (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Natriumdodecylsulfat, 0,5% Natriumdeoxycholat, 1% Polyoxyethylen (9) nonylphenylether, verzweigt. Unmittelbar Blitz-einfrieren dieses zweite Probe in flüssigem Stickstoff für die spätere Verwendung in Western Blot (siehe Schritt 6.1). Legen Sie eine vorgekühlte, flache Kunststoffoberfläche auf Eis in einem großen Eimer. Gießen Sie einen Tropfen IBM1 auf die Kunststoffoberfläche und verwenden Pinzette, um das gesamte geschnittene rote Muskel (Schritt 2.2.4 und 2.2.7) in IBM1 Tröpfchen zu platzieren. Hackfleisch das Muskelgewebe für 2 min mit 3 Einzelklingen durch Ändern Rasierer alle 40 sec. Übertragen des zerkleinerten Gewebes mit einem neuen Becherglases mit 5 ml frischem IBM1, indem die Kunststoffoberfläche, über the-Becherglas und Abkratzen der Muskeln in den Becher mit einer Rasierklinge. Nutzen Sie diese Lösung und lassen es durch einen 100 & mgr; m Zellsieb auf eine 50 ml konischen Röhrchen platziert. Tupfen Sie das Gewebe mit einer heiklen Aufgabe Wischer und dann übertragen sie in 5 ml 0,05% Trypsin-Lösung. Verwenden einer Pinzette, um das Gewebe von der Aufgabe Wischer zu entfernen. Inkubieren des Muskelgewebes auf Eis für 30 min in 0,05% Trypsin-Lösung. Spinnen Sie die 15 ml konischen Röhrchen mit Trypsin / Muskel Mischung bei 200 × g für 3 min bei 4 ° C. Gießen Sie die Trypsin-Überstand in einen Abfallbehälter und das Pellet mit 3 ml eiskaltem IBM1. Übertragen Sie das Gewebe bis zu einer 45 ml Glas-Homogenisator Rohr. Mit einem weiteren 1,5 ml IBM1 Spülen Sie die 15 ml konischen Röhrchen, um alle verbleibenden Proben sammeln und fügen Sie diese in die Glas-Homogenisator Rohr. Legen Sie das Glas-Homogenisator Rohr in ein Becherglas oder Kunststoffbehälter gefüllt zur Hälfte mit Eis, so dass die Glas-Homogenisator bewegt sich minimal in das Becherglas. <li> Homogenisieren des Gewebes / IMB1 Mischung mit den PTFE-Pistill zu einem Motor angetrieben Gewebehomogenisator mit 10 Durchgängen bei 80 UpM angebracht ist. Halten Sie den unteren Rand jeder Pass für ca. 2 Sek. Übertragen Sie die Gewebehomogenat auf ein neues 15 ml konischen Rohr und spülen Sie das Glas-Homogenisator Rohr mit 6,5 ml IBM1. Gießen Sie die IBM1 in die 15 ml konischen Röhrchen mit Gewebehomogenat. Spin der konischen 15 ml-Röhrchen bei 700 g für 10 min bei 4 ° C. Gießen Sie vorsichtig den Überstand in ein Glas mit hoher Festigkeit Zentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Spin der Überstand aus dem obigen Schritt bei 8.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und IBM1 resuspendieren Sie das Pellet durch langsame Zugabe von 500 ul IBM2. Schnitt das Ende einer Pipettenspitze und schonend homogenisiert das Pellet in IBM2 mit Mischen und Rühren von Bewegungen. Fügen Sie ein weiteres 4,5 ml IBM2 zu der Mischung, nachdem das Pellet vollständig aufgehängt ist. Hinweis: Vermeiden Sie übermäßige Verreiben, während brechen größere Pellet Stücke tsein kann die Mitochondrienmembranen beschädigen. Spin der IBM2 / Gewebehomogenisat bei 8.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Hinweis: Dieser Schritt kann in einem sauberen hohe Festigkeit Zentrifugenröhrchen für eine genauere Quantifizierung der Protein isolierten Mitochondrien in Schritt 4, da Rest BSA wiederholen kann, um den Gesamtproteingehalt beiträgt. Entfernen Sie den Überstand und sanft, aber vollständig resuspendieren Sie das Pellet durch Zugabe von zwei 25 & mgr; l-Schritten IBM2 mit einer Pipettenspitze mit der Spitze abgeschnitten. Vorsichtig umrühren und mischen das Pellet nach jeder Zugabe von 25 ul IBM2. Dieses mitochondriale Lager auf Eis. 3. Homogenisierung Whole Gewebelysat (Zeit: ~ 45 min; kann getan werden während Schritt 7) Entfernen Sie den Muskel aus, dass in den flüssigen Stickstoff aus dem Schritt 2.3 gelegt und bei Raumtemperatur, bis sie vollständig aufgetaut. Hackfleisch das Gewebe für ~ 30 sec auf Eis mit feiner Spitze Schere. Fügen Sie zwei 100 ul Kugeln Zirconium-Perlen mit dem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss aus Schritt 3.2, die das zerkleinerte Gewebe enthält. Homogenisieren des Gewebes in einer Perlmühle Gewebehomogenisator mit zwei, um drei 5-Minuten-Zyklen bei einer Geschwindigkeitseinstellung von 4-6 (mittlere Einstellung). Spin der Mischung aus Schritt 3.3 bei 12.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand mit einer 1.000 ul Pipettenspitze nach dem Spin und Transfer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Entsorgen Sie das Pellet und platzieren Sie den Überstand auf Eis. 4. Proteinbestimmung (Zeit: ~ 30 min) Bestimmung der Proteinkonzentration des gesamten Gewebelysat (Schritt 3.4) und mitochondriale Lager (Schritt 2.17) unter Verwendung des BCA-Protein-Assay-Kit nach den Angaben des Herstellers. 5. Mitochondrien Membranintegrität; Citratsynthase (CS) Activity (Zeit: ~ 15 min) Machen Sie zwei 1: 20-Verdünnungen der mitochondrialen Lager in hochreinem Wasser. Hinzufügen0,1% Triton X-100 zu einer Probe und beschallen es bei einer niedrigen Einstellung (765 Watts, Amplitude 2). Lassen Sie die anderen Verdünnung auf Eis. Bringen Sie die Probe auf Eis nach der Beschallung. Führen Citratsynthase Assay sowohl die nicht-beschallte und beschallt mitochondrialen Verdünnungen mit einem spektrophotometrischen Test, wie zuvor beschrieben 11,12. Bestimmen Sie den Prozentsatz der intakten Mitochondrien-Membranen unter Verwendung der folgenden Gleichungen: (Non-beschallt CS Aktivität ÷ beschallt CS-Aktivität) * 100 100- N (Prozent von oben erreicht) 6. Mitochondrien Isolation Qualität; Western Blot (Zeit: Nach Lab Protocol) Zuführen Western Blot auf die gesamte Gewebelysat und isolierte Mitochondrien, wie zuvor beschrieben 12. Anmerkung: Die Verwendung Primärantikörper für GAPDH (1: 1.000 Verdünnung in 5% BSA / TBS-T) und COXIV (1: 1.000 Verdünnung in 5% fettMilch / TBS-T), gefolgt von anti-Ziege und Kaninchen-Sekundärantikörper, die jeweils (1: 10.000). 7. Respirometrische Testlauf (Zeit: ~ 90 min) Führen Sie gewünschte respirometrischen Tests unter Verwendung von Mikroplatten-basierten O 2 Verbrauchsmesstechnik, wie zuvor beschrieben (siehe Begleitartikel und Rogers et al 8). Bestimmen Sie die Atemkontrollverhältnis (RCR) durch Division State 3 durch staatliche 4o (RCR) oder Division Staat 3U durch staatliche 4o. Verwenden Sie entweder die mittlere (durchschnittliche) Punkt oder die höchste (State 3) und die niedrigsten Preise (State 4o) von den Punkt-zu-Punkt-Spuren bei der Ermittlung RCR.

Representative Results

Citrat-Synthase-Aktivität als Maß für die Unversehrtheit der Membran, da Citratsynthase ist in der inneren Mitochondrienmembran, und sollte daher nicht in Suspensionen von Mitochondrien mit intakten Membranen vorliegen. 1 stellt Citrat-Synthase-Aktivität in nicht-beschallten mitochondrialen Proben verglichen, die mit beschallter Proben aus der gleichen Isolation. Beschallen der Mitochondrien führt zu einem statistisch signifikanten Anstieg der Citrat-Synthase-Aktivität (P <0,01). Wichtig ist, d…

Discussion

Die hier vorgestellten Methoden liefern eine detaillierte Beschreibung eines mitochondrialen Isolierungsverfahren von minimalen Mengen (~ 75-100 mg) von Maus-Skelettmuskel. Dieses Isolierungsverfahren ist in der Lage, High-Functioning, reine Mitochondrien (~ 450 & mgr; g) zu ergeben, wie durch _O 2 Verbrauchsraten, RCR-Werte, Maximal Citrat-Synthase-Aktivität und Proteinexpression von Immunoblotting nachgewiesen. Wichtig ist, dass die Mitochondrien von diesem Verfahren getrennt für mehrere respirometirc …

Materials

Essentially Fatty	Sigma Aldrich	A6003	N/A
Acid Free- BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	Sigma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	N/A
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200-056	N/A
Sodium Chloride<br/> White Crystals or Crystalline Powder<br/> &ge;99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771&nbsp;	N/A
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750&nbsp;	N/A
Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched	Sigma Aldrich	238651	N/A
Single Edge Razor Blades	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers	Fisher Scientific	352360	N/A
Halt Protease &amp; Phosphatse Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	1861284	N/A
1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap	Thermo Scientific	3474	N/A
Zirconium Oxide beads	Fisher Scientific	C9012112	N/A
GAPDH antibody (1D4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N/A
Anti- COXIV antibody	Cell Signaling	4844s	Any mitochondrial inner membrane protein will suffice
Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	711-035-152	N/A
Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearh	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;	Thermo Scientific	23225	N/A
Pyruvic Acid, 98%	Sigma Aldrich	107360	Store at 4 &deg;C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Succinic Acid	Sigma Aldrich	S9512	Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L(-) Malic Acid, BioXtra, &ge;95%	Sigma Aldrich	M6413	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251	Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Palmitoyl L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	Store at -20 &deg;C
Oligomycin A, &ge; 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Store at -20 &deg;C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)	Sigma Aldrich	C2920	Store at 2-8 &deg;C
phenylhydrazone
&ge;98% (TLC), powder [FCCP]
Antimycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Store at -20 &deg;C
Adenosine 5&prime;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Store at -20 &deg;C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Store at room temperature