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Methodenartikel

Messraten von Herbizid Metabolism in DICOT Weeds mit einem herausgeschnittenen Blatt Assay

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DOI:

10.3791/53236

⸱

7. September 2015

 ,  , 
1Department of Crop Sciences, University of Illinois

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt, wie die Herbizidstoffwechselraten effektiv mit herausgeschnittenen Blättern eines Dikotyledonenkrauts quantifiziert werden können, wodurch die Variabilität reduziert und mögliche verwirrende Effekte der Herbizidaufnahme oder -translokation beseitigt werden, die typischerweise in Ganzpflanzentests beobachtet werden.

Zusammenfassung

Um die Raten des Herbizidstoffwechsels in einem obligat-auskreuzenden Dikotyledonenkraut, Wasserhanf (Amaranthus tuberculatus), zu isolieren und genau zu bestimmen, haben wir einen Cuted-Leaf-Assay in Kombination mit einer vegetativen Klonierungsstrategie entwickelt, um die Herbizidaufnahme zu normalisieren und Translokation als beitragende Faktoren in herbizidresistenten (R) und -sensitiven (S) Wasserhanfpopulationen zu entfernen. Biokinetische Analysen von organischen Pestiziden in Pflanzen umfassen in der Regel die Bestimmung der Aufnahme, der Translokation (Abgabe an den Zielort), des metabolischen Schicksals und der Wechselwirkungen mit dem Zielort. Der Herbizidstoffwechsel ist ein wichtiger Parameter für die Messung bei herbizidresistenten Unkräutern und herbizidtoleranten Pflanzen und wird in der Regel mit Ganzpflanzentests mit radioaktiv markierten Herbiziden durchgeführt. Eine Schwierigkeit bei der Interpretation biokinetischer Parameter, die aus Ganzpflanzenmethoden abgeleitet wurden, besteht jedoch darin, dass die Translokation oft von der Geschwindigkeit des Herbizidstoffwechsels beeinflusst wird, da polare Metaboliten nach Herbizidentgiftungsreaktionen in der Regel nicht in der Pflanze mobil sind. Zu den Vorteilen des Protokolls, die in diesem Manuskript beschrieben werden, gehören eine reproduzierbare, genaue und schnelle Bestimmung der Herbizidabbauraten in R- und S-Populationen, eine erhebliche Verringerung der Menge an radioaktiv markiertem Herbizid, eine große Reduzierung von radioaktiv markiertem Pflanzenmaterial, das eine weitere Handhabung und Entsorgung erfordert, und die Möglichkeit, radioaktiv markierte Herbizidexperimente im Labor oder in der Wachstumskammer anstelle eines Gewächshauses durchzuführen. Da sich die Herbizidresistenz in Dikotyledonen-Unkrautpopulationen weltweit weiter entwickelt und ausbreitet, wird die hierin entwickelte und beschriebene Methode zur Analyse exzidierter Blätter eine unschätzbare Technik zur Untersuchung von nicht zielortbasierten Resistenzen aufgrund erhöhter Raten des Herbizidstoffwechsels und der Entgiftung bieten.

Einleitung

Herbizidresistenz in Unkraut stellt eine ernsthafte Bedrohung für die globale Produktion von Nahrungsmitteln und Faser 1,2. Derzeit Tausende von resistenten Populationen und Biotypen von über hundert Unkrautarten weltweit sind dokumentiert und untersucht 3. Ein Hauptmechanismus, Herbizid-Resistenz verleiht, in Pflanzen ist die Veränderung der Ziel Herbizid-site-Gene und Proteine, einschließlich genetischer Mutationen, herbizid Proteinbindungskinetiken oder Amplifikation der Ziel-Ort-Gen 2 beeinflussen. Metabolische Entgiftung über erhöhte Aktivitäten der Cytochrom P450 Monooxygenase (P450) oder Glutathion-S-Transferase (GST) Enzyme ist ein weiterer Mechanismus, der Herbizid-Resistenz in Unkräutern, die verschiedene in mehrfacher Hinsicht vom Ziel-Ort basierten Mechanismen 2 verleiht. Metabolic-basierten Widerstand hat erhebliche Auswirkungen auf, ob Pflanzen Fitness-Kosten (auch bekannt als Fitness-Strafen) können aus den Herbizidresistenz mechanis führenm, sowie in Bezug auf das Potential für einen einzigen Entgiftungsmechanismus zum Verleihen kreuz- oder mehreren Herbizid-Resistenz in Unkrautpopulationen 1,2,4. Allgemeiner kann Herbizid-Metabolismus in Pflanzen in drei Phasen 5 geteilt werden. Phase I beinhaltet Herbizidumwandlung oder Aktivierung wie P450 Hydroxylierung von aromatischen Ringen oder Alkylgruppen, oder N - oder O- Dealkylierungsreaktionen, was zu erhöhter Polarität und partiellen Entgiftung Herbizid 5,6. Neu eingeführten funktionellen Gruppen in Phase I können Verknüpfungsstellen für die Konjugation an reduziertem Glutathion von GSTs bereitzustellen oder durch UDP-abhängige Glycosyltransferasen in Phase II 5,7 Glucose. Beispielsweise ist die große Anfangs Metabolit Primisulfuron-methyl in Mais hydroxy-Primisulfuron-Methyl 8, die weiter metabolisiert werden können, zu Hydroxy-Primisulfuron-glucosid (Phase II) und dann in der Vakuole zur langfristigen Lagerung oder weitere metabolische transportiert Profibeitung 5,6 (Phase III).

Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) ist ein schwer zu Kontrolle, dicot Jahresunkrautarten, die die Produktion von Mais (Zea mays), Sojabohne (Glycine max) und Baumwolle (Gossypium hirsutum) in den Vereinigten Staaten behindert. Der hohe Grad der genetischen Vielfalt der waterhemp sich durch seine zweihäusig Biologie und Fernwindbestäubung ermöglicht, und eine einzelne weibliche waterhemp Pflanze kann bis zu eine Million Samen 9 zu erzeugen. Diese Samen sind klein und leicht verbreiten, was natürlich zu verleihen waterhemp mit einer effektiven Streuvorrichtung. Waterhemp zeigt kontinuierliche Keimung in der gesamten Vegetationsperiode 9, und ihre Samen sind in der Lage, nach mehreren Jahren der Ruhe keimen. Waterhemp ein C 4 Pflanze, die eine höhere Wachstumsrate als die meisten breitblättrigen Unkräutern in Ackeranbausystemen 10 besitzt. Darüber hinaus sind zahlreiche waterhemp Populationen gegen mehrere families von Herbiziden 3.

Eine Population von waterhemp (bezeichnet MCR) aus Illinois ist beständig gegen 4-Hydroxy-Dioxygenase (HPPD) inhibierende Herbizide 11, wie Mesotrion, sowie Atrazin und Acetolactatsynthase (ALS) inhibierende Herbizide, einschließlich Primisulfuron-methyl wegen Nichtziel-Website basierten Mechanismen 12,13. Eine andere Population von waterhemp bezeichnet ACR 14, die Primisulfuron-methyl-resistente (aufgrund einer Mutation in dem ALS-Gen) und Atrazin-resistente aber empfindlich gegen Mesotrion und einem waterhemp Population bezeichnet WCS 14, die Primisulfuron-methyl empfindlich ist, Mesotrion und Atrazin wurden im Vergleich zu MCR in unserer früheren Forschung 12 und aktuelle Experimente verwendet (in Tabelle 1 zusammengefasst). Erste Studien keine Veränderungen in den HPPD-Gen-Sequenz oder Expressionsniveaus oder verringert Mesotrion Aufnahme zu erfassen, in der MCR-Bevölkerung im Vergleich mit Mesotrion-empfindliche Bevölkerungsgruppen 12. Allerdings Metabolismus-Untersuchungen mit ganzen Pflanzen zeigten eine signifikant niedrigere Mutter Mesotrion Herbizid in MCR Vergleich ACR und WCS, die mit früheren phänotypische Reaktionen korreliert, um Mesotrion 11,12.

Waterhemp Bevölkerung Abkürzung Phänotyp zu Mesotrion Mesotrion Resistenzmechanismus Phänotyp Primisulfuron Primisulfuron Resistenzmechanismus
McLean Grafschaft-Resistant MCR Widerstandsfähig Metabolism * Widerstandsfähig Stoffwechsel
Adams County-Resistant ACR Sensitive - Widerstandsfähig Ziel-Ort Mutation in ALS 14
Wayne County-Sensitive WCS Sensitive - Sensitive -

* Non-Target-Ort-Resistenzmechanismen, andere als verbessert den Stoffwechsel, können ebenfalls zu verleihen Mesotrion Widerstand in der Bevölkerung MCR 12.

Tabelle 1: Beschreibung der waterhemp Populationen aus Illinois in dieser Studie verwendet.

Neben der Bestimmung Raten von Herbizidmetabolismus in intakten waterhemp Sämlinge, wurde ein anderer experimenteller Ansatz entwickelt und in unserer früheren Forschung eingesetzt, um den Stoffwechsel, indem ein herausgeschnitten waterhemp Blatt Assay 12 sowie verschiedene P450-Inhibitoren (zB tetcyclacis und Malathion) zu untersuchen. Dieses Verfahren wurde speziell für waterhemp aus einem Previ angepaßtous Untersuchung Primisulfuron-methyl-Stoffwechsel in geschnitten Maisblätter 15, da die herausgeschnittenen Blatt Test noch nicht für die Durchführung von Herbizidstoffwechselforschung in einer dikotylen Pflanze berichtet. Die organophophosate Insektizid Malathion wurde häufig für in vivo und in vitro herbizidStoffWechselForschung, um P450 Beteiligung 16 anzugeben. Zum Beispiel, Toleranz und schnellen Metabolismus von Mesotrion bei Mais sind auf P450-katalysierte Ring Hydroxylierung, die überprüft wurde, als Malathion erhöhten Mais Empfindlichkeit auf Mesotrion 17. In ähnlicher Weise gehemmt Malathion Stoffwechsel der ALS-Hemmer Primisulfuron-methyl in geschnitten Maisblätter 15. Ein Hauptvorteil der entnommenen Blatt Technik ist, dass Daten erzeugt werden, unabhängig von Ganzpflanzen Translokation Muster, ein wichtiger Faktor in die Abwägung Metabolismus von systemischen Nachauflaufherbizide in Pflanzen. Folglich ermöglicht dieses Verfahren die quantitative undqualitative metabolischen Analysen auf einer einzigen behandelte Blatt 12 zu fokussieren.

Eine vegetative Klonierungsstrategie, in Verbindung mit dem ausgeschnittenen Blatt Protokoll wurde vorher in waterhemp verwendet, um Stoffwechselstudien 12 durchzuführen. Aufgrund der Natur der Auskreuzung waterhemp (getrennte männliche und weibliche Pflanzen) und hohes Maß an genetischer Vielfalt innerhalb zweihäusig Amaranthus Arten 9, dieses Protokoll gewährleistet, dass genetisch identische waterhemp Sämlinge wurden in den Zeitverlaufsexperimenten untersucht. Dieser Artikel beschreibt den Nutzen der herausgeschnittenen Blatt Verfahren zur Messung der Raten der Herbizidmetabolismus in einer dikotylen Unkraut (waterhemp). Die Menge der Mutter Herbizid verblieben war, zu jedem Zeitpunkt (1) durch nichtlineare Kleinste-Quadrate-Regressionsanalyse Sitz mit einer einfachen ersten Ordnung Kurve, um die Zeit für die 50% der absorbierten Herbizids zu erniedrigen Schätzung (bestimmt und wurde DT 50). RepräsentativChromatogramme von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) für ALS-resistente und -sensitive waterhemp Populationen, die das Verschwinden der Mutter Herbizid und gleichzeitiger Bildung von polaren Metaboliten (s) während einer Zeitverlaufsstudie anzuzeigen (Abbildung angezeigten 2). Der Schwerpunkt unseres Artikels ist zu beschreiben und zeigen die Nützlichkeit des herausgeschnittenen Blatt Assay in Kombination mit einem vegetativen Klonen Methode zur Bestimmung präzise und reproduzierbare Raten von Herbizidmetabolismus in dicot Pflanzen, mit gleichmäßig Ring-markierten (URL- 14 C) Herbizide in drei waterhemp Populationen, die in ihrer Ganzpflanzenantworten zu unterscheiden HPPD- und ALS-inhibierenden Herbiziden (Tabelle 1).

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Protokoll

1. Pflanzenmaterial, Wachstumsbedingungen und Vegetative Cloning

Hinweis: Drei waterhemp Populationen wurden in dieser Forschung untersucht: MCR (von McLean County, IL), ACR (von Adams County, IL) und WCS (von Wayne County, IL) (Tabelle 1).

  1. Sammeln und waterhemp Samen in 0,1 g L -1 Agar auszusetzen: Wasser-Lösung bei 4 ° C für mindestens 30 Tage, um die Keimung zu verbessern. Hinweis: Einige waterhemp Populationen sind ruhend, aber dieser Schritt hilft, Keimruhe zu überwinden und Samen keimen gleichmäßiger.
  2. Samen keimen jedes waterhemp Population (wie in Tabelle 1) in 12 x 12 cm Schalen, enthaltend ein Einbettungsmedium im Gewächshaus.
    1. Pflegen Gewächshausbedingungen bei 28/22 ° C Tag / Nacht-Temperaturen in einem 16/8 h Photoperiode 12.
    2. Ergänzung natürliches Licht im Gewächshaus mit Licht von Quecksilberdampflampen, ein Minimum von 500 & mgr; mol m -2 liefern sec -1 Photonenfluss im Pflanzenbestand Ebene.
  3. Transplantation hervor Sämlinge, wenn sie 2 cm hoch in 80 cm 3 Töpfe im Gewächshaus.
  4. Sämlinge in 950 cm 3 Töpfe mit einem 3: 1: 1: 1-Mischung aus Blumenerde mischen: Boden: Torf: Sand, wenn Sämlinge sind 4 cm hoch. In 5 g Langzeitdünger Granulat zu jedem Topf und mit diesem Bodenmischung mischen.
  5. Schneiden Sie und entfernen Sie die Sprossapikalmeristem mit den drei jüngsten Blätter von 7 cm hohen Pflanzen zu Apikaldominanz beseitigen.
    Hinweis: Dieser Schritt stellt sicher, dass jede Anlage wird genug 3 cm Achselsprossen zu klonen wachsen.
  6. Verbrauch fünf Achseltriebe (3 cm Länge), wenn Sämlinge sind ca. 14 cm groß aus jeder waterhemp Bevölkerung (wie in Tabelle 1). Entfernen der Mehrzahl der Blätter auf diesen axilläre Knospen um den Wasserverlust bei der weiteren Handhabung zu verringern, behalten aber die zwei jüngsten Blätter zu weiterem Wachstum bei Transplantation ermöglichen.
    Hinweis: Behandeln Sie sorgfältig und versuchen Sie nicht, um die Triebe beschädigen, wenn das Entfernen der Blätter. Beschriften Sie jedes Werk mit einer Beteiligung.
  7. Transplant Achsel schießt in 80 cm 3 Töpfen (eine Keimling pro Topf) in Blumenerde Medium, das das gleiche Medium zum Keimen verwendet wird. Potting-Medium sollte zunächst gesättigt, bis Wurzeln Form in der Wachstumskammer, dann konstant zu halten Feuchtigkeit und Ort Töpfen in der Wachstumskammer für 7 Tage, um Wurzeln zu etablieren.
    Hinweis: Pflanzen sind an diesem Punkt sehr empfindlich und sollte nicht betont werden.
    1. Pflegen Wachstumskammer Bedingungen bei 28/22 ° C Tag / Nacht-Temperaturen in einem 16/8 h Photoperiode 12.
    2. Eine Kombination von Glühlampen und Leuchtstoffröhren können verwendet werden, um Licht in die Wachstumskammer zur Verfügung zu stellen und sollte mindestens 550 & mgr; mol m -2 s -1 Photonenfluss bei Pflanzendach Level 12 zu liefern.
  8. Transplantation wieder in 950 cm 3 Töpfen (eine Keimling pro Topf) containing einen 3: 1: 1: 1-Mischung aus Blumenerde mischen: Boden: Torf: Sand (auch 5 g Langzeitdünger Granulat) bei geklonten Pflanzen sind 4 cm groß, dann zurück in das Gewächshaus übergeben.
  9. Klonen Sie die Pflanzen ein zweites Mal mit dem gleichen oben beschriebenen Verfahren (dh wiederholen Sie die Schritte 1,5 bis 1,8, und dann gehen Sie zu Schritt 2.1). Für einen typischen zeitlichen Verlauf Studie zu generieren Klone aus mindestens sechs unabhängige Pflanzen aus jeder waterhemp Bevölkerung und speichert sie als Linien MCR 1-6, 1-6 und ACR WCS 1-6.
    1. Stellen Sie mindestens sechs verschiedene "Eltern" klonalen Linien, um das Experiment zu wiederholen und angemessen vertreten genetische Variabilität innerhalb der einzelnen waterhemp Bevölkerung.
    2. Je nachdem, wie viele Zeitpunkten analysiert werden, erzeugen genügend Unter Klone aus jeder "Eltern" klonalen Linie, um eine Zeitverlaufsstudie durchzuführen.

2. Die Durchführung einer Stoffwechselstudie mit herausgeschnitten Waterhemp Leaves

  1. Verbrauchsteuern Das Dritt jüngsten Blätter (2 bis 3 cm in der Länge, sind 0,5 cm befestigt Blattstiel), wenn geklont waterhemp Pflanzen sind 10 bis 12 cm hoch Herbizid-Stoffwechsel und DT 50 Analyse.
  2. Cut Blattstielen von jedem waterhemp Werk ein zweites Mal (um sicherzustellen, dass 0,3 cm des Blattstiels bleibt) unter Wasser, und legen Sie diese Schnittenden in 1,5 ml-Kunststoffröhrchen (ein Blatt pro Fläschchen) 15.
    Hinweis: Schneiden ein zweites Mal unter Wasser verhindert Bildung von Luftblasen und Verstopfen Xylemgefäße.
    1. Zum einen teilweise ausgeschnittenen Blättern mit geschnittenen Blattstiel in Vorinkubation Puffer (200 ul) von 0,1 M Tris-HCl (pH 6) eintauchen für 1 Stunde.
    2. Zweitens bewegt jedes Blatt in ein neues 1,5-ml-Ampulle, enthaltend eine Inkubations-Puffer (200 ul) von 0,1 M Tris-HCl (pH 6) plus 150 & mgr; M [URL- 14 C] Herbizid, und Inkubieren bei 28 ° C für 1 Stunde, um ermöglichen eine Herbizidabsorption in die Blätter.
      Hinweis: Die beiden 14 C-Mesotrion und 14 C-Primisulfuron-methyl wurden in unseren Untersuchungen bei spezifischen Aktivitäten von etwa 20 mCi mmol -1. Sowohl Diffusion und durch das Xylem Transpirationsstrom Auffassung tragen zur Herbizidmenge, die pro Blatt gemacht.
      Anmerkung: Die Wirkung von metabolischen Inhibitoren auf Herbizid-Metabolismus durch Modifizieren Schritten 2.2.1 und 2.2.2 ermittelt werden. Je 100 & mgr; M des Inhibitors in die Pre-Inkubationspuffer und lassen Inkubation für 2 Stunden, dann auf Inkubationspuffer Transfer mit Herbizid und erneut hinzufügen 100 & mgr; M Inhibitor. Zum Beispiel, Malathion und tetcyclacis hemmen bestimmten Cytochrom-P450-Aktivitäten in Pflanzen 15-17.
    3. Waschen Sie den eingetauchten Teil des ausgeschnittenen Blättern mit VE-Wasser und übertragen geschnitten Blätter zu einem Viertel festen Murashige und Skoog (MS) Salzlösung (500 ul) für 0 h, 5 h, 11 h, 23 h oder 35 h zugeführt, in der Wachstumskammer für den Zeitverlauf Stoffwechsel Studie.
  3. Ernte durch Entfernen Urlaubs aus Inkubationslösung bei der geeigneten Zeitpunkt manuell schleifen jedes Blattgewebe in flüssigem Stickstoff mit einem Polypropylen-Röhrchen (15 ml) und Glaspistill.
  4. Extrahieren radiomarkierten Herbizid und seiner Metaboliten, die jedes Blatt mit 7 ml 90% Aceton mit einem Labor Gewebehomogenisator in der gleichen Polypropylen-Röhrchen wie oben. Spülen Gewebehomogenisator mit zusätzlichen 7 ml 90% igem Aceton und weiter zu homogenisieren, bis die Gewebe wird gründlich pulverisiert (üblicherweise etwa 2 min). Anmerkung: 90% Aceton zur Extraktion der meisten Herbizide aus Pflanzengeweben verwendet werden. Wenn jedoch diese Methode nicht mehr als 90% der aufgenommenen radiomarkierten Verbindungen zu extrahieren, dann 90% Methanol oder 90% Acetonitril als Extraktionslösungsmittel ersetzt werden.
  5. Label 90% Acetonextrakte (14 ml insgesamt) und lagern bei 4 ° C für 16 Stunden, damit für zusätzliche Extraktion auftreten.
    Anmerkung: Nach dieser Extraktion der behandelten Blätter, die Menge an extrahierbarem radioactivity beträgt typischerweise mindestens 98% des durch das behandelte Blatt aufgenommen radiomarkierten Verbindungen. Nichtextrahierbare Radioaktivität (gebundene Reste) in Blätter ausgeschnitten gemittelt 0,3% über alle Zeitpunkte in unserer früheren Studie 12, aber diese Menge kann entsprechend dem verwendeten Herbizids Zeitpunkt geprüft variieren.
  6. Zentrifuge Proben bei 5000 g für 10 min und Konzentratüberstände auf 40 ° C mit einem Rotationsverdampfer bis zu einem Endvolumen von 0,5 ml erhalten wird. Übertragen Sie diese Lautstärke auf ein 2,0 ml Kunststoffröhrchen.
  7. Hinzufügen Acetonitril: Wasser (1: 1, auf das Volumen) verstellen das Endvolumen der Pflanzenextrakte und 1,25 ml und Wiederzentrifuge bei 10.000 × g für 10 Minuten, um alle Partikel zu entfernen.
  8. Messen Gesamtradioaktivität in einem Aliquot von jeder Probe (dpm ul -1) durch Flüssigszintillationsspektroskopie (LSS) 12 aufgenommen und zu normalisieren Mengen an [14 C-markiertem] Verbindungen, HPLC injiziert (zum Beispiel 10,000 Gesamt dpm / sample / run) so y-Achse wird zwischen den Proben einheitlich sein, wenn die grafische Ergebnisse.

3. HPLC-Analyse der Herbizid Metabolism in Abgeschnittene Blätter

Hinweis: Resolve insgesamt extrahierbare Radioaktivität in die Mutter Herbizid und Herbizid-Metaboliten unter Verwendung der folgenden RP-HPLC-Bedingungen 12.

  1. Zuführen RP-HPLC mit einer C18-Säule (4,6 x 250 mm, 5 um Teilchengrße für analytische HPLC) mit einer Flussrate von 1 ml min -1 für die meisten nicht-polaren Herbizide.
    Anmerkung: C 4 oder C 12 RP-HPLC-Säulen kann auch verwendet werden, um die Trennung der Mutter Herbizid aus seiner Metaboliten zu optimieren. Eine Vorsäule Filter und / oder Schutzsäule können ebenfalls zum Schutz und zur Verlängerung der Lebensdauer der RP-Säule werden.
    1. Verwenden Sie den folgenden mobilen Phase für die RP-HPLC: Eluent A, 0,1% Ameisensäure (v / v) in Wasser und Eluent B 100% HPLC-Qualität Acetonitril.
      Hinweis: HPLC-grade Methanol kann auch als El verwendet werdenießend B für die Lösung mehrere polare Verbindungen und Metaboliten, aber beachten Sie, dass die Retentionszeiten können auch geändert werden.
      Hinweis: Das Elutionsprofil verwendet, um Mesotrion oder Primisulfuron-methyl ihrer polaren Metaboliten in unserer Forschung 12 zu lösen ist: Schritt 1, A: B (4: 1, v / v) bis A: B (3: 2, v / v ) in einem linearen Gradienten (12 min); Schritt 2, A: B (3: 2, v / v) bis A: B (3: 7, v / v) in einem linearen Gradienten (5 min); Schritt 3 A: B (3: 7, v / v) bis A: B (1: 9, v / v) in einem linearen Gradienten für 2 Minuten (insgesamt 19 Minuten).
      Hinweis: Farbverläufe und isokratische Schritte müssen möglicherweise auf der Grundlage der physikalischen Eigenschaften des Grundmaterials, um die Auflösung zu optimieren eingestellt werden.
    2. Den oben genannten linearen Gradienten Stufen A: B (1: 9, v / v) bis A: B (4: 1, v / v) in einem linearen Gradienten (3 min) und A: B (4: 1, v / v) isokratisch Schritt (mindestens 2 Minuten) neu äquilibrieren die RP-Säule vor dem Einspritzen des nächsten 12-Extrakt.
  2. Erkennen und visualisieren radiomarkierten Verbindungen mit einer Durchfluss Scintillation Analyzer. Aufzeichnung der Menge an in jeder Probe als Prozentsatz der Gesamtradioaktivität in jeder Probe verbleibenden Mutter Herbizid (ermittelt und vom Durchfluss-Szintillations-Analysator gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert), Rate des Herbizids Stoffwechsel in jedem waterhemp Population während des Zeitverlaufs zu bestimmen.

4. Statistische Verfahren

  1. Vereinbaren Behandlungen in einer vollständig randomisierten Design (oder andere geeignete Anordnung für die statistische Analyse).
  2. Führen zwei unabhängigen Experimenten mit jeder Behandlung drei biologischen Wiederholungen für jedes Experiment enthalten. Die zwei unabhängigen Experimenten sind sechs biologischen Replikaten in insgesamt. Wenn das Experiment Effekt ist nicht signifikant (α = 0,05), zu kombinieren und zu analysieren, Daten von jedem unabhängigen Experiment. Wenn das Experiment Effekt wesentlich ist, dann analysieren jedes Experiment gesondert.
    Hinweis: Fügen Sie die ersten drei biologischen Replikaten in Experiment 1 und die nächsten drei biologischen Replikaten in Experiment 2. Die biologische Replikation stellt eine andere "Eltern" klonalen Linie von jeder Population abgeleitet (MCR 1-6, 1-6 ACR und WCS 1-6), so daß jeder Zeit Natürlich Analyse nutzt genetisch identische Pflanzen. Die zwei unabhängigen Experimenten sind sechs biologischen Replikaten in insgesamt, die für eine angemessene Darstellung der genetischen Variabilität und Ermittlung eines Median DT 50 für jeden waterhemp Bevölkerung ermöglicht.
  3. Analysieren Sie die Daten mit nicht-linearen Regressionsanalyse der kleinsten Quadrate und passen sie mit einer einfachen erster Ordnung Kurve, um abzuschätzen, DT 50 s. Die folgende Gleichung beschreibt das Modell:
    figure-protocol-1
  4. wobei in diesem Modell y den Prozentsatz des zum Zeitpunkt t verbleibenden Mutter Herbizid, μ i der DT 50 für jedenwaterhemp Bevölkerung i, und der Parameter C 0 ist der geschätzte Betrag der Mutter Herbizid vorhanden bei t = 0 12.

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Ergebnisse

Entweder zwischen WCS oder ACR und MCR (Abbildung 1) wurden große Unterschiede in Raten von Mesotrion Stoffwechsel erkannt. Zu jedem Zeitpunkt, hatte MCR Mesotrion schneller als die beiden Mesotrion-empfindliche Bevölkerungsgruppen, WCS und ACR, die mit früheren Ganzpflanzen phänotypische Reaktionen 11 korreliert metabolisiert. Durch Klonen genug Pflanzen aus einer Elternpflanze aus jeder Population, sind herbizid Stoffwechsel Zeitverlauf Analysen gleichmäßige und reproduzierbare aufgrund des...

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Diskussion

Die hier beschriebene geschnitten Blatt-Verfahren wurde bereits in der Erforschung Primisulfuron Stoffwechsel in Maisblätter 15 verwendet worden, aber unsere Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll ist auch wirkungsvoll, präzise und reproduzierbar zu messen Herbizidmetabolismus in einer dikotylen Unkrautarten 12. Ein Hauptvorteil der entnommenen Blatt Technik gegenüber Ganzpflanzen Studien ist, dass ein ausgeschnittener Blatt ist unabhängig von Ganzpflanzen Translokation Muster Nachauflauf, system...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley und Brittany Janney für ihre Unterstützung beim Pflanzenwachstum und bei der Extraktion, Dr. Anatoli Lygin für die Unterstützung bei chromatographischen Analysen und Syngenta Crop Protection für die Finanzierung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgarSigma-AldrichA1296zum Vorkeimen von Samen
BlumenerdeSun Gro Horticulture49040233für das Pflanzenwachstum
NutricoteAgrivertTOTAL BLEND 13-13-13 T100Langzeitdünger
Wachstumskammer E15Controlled Environments Limited20207Pflanzenzucht
Tris-BasisFisher ScientificBP152-500Puffer für herausgeschnittene Blätter
HCl (konzentriert)Fisher ScientificA144500pH-Wert des Puffers
einstellen Murashige und Skoog (MS) Salze Sigma-AldrichM0404Inkubation von exzidierten Blättern
MethanolFisher ScientificA452-4Blattwaschungen nach der Inkubation
AcetonSigma-Aldrich179124Pflanzenextraktionen
Acetonitril (HPLC-Qualität)Macron Fine ChemicalsMKH07610HPLC mobile Phase
Ameisensäure  Mallinckrodt AnalyticalMK259205Ansäuerung Mobilphase
pH MikrozentrifugeEppendorf5417R1,5 oder 2,0 ml Röhrchen
Zentrifuge (temperiert)Eppendorf5810R15 oder 50 ml Röhrchen
Polypropylen ZentrifugenröhrchenCorning Inc.43079015 ml, steril
RotationsverdampferBÜ CHIR200konzentriert Pflanzenproben
Flüssigszintillationsspektrometrie (LSS)Packard Instruments104470quantifiziert 14C
HochleistungsflüssigkeitschromatographiePerkin ElmerN2910401Auflösung von Herbizidmetaboliten
Durchfluss-Szintillationsanalysator LabLogic System1103303für die HPLC-Analyse von 14C
Hypersil Gold C18 Säule Thermo-Scientific03-050-522 Umgekehrte Phase
Ultima-Flo M CocktailPerkin Elmer6013579für Flow-Szintillationsanalysator
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)Fisher ScientificSX18für LSS; biologisch abbaubarer
Labor-HomogenisatorKinematicaCH-6010 Homogenisieren von Blattproben

Referenzen

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