Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

β-barrel OMPs kann nur in den äußeren Membranen von Mitochondrien, Chloroplasten und Gram-negative Bakterien ^1-3 gefunden werden. Während sie ähnliche Rollen wie α-helicalen Proteinen dienen, sie haben eine sehr unterschiedliche Falte, bestehend aus einem zentralen Membran eingebetteten Domäne β-Fass im Bereich 8-26 antiparallelen β-Strängen mit jeder Strang eng mit den beiden benachbarten Stränge verbunden sind, (Figuren 1 und 2). Die ersten und letzten Stränge der β-Faß Domäne dann miteinander, fast ausschließlich in einer antiparallelen Art und Weise (mit Ausnahme der mitochondrialen VDAC) interagieren die β-Fass-Domäne von der umgebenden Membran zu schließen und abzudichten. Alle β-barrel OMPs haben extrazellulären Schleifen unterschiedlicher Sequenz und Länge, die eine wichtige Rolle bei der Liganden-Wechselwirkungen und / oder Protein-Protein-Kontakte spielen, wobei diese Schleifen manchmal so groß wie 75-Reste sind, wie in Neisseria-Transferrin-Bindungs ​​pro gefundentein A (TbpA) ^4. β-Fass OMP kann auch N-terminalen oder C-terminalen periplasmatischen Erweiterungen haben , die als zusätzliche Domänen für das Protein die funktionalen Zweck dienen (zB BamA ^5-7, FimD ^8,9, FadL ^10). Während viele Arten von β-Barrel OMP ¹¹ existieren, sind zwei der häufigsten Arten werden im Folgenden als Beispiele für diejenigen , die weniger vertraut mit dem Gebiet beschrieben, (1) TonB-abhängige Transporter und (2) Autotransporter.

TonB-abhängige Transporter (zB FepA, TbpA, BTub, Cir, etc.) sind von wesentlicher Bedeutung für die Nährstoff Import und enthalten eine N-terminale Domäne Stecker bestehend aus ~ 150 Reste , die in einem C-terminalen versteckt gefunden wird 22 Strang - β- Fass - Domäne in die äußere Membran ¹² (Figur 3) eingebettet ist . Während dieses Plug-Domäne Substrat verhindert, frei durch die Fass-Domäne vorbei, induziert Substratbindung innerhalb der Plug-Domäne eine Konformationsänderung thbei Zuleitungen Bildung (entweder durch Steck Umlagerung oder durch teilweise / vollständige Ausstoßen des Stopfens) zu Pore, die dann Substrattransport durch die äußere Membran in das Periplasma erleichtern kann. TonB-abhängige Transporter sind besonders wichtig für das Überleben einiger pathogener Stämme von Gram-negativen Bakterien, wie Neisseria meningitidis , die spezialisierte Transport entwickelt haben , die Nährstoffe wie Eisen fallen direkt von menschlichen Wirtsproteine ^{​​4,13,14.}

Autotransporter gehören der Typ V-Sekretionssystem von Gram-negativen Bakterien und sind ß-barrel OMPs, die aus einem β-Fass-Domäne bestehen (in der Regel 12-Stränge wie bei ESTA und ESPP) und einem Passagierdomäne, die entweder sezerniert oder an die vorgestellte Oberfläche der Zelle ^15,16 (Abbildung 3). Diese β-barrel OMPs dienen oft eine wichtige Rolle in der Zellüberlebens und der Virulenz der Passagierdomäne dient entweder als eine Protease, Adhäsin, und / oder andere effector dass vermittelt Pathogenese.

Konstruktionsverfahren, wie Röntgenkristallographie, NMR-Spektroskopie und Elektronenmikroskopie (EM) ermöglichen es uns, Modelle für die OMPs mit atomarer Auflösung zu bestimmen, welche wiederum verwendet werden können, genau zu entschlüsseln, wie sie innerhalb der äußeren Membran funktionieren. Diese wertvollen Informationen kann dann gegebenenfalls für Arzneimittel und die Entwicklung von Impfstoffen verwendet werden. Beispielsweise Transferrin - Bindungsprotein A (TbpA) wird auf der Oberfläche von Neisseria gefunden und ist für die Pathogenese erforderlich , da er direkt menschliches Transferrin bindet und extrahiert dann und importiert die Eisen für ihre eigene Überleben. Ohne TbpA kann Neisseria nicht Eisen aus dem menschlichen Wirt binden und sind nicht pathogen gemacht. Nachdem die Kristallstruktur von Transferrin humanen an TbpA gebunden ⁴ gelöst wurde, wurde es viel deutlicher , wie die beiden Proteine ​​verbunden sind , welche Regionen von TbpA die Wechselwirkung vermittelt, welche Reste für die Eisenextraktion durch TbpA wichtig waren, undwie könnte man Therapeutika gegen Neisseria Targeting TbpA entwickeln. Daher ist die Bedeutung der β-Barrel OMPs in Gram-negativen Bakterien, die für das Überleben und die Pathogenese gegeben, sowie in Mitochondrien und Chloroplasten-Funktion, und die Notwendigkeit für zusätzliche strukturelle Informationen über diese einzigartige Klasse von Membranproteinen und den Systemen, in denen sie funktionieren , allgemeine Protokolle werden mit dem Gesamtziel der Expression und Reinigung Ziel OMP auf hohem Niveau für die Charakterisierung von strukturellen Methoden vorgestellt.

1. Klonierung und Expression

Hinweis: Um strukturelle Untersuchungen zu ermöglichen, ausreichende Mengen an hochgereinigtem Protein muss hergestellt werden, und das im Allgemeinen mit der Klonierung und Überexpression des Ziel β-Fass - Außenmembranprotein (OMP) in E. coli (Abbildung 4). Bis heute sind alle OMP Strukturen β-Barrel, einschließlich jener Strukturen für mitochondriale VDAC wurden von bakteriell exprimiertem Protein ¹¹ abgeleitet. Hier allgemeine Protokolle sind für das Klonen präsentiert und mit dem Ausdruck β-Fass OMP für (1) nativen Ausdruck direkt in Bakterienmembranen und (2) die Expression in Einschlüssen Körper für in - vitro - ¹⁷ Neufaltung.

1. Entwerfen eines Expressionskonstrukts
   1. Erhalten oder das Codon optimierten Ziel OMP-Gen erwerben.
   2. Kauf oder erhalten einen T7-Expressionsvektor (i), die eine periplasmatische Lokalisierung Signalsequenz, einen N-terminalen 6x-Histidin-Tag,und eine TEV - Protease - Ort ^4,18,19 für in vivo - Expression auf die Membran oder (ii) ohne periplasmatischen Lokalisierungs - Signalsequenz zur Expression zu inclusion bodies in vitro Umfaltung.
      Hinweis: Eine N-terminal Protease spaltbar 6x oder 10x-Histidin-Tag eine einfache Methode zur Reinigung würde. Wie bei den löslichen Proteinen, variieren die Wahl der Affinitäts - Tag (Histidine, Strep, GST, etc.), die Position des Affinitäts - Tag, und die Aufnahme eines Proteasestelle (TEV, Enterokinase, Thrombin, etc.) für die nachfolgende Entfernung durch .
   3. PCR Amplifikation der Zielsequenz mit geeigneten Primern und Subklon in den Expressionsvektor. Verwenden Sie Ligatur unabhängiges Klonen (LIC) ^20,21 oder konventionellen Klonierungstechniken (Restriktionsenzyme / Ligatur) für Subklonierung. Jedoch kann LIC einen hohen Durchsatz ermöglichen, so dass für eine große Anzahl von verschiedenen Konstrukte (Verkürzungen, eine Vielzahl von Tags, Vielzahl von Promotoren), die parallel zu klone mehrleicht.
2. In - vivo - Membran-gezielte Expression
   1. Verwenden Sequenzierungsanalyse des Ziel β-Fass zu verifizieren OMP kloniert stromabwärts und im Rahmen mit einer Signalsequenz (dh pelB, OmpA) in dem Expressionskonstrukt.
      Hinweis: Die Signalsequenz leitet die entstehende Kette an den Sec Translocon für die Sekretion in das Periplasma und anschließende Montage in die äußere Membran.
   2. Verwandeln Sie das Konstrukt in einen Expressionsbakterienstamm für die Expression durch Pipettieren von 1,0 ul Plasmid in 50 ul BL21 (DE3) chemisch kompetente Zellen und vorsichtig mischen durch Pipettieren von oben und unten. Inkubieren auf Eis für 30 min.
   3. Heizimpuls bei 42 ºC für 30 sec ein Wasserbad und dann 1 min zurück auf Eis stellen.
   4. 1 ml vorgewärmtes SOC-Medium und schütteln bei 37 ºC für 1 Stunde bei 1.000 Umdrehungen pro Minute ein Tischschüttler Inkubator verwenden.
   5. Platte 100 ul Zellen auf LB-Agarplatten, enthaltend eine geeignete Antibiotic und Inkubation über Nacht bei 37 ºC invertiert.
   6. Führen kleinräumige Expressionstests durch eine 5 ml LB + Antibiotika-Kultur mit einer einzelnen Kolonie Inokulation. Wiederholen Sie dies für 5-10 Kolonien.
      Hinweis: Wegen der möglichen Toxizität eines β-Fass OMP und das Vertrauen auf die basale Expressionsniveaus, Kolonie zu Kolonie Variabilität wird manchmal beobachtet. Daher mehrere Kolonien Screening wird für jedes Konstrukt empfohlen getestet. Für kleine Ausdruck Tests eher als herkömmliche 5-ml-Kulturen, wachsen 25 ml Kulturen in 125 ml Erlenmeyerkolben verblüfft vorgeschlagen. Diese Bedingungen oft besser widerspiegeln, was in einer groß angelegten Wachstum passieren wird. Außerdem ist es eine gute Idee auch auf verschiedenen Arten von Kulturmedien (TB, LB, 2xYT, M9, usw.) auf dem Bildschirm, da unterschiedlichem Erfolg haben , abhängig von dem Zielprotein berichtet.
      1. Bei 37 ° C wachsen zu einer OD ₆₀₀ von ~ 0,6 unter Schütteln.
      2. Induce Expression des Ziel OMP durch Anzeigeding 5 ul 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) jedem Kulturröhrchen und ermöglichen eine weitere 1-2 Stunden zu wachsen.
      3. Vergleichen Expressionsniveaus für alle Kolonien , die durch Zentrifugieren von 1 ml jeder Kultur (OD ₆₀₀ ~ 0,6) für 1 min bei 15000 xg einer Mikro verwenden.
      4. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 200 ul 1x SDS-PAGE-Beladungspuffer. Hitze bei 100 ºC für 5 min und dann Zentrifuge wieder bei 15.000 xg für 5 min.
      5. Analyse der Proben unter Verwendung von SDS-PAGE durch Pipettieren von 20 ul in jede Vertiefung einer 10% Gel. Führen Sie das Gel für 35 min bei konstant 200 V.
         Anmerkung: Es wäre an dieser Stelle von Vorteil sein, um zu bestimmen, ob das Zielprotein korrekt gefaltet wird oder nicht. Dies kann oft indem kleine purifications erreicht werden oder durch Testen auf Wärme Modifizierbarkeit.
   7. Wählen Sie die Kolonie der beste Ausdruck zeigt, und führen große Expression unter Verwendung von 12-24 l Medium.
      Hinweis: Herkömmliche Verfahren typischerweise die Kulturen bei 37 ºC wachsen unter Schütteln bis zu einer OD ₆₀₀ von ~ 0,6 und dann induzieren mit einem geeigneten Induktor (dh 0,1-1 mM IPTG für oder ~ 0,2% für Arabinose) für eine weitere 2-4 Std . Falls gewünscht, können zur Induktion vor, verringern die Temperatur so niedrig wie 20 ° C und die Induktionszeit verlängern.
      1. Für undichte Expressionsverfahren, wachsen ein 25 ml impfen Kultur bei 37 ° C in LB - Medium mit den entsprechenden Antibiotika (s) , bis die OD ₆₀₀ erreicht ~ 0,6. Dann fügen Sie 1 ml impfen zu zwölf 1 l-Flaschen von TB-Medium plus Antibiotika (n) und bei 20 ° C wachsen bis zur Sättigung (~ 3 Tage).
   8. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 xg für 10 min.
   9. Fahren Sie mit Reinigungsschritt Abschnitt 2.1 oder einfrieren das Zellpellet in flüssigem Stickstoff für die Langzeitlagerung bei -80 ºC.
3. Expression zu Inclusion Bodies für In - vitro - Refolding
   1. Verwenden Sequenzierungsanalyse des Expressionskonstrukts zu verifizieren keine Signalsequenz enthalten. Das Fehlen einer Signalsequenz wird das Zielprotein direkt in das Cytosol als Einschlusskörper zu sammeln.
   2. Wandeln Sie den Expressionskonstrukt in einen Expressionsbakterienstamm für die Expression. Für die Aufnahme Körperausdruck, ist es am besten Ausdruck zu steuern durch Induktion (dh IPTG, Arabinose, etc.) möglich toxische Effekte zu minimieren.
   3. Platte 100 ul von transformierten Zellen auf LB-Agar-Platten ein geeignetes Antibiotikum enthält und Inkubation über Nacht bei 37 ºC invertiert.
   4. Führen kleinräumige Expressionstests durch eine 5 ml LB + Antibiotika-Kultur mit einer einzelnen Kolonie Inokulation.
   5. Wiederholen Sie Schritt 1.3.4 für 2-4 weitere Kolonien.
   6. Bei 37 ° C wachsen zu einer OD ₆₀₀ von ~ 0,6 unter Schütteln.
   7. Induce mit einem geeigneten Induktor für 1-2 Std.
   8. Vergleichen Expressionsniveaus für alle ter Kolonien durch Analyse unter Verwendung von SDS-PAGE (siehe Schritt 1.2.6). Wählen Sie die Kolonie der beste Ausdruck zeigt, und führen große Expression unter Verwendung von 12-24 l Medium.
      1. Wachsen die Zellen bei 37 ° C bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,6-0,8 und induzieren bei 37 ° C für 3-5 Std. Während Ausdruck inclusion bodies robuster als andere Arten von Ausdruck ist, wie bei allen Proteinexpressionsexperimente können Expression durch Veränderung Wachstumsmediums, die Zeit der Induktion, die Temperatur der Induktion und der Konzentration des Induktionsmittels verbessert werden.
   9. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 xg für 10 min.
   10. Fahren Sie mit Reinigungsschritt Abschnitt 2.2 oder einfrieren das Zellpellet in flüssigem Stickstoff für die Langzeitlagerung bei -80 ºC.

2. Reinigung

1. Die Isolierung von Membranfraktionen
   Anmerkung: Im Gegensatz zu den löslichen Proteine, integrale Membranproteine ​​in die Lipid-Doppelschicht eingebettet und somiterfordern Detergentien für die weitere Reinigung und Analyse (Abbildung 5) zu extrahieren. Nach der Expression ist der erste Schritt in der Reinigung eines β-barrel OMP-Extraktion aus der Membranfraktion.
   1. Die Zellen in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl _2, 50 & mgr; g / ml AEBSF, 5 ug / ml DNase I) in einem Verhältnis von 5 ml / g Zellpaste.
   2. Lyse der Zellen, die eine Französisch Presse oder Zellhomogenisators verwenden. Dreh die lysierten Zellen bei 15.000 xg für 30 min bei 4 ºC nicht lysierten Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.
   3. Den Überstand in ein sauberes Röhrchen und zentrifugiere wieder bei hoher Geschwindigkeit (200.000 xg) für 1 h bei 4 ºC. Das resultierende Pellet wird die Membranfraktion, die das Protein von Interesse enthält.
   4. Verwendung eines Dounce - Homogenisators, Resuspendieren der Membranfraktion zuerst die Membranen übertragen und dann Zugabe Solubilisierungspuffer (50 mM KH ₂ PO ₄ pH 7,5, 200 mM NaCl, 20 mM ImidazolpH-Wert 8,0) (50 ml pro 20 g Zellen) bei 2x Konzentration, ohne Waschmittel.
   5. Gießen die resuspendierten Membranen in ein kleines Becherglas gegeben und fügen Detergens (dh, n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM), Lauryldimethylamin-N-oxid (LDAO), n-Octyl-β-D-glucopyranosid (OG), Triton X-100, etc.) wird langsam zu einer Endkonzentration von ~ 10x kritischen Mizellenkonzentration (CMC).
   6. Füllen Sie mit Wasser bis zu einer endgültigen Konzentration von 1x Solubilisierungspuffer. Rühre 0,5 bis 16 Stunden lang bei 4 ºC, abhängig davon, wie leicht das Zielprotein aus den Membranen extrahiert.
      Note: Waschmittel verwendet wird, um langsam die Membranen zu solubilisieren das Zielprotein zu extrahieren. Es gibt 3 Arten von Waschmitteln, die hier verwendet werden können: ionische (SDS, Desoxycholsäure), nicht-ionische (Elugent, TWEEN, Triton X-100, OG, DDM), und zwitterionische (LDAO, CHAPS). Ein Protein-Detergens-Komplex, der stabil und monodisperse während des Reinigungsschrittes ist, wird in den Erfolg der Membranproteins crystallizat stark unterstützenIon. Weitere Informationen über Detergentien, ihre Eigenschaften, CMC-Informationen und deren Verwendung bei der Reinigung von Membranproteinen und anderen Anwendungen können auf kommerziellen Anbieter Websites.
   7. Zentrifugieren des solubilisierten Probe bei 300.000 g für 1 Stunde bei 4 ° C. Der Überstand enthält nun das Waschmittel mit gelöstem Ziel β-Fass OMP.
   8. Fahren Sie mit Abschnitt 2.3, wie unten beschrieben.
2. Umfaltungslösungen von Inclusion Bodies
   Hinweis: Für die In - vitro - Neufaltung das Ziel β-Fass OMP exprimiert wird direkt in inclusion bodies. Ein Vorteil hier ist, dass diese Proteine ​​in großen Mengen hergestellt werden. Jedoch ist der Nachteil, dass Neufaltung oft ineffizient und variiert von einem Rückfaltungsexperiment zum nächsten. Dennoch gibt es viele Beispiele für Proteine, die für strukturelle Untersuchungen erfolgreich rückgefaltet wurden. Nach der Expression in Einschlusskörper, muss man isolieren jetzt die Einschlusskörper für Neufaltung Experiments.
   1. Die Zellen in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl _2, 50 & mgr; g / ml AEBSF, 5 ug / ml DNase I, 4 mM 2-Mercaptoethanol (BME)) (5 ml pro g Zellpaste). Lyse entweder mit einem Französisch Presse, Beschallung oder Zellhomogenisators.
   2. Pellet die inclusion bodies durch eine niedrige Schleuderdrehzahl bei 6.000 xg für 10 min bei 4 ºC.
   3. Waschen der Einschlusskörper durch in 25 ml von 1,0 M Harnstoff unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators resuspendiert. Pellet wieder durch eine niedrige Schleuderdrehzahl bei 6.000 xg für 10 min bei 4 ºC.
   4. Wiederholen Sie Schritt 2.2.3 wie nötig.
   5. Resuspendieren der gewaschenen Einschlußkörper zu einer Endkonzentration von 10 mg / ml unter Verwendung von Puffer , enthaltend 8,0 M Harnstoff (oder 6,0 M Guanidinium - Hydrochlorid (GdCl)) und Detergens (dh DDM oder LDAO) bei 2x CMC oder höher.
      Hinweis: Wenn ein Histidinmarkierung, immobilisiert Metall-Affinitätschromatographie (IMAC) Reinigung gewünscht wird, für Ziele Membranprotein enthält, kann Denaturierung Co unter Verwendung vonBedingungen ausgebracht (in 8,0 M Harnstoff oder 6,0 M GdCl) als ersten Schritt ähnlich dem unten in Abschnitt 2.3 beschrieben.
   6. Führen Sie die Rückfaltungsreaktion langsam (über Nacht) des Denaturierungsmittels durch Dialyse in Puffer Entfernen des Denaturierungsmittels fehlt.
      Hinweis: Es kann mehrere Änderungen des Dialysepuffer nehmen, dies zu erreichen. Alternativ können der erste, wenn die inclusion bodies auf eine IMAC-Säule gebunden werden, kann man die Rückfaltungsreaktion tun, während nach wie vor an die Säule gebunden, indem langsam Puffer Austausch des Denaturierungsmittels zu entfernen. In jedem Fall daran denken, dass dies ein Membranprotein ist daher Waschmittel muss vorhanden sein, um das Ziel zu stabilisieren. Auch, wenn das Detergens verwendet wird dialysierbar ist, muss er mit dem Dialysepuffer (s) als auch hinzugefügt werden.
   7. Dreh die neugefaltete Proben bei 200.000 × g für 1 h bei 4 ºC. Der Überstand enthält die rückgefaltetes Detergenz solubilisierten Ziel β-barrel OMP.
   8. Fahren Sie mit Abschnitt 2.3, wie unten beschrieben.
3. Die Reinigung Verwendung von IMAC, Ionenaustausch und Gelfiltration
   Hinweis: das Protein Angenommen wurde mit einem Histidin - Tag konstruiert, ob nativ Methoden in vitro exprimiert und rückgefaltet, so immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC) zur Reinigung durchgeführt , ähnlich wie für Histidine lösliche Proteine ​​markiert, mit der Ausnahme Detergenz in gehalten werden müssen alle nachfolgenden Puffer das Ziel β-Fass OMP solubilisiert und stabil zu halten.
   1. Bereiten Sie eine 1-5 ml IMAC-Säule oder eine Vorverpackung Spalte. Führen nachfolgende Chromatographieschritte bei 4 ° C. Spülen Sie mit Wasser zu entfernen, um alle Spuren von Konservierungsstoffen. Wenn ein automatisiertes Reinigungssystem verwenden, installieren Sie die Spalte nach den Anweisungen des Herstellers.
   2. Bereiten 500 ml IMAC - Puffer A (50 mM K ₂ HPO _4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM) und 250 ml IMAC - Puffer B (50 mM K ₂ HPO _4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM und 1,0 M Imidazol).
      Hinweis: Andere Reinigungsmittel, die ich verwendet werden kann,nclude Cymal-6 (0,05%), Triton X-100 (0,03%) und LDAO (0,05%).
   3. Äquilibrieren der IMAC-Säule 10 Säulenvolumina von IMAC Puffer A mit
   4. Hinzufügen Imidazol zur Proteinprobe bis zu einer Endkonzentration von 25 mM und mischen. Laden der Probe auf die äquilibrierte IMAC-Säule mit 2 ml / min. Sammeln Sie die Strömung durch.
   5. Waschen Sie das IMAC - Säule mit 5 Säulenvolumina von jeweils Konzentrationen von Imidazol unter Verwendung von Puffer B zu (dh 25 mM, 50 mM, 100 mM). Sammeln Sie die Waschungen in 2 ml-Fraktionen.
   6. Eluieren der Probe mit einer Endkonzentration von 250 mM für 5 Säulenvolumina. Sammeln Sie die eluierte Probe in 2 ml-Fraktionen.
   7. Analysieren der Strömung durch die Waschfraktionen und die Elutionsfraktionen unter Verwendung von SDS-PAGE-Analyse (siehe Schritt 1.2.6), bezogen auf ihre Absorption bei 280 nm. Pool, die Fraktionen, die die Ziel β-Fass OMP enthält, wie durch SDS-PAGE-Analyse verifiziert.
   8. Entfernen Sie die 6x-Histidin-Tag durch TEV-Protease auf die gepoolte Probe zugegeben (nachdem Protokoll des Herstellers) und über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln inkubiert.
   9. Legen Sie die Probe / Protease-Lösung auf eine IMAC-Säule wieder das Ziel β-Fass OMP zu trennen (fließen durch) von den gespaltenen Tags und jede ungespaltene Probe. Die Strömung durch enthält die gespaltene Probe das Etikett fehlt.
      Anmerkung: Dies würde entfernen auch jede Protease wie TEV-His, die auch eine nicht-spaltbare 6x-Histidin-Tag selbst hat. Andernfalls werden andere Verfahren benötigt, um die Protease nach der Verdauung zu entfernen.
   10. Optional Ionenaustauschchromatographie, um die Probe zu reinigen zuführen. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Säule verwendet werden, wobei Sie Waschmittel in allen Puffern aufzunehmen.
   11. Zur Vorbereitung für die Kristallisation, laden die Probe auf eine Gelfiltrationssäule in einen Puffer des Detergens enthält, die für die Kristallisation verwendet werden, wie beispielsweise 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1% OG.
   12. Sammeln Sie 1-ml-Fraktionen und analysieren using SDS-PAGE-Analyse (siehe Schritt 1.2.6), bezogen auf ihre Absorption bei 280 nm. Pool-Fraktionen mit Absorptionen bei 280 nm, wie sie enthalten das Zielprotein. Konzentrat auf ~ 10 mg / ml.
       Hinweis: Falls gewünscht, kann die richtige Faltung beurteilt werden, um einen Wärme Modifizierbarkeit Test unter Verwendung von wie unten beschrieben.
4. Wärme Änderbarkeit Assay
   Hinweis: Eine Methode , die richtige Faltung des gereinigten β-Fass OMP zu überwachen ist , um Wärme Modifizierbarkeit Assays unter Verwendung eines semi-nativen SDS-PAGE ²² durchführen. Hier erhitzten Proben, die richtig gefaltet sind, wandert der Regel unterschiedlich von denen, die Wärme denaturiert werden. Diese Eigenschaft ist einzigartig OMP zu-Lauf ß und weit zu studieren diese Familie von Membranproteinen eingesetzt.
   1. Vor der Probenvorbereitung, montieren die Gelapparatur. Um zu beginnen, legen Sie den Puffertank in einen Eiskübel und vollständig umgeben mit Eis. Legen Sie ein hauseigenes gegossenen oder kommerziellen nativen Gradientengel in den Halter und legen Sie in den Tank. Füllen ter Tank vollständig mit kaltem 1x MES Laufpuffer (50 mM 2- [N-Morpholino] ethansulfonsäure, 50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7.3).
   2. Pipette 0,25 & mgr; l der Probe (10 mg / ml) in zwei 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Beschriften Sie eine als "Gekochte" und die andere als 'RT'.
   3. In 9,75 ul Probenpuffer zu jeder und durch Pipettieren mischen. In den beiden Proben, mit 10 & mgr; l 2x SDS-Ladepuffer (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% Bromphenolblau und 20% Glycerin) und sanft durch Pipettieren vermischt.
   4. Kochen Sie die 'Gekochter' Probe bei 95 ° C für 5 min, während die 'RT' Probe verlassen bei RT. Drehen Sie das 'Gekochter' Probe kurz.
   5. Last 20 ul beider Proben auf den vormontierten nativen Gel. Entfernen Sie Lauf für 60 Minuten bei konstant 150 V, das Gel und genießen in Färbelösung die Ergebnisse zu visualisieren.

3. Die Kristallisation

Anmerkung: Für die Kristallisation von sowohllösliche und Membranproteinziele ist es Standardprotokoll Probe Reinheit und Stabilität (dh beste Reinigungsmittel, Liganden, Cofaktoren, etc.) zu maximieren. Aktuelle Methoden zur Membranproteinziele im allgemeinen Kristallisieren umfasst drei Hauptansätze, die die amphiphilen Anforderungen der Bilayer-eingebetteten Proteine ​​erfüllen: (1) Reinigungsmittel, (2) Bicellen, und (3) lipiden kubischen Phase (LCP) (Figur 6) ^23. Verwendung eines Roboters Nanoliter- Kristallisation wird dringend empfohlen , wenn möglich, um die Anzahl von Bedingungen zu erhöhen , die für ein gegebenes Probenvolumen gescreent werden können, sowie unter Verwendung der jüngsten Fortschritte in Werkzeugen soll Strukturbestimmung zu unterstützen (Abbildung 7).

1. Die Kristallisation unter Verwendung von Detergenzien
   1. Besorgen Sie sich ein solubilisiertem Proteinprobe, die bei ~ 10 mg / ml-Konzentration. Fügen Sie optional das Additiv 1,2,3-Heptantriol direkt auf die Probe bis zu einer Endkonzentration von 3% zu reduzieren Detergent Mizellgröße.
   2. Filtern Sie die Probe unter Verwendung eines 0,22 um zentrifugale Filter zu entfernen Partikel und Niederschlag.
   3. Mit Hilfe eines Kristallisationsroboter, führen breite Matrix Kristallisation Screening entweder durch hängende im Handel erhältlichen 96-Well-Bildschirmen oder sitzenden Tropfen Verdampfungsverfahren mit Tropfen besteht aus ~ 200 nl Proteinprobe und ~ 200 nl Kristallisationspuffer.
   4. Inkubieren der Kristallisationsplatten bei ~ 21 ° C. Überprüfen Sie die Platten wöchentlich für das Kristallwachstum ein Stereomikroskop verwendet wird.
   5. Optimieren Kristallisation führt durch Komponenten des Kristallisationszustand in systematischer Weise (steigend / fallend Salz oder Fällmittel Konzentrationen, pH, Inkubationstemperaturen und / oder Proteinkonzentration) variiert.
2. Kristallisation mit Bicellen
   Hinweis: Eine ausführliche Demonstration der Bicellen Techniken wurde bereits früher von Ujwal und Abramson ²⁴ beschrieben.
   1. Bereiten Sie oder kaufen ein 35% Bicellen Mischung bestehend aus DMPC: CHAPSO in einem Verhältnis von 2,8: 1 nach den veröffentlichten Protokollen ^25. Andere Konzentrationen können ebenfalls untersucht werden, sowie anderen Lipiden und Detergentien, wie nötig.
   2. Besorgen Sie sich ein solubilisiertem Proteinprobe, die bei ~ 10 mg / ml-Konzentration.
   3. Fügen Sie die Bicellen Mischung auf Eis, bei einem Ausgangsverhältnis von 4: 1 v / v (Protein: Bicellen) (zB werden 10 ul Bicellen Mischung auf 40 & mgr; l Protein und vermischen sich rasch durch Pipettieren).
   4. Inkubieren auf Eis 30-60 min.
      Hinweis: Das Protein: Bicellen Lösung sollte vor allem klar bleiben, kann aber oft etwas undurchsichtig machen. Wenn jedoch das Protein: Bicellen Lösung milchig weiß, was anzeigt , Präzipitation dreht, dann sollten andere Variablen untersucht werden (dh Detergens, Puffer, etc.). Bei neuen Proben, tun kleine Tests (8 ul Protein und 2 ul Bicellen) wird empfohlen, die Stabilität zu überprüfen, bevor die Aufstockung um unnötige Probenverlust zu verhindern.
   5. Mit Hilfe eines Kristallisationsroboter, führen breite Matrix Kristallisation Screening entweder durch hängende im Handel erhältlichen 96-Well-Bildschirmen oder sitzenden Tropfen Verdampfungsverfahren mit Tropfen besteht aus ~ 200 nl Proteinprobe und ~ 200 nl Kristallisationspuffer.
   6. Inkubieren der Kristallisationsplatten bei ~ 21 ° C. Überprüfen Sie die Platten wöchentlich für das Kristallwachstum ein Stereomikroskop verwendet wird.
   7. Optimieren Kristallisation führt durch Komponenten des Kristallisationszustand in systematischer Weise (steigend / fallend Salz oder Fällmittel Konzentrationen, pH, Inkubationstemperaturen und / oder Proteinkonzentration) variiert.
3. Kristallisation mit Lipidische kubischen Phase (LCP)
   Hinweis: Eine ausführliche Demonstration von LCP - Techniken wurde bereits früher von Liu und Cherezov ^26,27 beschrieben.
   1. Besorgen Sie sich ein solubilisiertem Proteinprobe, die bei ~ 20 mg / ml-Konzentration.
   2. Vorwärmen die Monoolein auf ~ 40 ° C. Belastung60 ul Monoolein in einem gasdichten 100 & mgr; l-Spritze und 40 ul Proteinprobe in eine andere.
   3. Mit Hilfe eines Misch Koppler, schließen Sie die Spritzen, man aufpassen, nicht Luft einzuführen.
   4. Vorsichtig mischen, indem abwechselnd Druck auf die Spritzenkolben drückt die Mischung aus einer Spritze in die andere vollständig, bis die Probe wird durchsichtig und homogen.
   5. im Handel erhältliche 96-Well-Bildschirme mit Sandwich-Stil Kristallplatten (0,1 mm Dicke gut) mit Tropfen zusammengesetzt aus 100 nl Proteinprobe und 750 nl Kristallisationspuffer Mit einem Kristallisationsroboter für LCP Methoden entwickelt, führen breite Matrix Kristallisation Screening verwendet wird.
      Hinweis: Drop-Verhältnisse können bei Bedarf angepasst werden. Auch feste Abdeckungen (dh Glas oder dicke Kunststoff) empfohlen , welche die Tropfen schön eher als dünne Filme unterstützen, die dazu neigen , die Tropfen zu ermöglichen , über die gut zu bewegen , wie die Platten behandelt werden.
   6. Inkubieren Sie die Kristallisation plates bei ~ 21 ° C. Überprüfen Sie die Platten wöchentlich für das Kristallwachstum ein Stereomikroskop verwendet wird.
   7. Optimieren Kristallisation führt durch Komponenten des Kristallisationszustand in systematischer Weise (steigend / fallend Salz oder Fällmittel Konzentrationen, pH, Inkubationstemperaturen und / oder Proteinkonzentration) variiert.

YiuR ist ein TonB abhängig Eisen Transporter, der ein mutmaßliches Impfstoff Ziel gegen Yersinia pestis ist. Es wurde ursprünglich identifiziert einen Microarray - Assay. Dabei sind die Schritte, die unternommen wurden , um die Struktur von YiuR Verwendung Röntgenkristallographie zu bestimmen , werden beschrieben (Abbildung 9). Zur Klonierung der DNA-Sequenz von YiuR (minus der N-terminalen Signalsequenz) wurde PCR aus genomischer DNA amplifiziert und subkloniert in einen Vektor, der ein N-terminalen pelB Signalsequenz und 10x-Histidin Affinitäts-Tag, gefolgt von einer TEV-Protease-Stelle enthält. Zur Expression wurde die YiuR enthaltenden Plasmids in BL21 (DE3) kompetente Zellen transformiert und einer einzelnen Kolonie verwendet , um eine 5 ml Starterkultur zu wachsen 600 ~ 0,5 bis Od. Zwölf-Kolben, die 750 ml TB-Medium wurden dann mit 1 ml der Starterkultur inokuliert, und man ließ für 3 d bei 20 ºC zu wachsen (bei 220 rpm Schütteln). Die Zellen wurden dann geerntet, die Herstellung von etwa 150-200g der gesamten Zellpaste, die abgekühlt wurde der Flash-in flüssigem Stickstoff und bei -80 ºC bis zur Verwendung gelagert.

Zur Reinigung von YiuR, 20 g der Zellen wurden in 120 ml 1x PBS resuspendiert (10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4) durch mit DNase I Rühren bei RT und AEBSF hinzugefügt wird. Lysis wurde durch zwei Durchgänge durch einen Homogenisator durchgeführt wird. Das Lysat wurde dann für 10 Minuten bei 12.000 g zentrifugiert (aufgebrochene Zellen und Einschlusskörper Spin-Down). Der Überstand wurde erneut 60 Minuten bei 235.000 xg zentrifugiert, wobei das Pellet der Membranfraktion (YiuR) enthält. Die Membranen wurden dann in 100 ml 1x PBS unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators resuspendiert. YiuR wurde solubilisiert / extrahiert aus Membranen Elugent bei 5% Endkonzentration unter Verwendung Rühren über Nacht (bis zu 16 h) bei 4 ºC. Die solubilisierten Membranen wurden dann bei 371.000 × g für 60 min zentrifugiert, erneut mit dem supernatant die solubilisierte Fraktion einschließlich YiuR enthält. Zur Isolierung YiuR wurde IMAC unter Verwendung von Puffer A (1x PBS, 0,1% DDM) durchgeführt, und Puffer B (1x PBS, 1 M Imidazol, 0,1% DDM), gewaschen mit Imidazol-Konzentrationen von 30 bis 50 mM und eluiert mit 250-500 mM . Zu entfernen , wurde die N-terminale 10 - fach-Histidin - Tag, Inkubation mit TEV HIS - Protease über Nacht bei 4 ° C während der Dialyse in 1x PBS - Puffer durchgeführt. Die Probe wurde dann erneut über eine IMAC-Säule geleitet, die Strömung durch engt, dialysiert und dann getrennt weiter ein 0-1,0 M NaCl-Gradienten auf einer Ionenaustauscher-Säule in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Fraktionen YiuR enthielten, wurden dann vereinigt, konzentriert und lief eine Gelfiltrationssäule unter Verwendung von 25 mM Tris-HCl über, pH 7,5, 200 mM NaCl, und 0,05% LDAO. Die Fraktionen YiuR enthielten, wurden dann vereinigt und auf 10 mg / ml für die Kristallisation eingeengt.

Broad Matrix-Screening wurde dann durchgeführt, und die Bedingungen bestimmtdass produzierte einige anfängliche Beugen Kristalle. Eine weitere Optimierung führte zu größeren Kristallen, die nativen Röntgenbeugungsdaten zu sammeln, verwendet wurden. Kristalle in 8 gezeigt sind repräsentativ für Kristalle eines erreichen kann hier präsentierten Verfahren. Kristalle aus Detergens und Screenen Bicellen kann so groß wie Kristalle typischerweise für lösliche Proteine ​​erhalten werden; jedoch sind solche aus LCP fast immer viel kleiner. Die Daten waren gut genug, um für die molekulare Ersatz verwendet werden, was dazu führte Bestimmung auf 2,65 Å Auflösung zu strukturieren.

Abbildung 1. Die beiden Arten von vollständig integrierten Membranproteinen sind α-helikalen und β-Barrel. Sehen Sie hier Beispiele für die jeweils mit dem β2-adrenergen Rezeptor (PDB-Code 2RH1, α-helix) und dem TonB abhängigen Transporter BTub (PDB-Code 1NQE,ß-Fass). Die obere Reihe zeigt die extrazelluläre Ansicht , während die untere Reihe der Membran Ansicht zeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. β-Fass OMP dienen viele verschiedene Funktionen und verschiedene Strukturen haben kann. Während α-Helix-Membranproteine ​​eine oder mehrere Transmembrandomänen enthalten, reichen β-Fass OMP 8-26 Stränge und jeder Strang interagiert eng mit den benachbarten Strängen. Außen Reste, die mit der Membran in Wechselwirkung treten, sind in der Regel hydrophob, während die inneren Reste, die mit dem Lösungsmittel interagieren, typischerweise polar und hydrophil. Obere Reihe zeigt die extrazelluläre Ansicht, die mittlere Reihe zeigt die Membran Ansicht und die untere Reihe zeigt die periplasmic Ansicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Beispiele für zwei Arten von gemeinsamen β-Fass OMP. Links, die Struktur des TonB abhängigen Transporter FepA (PDB-Code 1FEP), der Darstellung der extrazellulären (oben), Membran (Mitte) und periplasmatischen (unten) Ansichten. Die β-Fass-Domäne wird in grün angezeigt, während die Plug-Domäne in Magenta ist. Richtig, die Struktur des Autotransporters EstA (PDB-Code 3KVN), der Darstellung der extrazellulären (oben), Membran (Mitte) und periplasmatischen (unten) Ansichten. Die β-Fass - Domäne wird in Gold angezeigt , während die Passagierdomäne in blau ist. Bitte hier klicken vergrößern versi anzuzeigenauf dieser Figur.

Abbildung 4. Schematische Darstellung der Klonierung und Expression - Pipeline für die Herstellung von β-Fass OMP. Schema der Pipeline ein Ziel OMP entweder durch nativen Membranexpression (links) oder durch Expression in Einschlusskörper für Neufaltung (rechts) zu klonen verwendet und zum Ausdruck bringen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Schematische Darstellung der Reinigung Pipeline zur Isolierung von β-Fass OMP. Schema der Pipeline für die Extraktion von OMP verwendet , die direkt in die OM ausgedrückt wurden. Hier hat die Ziel OMP Extrakt seined von der Membran durch Solubilisierung mit einem geeigneten Reinigungsmittel und dann durch IMAC, Ionenaustausch - Chromatographie und Gelfiltration. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6 Schematische Darstellung der Kristallisationsleitung für Kristalle von β-barrel OMPs wächst. Drei Verfahren können für die Kristallisation von β-barrel OMPs verwendet werden einschließlich Waschmittel - Screening, Bicellen und lipidic kubische Phase (LCP). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7. Neue Werkzeuge in der Kristallographie , die wesentlich dazu beigetragen haben , die Bestimmung von β-Fass OMP zu strukturieren. Beispiele dafür sind Kristallisationsroboter / LCP - Roboter (A), UV - Mikroskope (B), zweiter Ordnung Nonlinear Imaging chiraler Kristalle (SONICC) Visualisierung (C), Roboter - Pucks / Roboter (D), Rasterung / Vektor / Schraubendatenerfassungsmethoden (E ) und Mikrofokus- Balken (F). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8. Repräsentative Bild der Kristalle aus dem Protokoll. Kristalle von Waschmittel - Screening und Bicellen können so groß wie Kristalle seintypischerweise für lösliche Proteine ​​erhalten werden; jedoch sind solche aus LCP fast immer viel kleiner. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 9. Von Konstrukte Kristalle Bestimmung für den vermeintlichen Impfstoff Ziel YiuR von Yersinia pestis zu strukturieren. Die Gesamtleitung für die Strukturbestimmung von YiuR verwendet wird , veranschaulicht die Schritte , zu klonen, zum Ausdruck bringen, zu reinigen, zu kristallisieren, und lösen die Struktur. Bitte klicken hier , um eine größere Version dieser Figur sehen.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.