Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Zusammenfassung

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) erfüllen viele Funktionen innerhalb der äußeren Membranen von gramnegativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten. Hier hoffen wir, einen bekannten Engpass in Strukturstudien zu entschärfen, indem wir Protokolle für die Herstellung von β-Zylinder-OMPs in ausreichender Menge für die Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie vorstellen.

Zusammenfassung

Membranproteine erfüllen wichtige Funktionen in Zellen wie Nährstofftransport, Motilität, Signalübertragung, Überleben und Virulenz, machen aber nur ~1% Prozent der bekannten Strukturen aus. Es gibt zwei Arten von Membranproteinen, α-helikale und β-Fass-Proteine. Während α-helikale Membranproteine in fast allen zellulären Membranen zu finden sind, sind β-Fass-Membranproteine nur in den äußeren Membranen von Mitochondrien, Chloroplasten und gramnegativen Bakterien zu finden. Ein häufiger Engpass bei Strukturstudien von Membranproteinen im Allgemeinen besteht darin, genügend reine Proben für die Analyse zu erhalten. In der Hoffnung, denjenigen helfen zu können, die daran interessiert sind, die Struktur ihres bevorzugten β-Fass-Außenmembranproteins (OMP) zu entschlüsseln, werden allgemeine Protokolle für die Herstellung von Ziel-β-Fass-OMPs auf einem Niveau vorgestellt, das für die Strukturbestimmung durch Röntgenkristallographie und/oder NMR-Spektroskopie nützlich ist. Hier skizzieren wir das Konstruktdesign sowohl für die native Expression als auch für die Expression in Einschlusskörpern, die Reinigung mit einem Affinitätstag und die Kristallisation mit Detergenz-Screening, Bicelle und Lipid-Kubic-Phasen-Techniken. Diese Protokolle wurden getestet und haben sich bei den meisten OMPs von gramnegativen Bakterien als wirksam erwiesen. Es gibt jedoch einige Ziele, insbesondere für Mitochondrien und Chloroplasten, die möglicherweise andere Methoden zur Expression und Reinigung erfordern. Daher sollten die hier aufgeführten Methoden für die meisten Projekte anwendbar sein, die OMPs von gramnegativen Bakterien beinhalten, jedoch variieren die Expressionsniveaus und die Menge der gereinigten Probe je nach Ziel-OMP.

Einleitung

β-barrel OMPs kann nur in den äußeren Membranen von Mitochondrien, Chloroplasten und Gram-negative Bakterien ^1-3 gefunden werden. Während sie ähnliche Rollen wie α-helicalen Proteinen dienen, sie haben eine sehr unterschiedliche Falte, bestehend aus einem zentralen Membran eingebetteten Domäne β-Fass im Bereich 8-26 antiparallelen β-Strängen mit jeder Strang eng mit den beiden benachbarten Stränge verbunden sind, (Figuren 1 und 2). Die ersten und letzten Stränge der β-Faß Domäne dann miteinander, fast ausschließlich in einer antiparallelen Art und Weise (mit Ausnahme der mitochondrialen VDAC) interagieren die β-Fass-Domäne....

Protokoll

1. Klonierung und Expression

Hinweis: Um strukturelle Untersuchungen zu ermöglichen, ausreichende Mengen an hochgereinigtem Protein muss hergestellt werden, und das im Allgemeinen mit der Klonierung und Überexpression des Ziel β-Fass - Außenmembranprotein (OMP) in E. coli (Abbildung 4). Bis heute sind alle OMP Strukturen β-Barrel, einschließlich jener Strukturen für mitochondriale VDAC wurden von bakteriell exprimiertem Protein ¹¹ abgeleitet. Hier allgemeine Protokolle sind für das Klonen präsentiert und mit dem Ausdruck β-Fass OMP für (1) nativen Ausdruck direkt in Bakterienmembranen und (2) die Express....

Ergebnisse

YiuR ist ein TonB abhängig Eisen Transporter, der ein mutmaßliches Impfstoff Ziel gegen Yersinia pestis ist. Es wurde ursprünglich identifiziert einen Microarray - Assay. Dabei sind die Schritte, die unternommen wurden , um die Struktur von YiuR Verwendung Röntgenkristallographie zu bestimmen , werden beschrieben (Abbildung 9). Zur Klonierung der DNA-Sequenz von YiuR (minus der N-terminalen Signalsequenz) wurde PCR aus genomischer DNA amplifiziert und subklonier.......

Diskussion

β-Fass OMP dienen wesentliche Rollen in Gram-negativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten und sind wichtige Ziele für die Strukturanalyse, die eine Fülle von Informationen über die wesentlichen molekularen Mechanismen, die an den äußeren Membranen dieser jeweiligen Organellen bieten. Jedoch reicht Probe für die Strukturanalyse der Herstellung nicht immer einfach, und daher eine allgemeine Rohrleitung für die Erzeugung von ausreichenden Mengen von Ziel-β-barrel OMPs zur Strukturbestimmung dargestellt, erläutern i.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kristallisationsroboter	TTP Labtech, Art Robbins-Jeder		sollte hier arbeiten, außer LCP Kristallisation
PCR Thermocycler	Eppendorf, BioRad-Media
Shaker	New Brunswick, Infors HT-UV-vis
Spektrometer
Gerät	BioRad	1645050, 1658005
SDS-PAGE und native Gele	BioRad, Life Technologies	4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA Prime	GE	Healthcare-AkTA
Purifier	GE
(niedrige bis mittlere Drehzahl)	Beckman-Coulter-Ultrazentrifuge
(hohe Geschwindigkeit)	Beckman-Coulter-SS34
Rotor	Sorvall-Typ
45 Ti Rotor	Beckman-Coulter-Typ
70 Ti Rotor	Beckman-Coulter-Dounce
Homogenisator	Fisher Scientific	06 435C
Emulsiflex	Avestin-Dialyseschlauch
	Sigma	D9652
LCP-Werkzeuge	Hamilton, TTP Labtech-VDX	24-Well-Platten
	Hampton Research	HR3-172
Sandwichplatten	Hampton Research, Molecular Dimensions	HR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Kristallisationsplatten	Grace Bio-Labs	875238
HiPrep S300 HR Säule	GE Healthcare	17-1167-01
Q-Sepharose-Säule	GE Healthcare	17-0510-01
Kristallisationssiebe	Hampton Research, Qiagen, Molecular	Dimensions-Gasdichte
Spritze (100 ml)	Hamilton