Automatisierte Modular High Throughput Exopolysaccharid Screening-Plattform mit hochsensiblen Carbohydrate Fingerabdruck-Analyse Gekoppelt

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine automatisierte modulare Hochdurchsatzmethode zur Identifizierung und Charakterisierung von mikrobiellen Exopolysacchariden in kleinem Maßstab. Diese Methode kombiniert eine schnelle Vorselektion zur Analyse der Gesamtmenge an sezernierten Polysacchariden mit einem detaillierten Kohlenhydrat-Fingerabdruck, um ein schnelles Screening von neu isolierten Bakterienstämmen oder ganzen Stammsammlungen zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Viele Mikroorganismen sind in der Lage zu erzeugen und zu sekretieren Exopolysaccharide (EPS), die wichtige Auswirkungen in medizinischen Bereichen, Lebensmittelanwendungen oder in den Ersatz von petro basierten Chemikalien haben. Wir beschreiben ein analytisches Plattform auf einem Flüssigkeitshandhabungssystem automatisiert werden, die eine schnelle und zuverlässige Analyse des Typs und der Menge an EPS von Mikroorganismen hergestellt werden können. Es ermöglicht dem Benutzer, neue natürliche mikrobielle Exopolysaccharid Hersteller zu identifizieren und die Kohlenhydrat Fingerabdrucks der entsprechenden Polymere innerhalb eines Tages in Hochdurchsatz (HT) zu analysieren. Mit Hilfe dieser Plattform, Stammsammlungen sowie Bibliotheken von Stammvarianten, die in technischen Ansätzen gewonnen werden könnten kann gescreent werden. Die Plattform hat einen modularen Aufbau, der eine Trennung des Protokolls in zwei Hauptteile ermöglicht. Erstens gibt es ein automatisiertes Screening-System, das verschiedene Polysaccharid Detektionsmodule kombiniert: a semi-quantitative Analyse von viscosity Bildung über einen Zentrifugationsschritt, einer Analyse der Polymerbildung durch Alkoholfällung und die Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehalts über eine Phenol-Schwefelsäure-Transformation. Hier ist es möglich, bis zu 384 Stämme pro Lauf zu screenen. Der zweite Teil enthält eine detaillierte Monosaccharid-Analyse für alle ausgewählten EPS Produzenten im ersten Teil die von zwei wesentlichen Module kombinieren: die Analyse der gesamten Monomerzusammensetzung über ultra Hochleistungs-Flüssigchromatographie gekoppelt mit UV-und Elektrospray-Ionisations-Ionenfalle Erkennung ( UHPLC-UV-ESI-MS) und die Bestimmung von Pyruvat als Polymer Substituent (Vorhandensein von Pyruvat-Ketal) durch enzymatische Oxidation, die zu einer Farbbildung gekoppelt ist. Alle analytischen Module dieser Screening-Plattform kann auf unterschiedliche Weise und angepasst auf die individuellen Anforderungen kombiniert werden. Zusätzlich können sie alle mit einer Flüssigkeitshandhabungssystem oder manuell durchgeführt gehandhabt werden. Dadurch wird das Screening plaTForm ermöglicht eine enorme Flexibilität, um verschiedene EPS zu identifizieren.

Einleitung

Mikrobielle Exopolysaccharide (EPS) sind eine strukturell sehr heterogene Gruppe von Polymeren, die verschiedene biologische Funktionen erfüllen. Sie sind meist aus komplexen Wiederholungseinheiten aufgebaut, die von verschiedenen Arten von Monomeren (Zucker, Zuckerderivate, Zuckersäuren) auszeichnen, die Bindungen zwischen den Monomeren und deren Substitutionen. Die strukturelle Vielfalt von mikrobiellen Polysacchariden verleiht eher unterschiedlichen Eigenschaften an die Mitglieder dieses Moleküls Klasse, die in verschiedenen Bereichen wie Lebensmittel ^1, Kosmetika ^2,3 ihre Anwendung ermöglicht es , bauchemische ⁴ oder Wasseraufbereitung ^5. Zur Erweiterung auf dem Gebiet der Anwendung dieser biobasierten und so eine nachhaltige Polymere die Identifizierung von neuen natürlichen mikrobiellen Polysacchariden sowie das Engineering von Strukturvarianten vielversprechende Ansätze darstellt. So oder so, ein schnelles Screening-Verfahren ist erforderlich, schnell eine große Anzahl von Mikrobenstämme für thei scannenr Polysaccharid-Bildung und ihre Produkte zu analysieren. Daher haben wir kürzlich eine 96-Well - HT-Screening - Plattform für die Analyse von mikrobiellen Polysaccharid - Produktion aus natürlichen Isolaten oder künstlich Stammvarianten entwickelt, die die Identifizierung der monomeren Zusammensetzung umfasst ^6.

Die Anwendung dieser Plattform für einen ersten Screeningrunde von ~ 500 natürlichen Isolaten konnten wir nur etwa 10 bis 20% der isolierten Stämme zu identifizieren, in der Lage, EPS zu produzieren (Daten nicht gezeigt). Dies bedeutet, dass 80-90% der analysierten Stämme produzieren nicht EPS unter den Bedingungen angewendet wird, und daher wird eine weitere Analyse des Fingerabdrucks detaillierten Kohlenhydrat war nicht erforderlich. Da diese hochentwickelte Identifizierung der monomeren Zusammensetzung ist ein zeitaufwendiges Verfahren, insbesondere für die Datenanalyse, eine schnelle Vor-Screening-Verfahren mit den Stämmen positiv in EPS Produktion zu identifizieren, würde die Effizienz drastisch erhöhen. Weiterhin Reagenzien,Verbrauchsmaterialien und Messzeit an der UHPLC-UV-ESI-MS würde reduziert werden. Darüber hinaus werden die verschiedenen Analysemodule, während einerseits die Methode sehr zuverlässig machen, sind auf der anderen Seite die manuelle Handhabung von mehr als zwei 96-Well-Platten parallel zu komplizieren, und als solche, das volle Potenzial des Verfahrens beschränken. Aus diesen Gründen haben wir uns entschlossen, ein automatisiertes Screening-Plattform zu entwickeln. Daher kombinierten wir die modularen Format des vorhandenen Kohlenhydratfingerabdrucktechnik mit einem vollautomatischen Schnellnachweisverfahren der Gesamtzuckergehalt, bezogen auf die Absorptionsmessung.

Das Phenol-Schwefelsäure-Methode stellt immer noch das Mittel der Wahl für die schnelle Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehalt von bakteriellen und pflanzlichen Polysacchariden ^7,8. Diese Methode wurde erstmals von Dubois et al. ⁹ und für verschiedene Anwendungen und Probengrößen angepasst, auch bei kleinen Maßstab in 96-Well - Platten ^10,11. Die phenol-Schwefelsäureverfahren misst die Gesamtkohlenhydratgehalt um einen Wert, Summieren aller monomeren, oligomeren und polymeren Kohlehydraten der Proben.

Unter diesen Aspekten Rechnung zu tragen, ist die Wahl eines geeigneten Kultivierungsmedium wichtig, diese Methode anzuwenden. Komplexen Medien oligomeres oder polymeres Kohlenhydratverbindungen wie Hefeextrakt könnte zu einer veränderten Polymergehalt führen und daher unbedingt vermieden werden sollte. Weiterhin werden als C-Quelle für die Kultivierung der Stämme hohe Mengen an Zuckern verwendet. Hohe Konzentrationen von restlichen Kohlenhydrate aus dem Kultivierungsprozess könnte negativ mit der Messung des EPS-Gehalt stören.

Daher wird die Verwendung von definierten und reine Zucker empfohlen. In unseren Experimenten verwendeten wir Glukose zur Kultivierung der Zellen. Der verbleibende Glucose nach der Kultivierung wurde über eine Gelfiltration verringert und über einen Glucose-Assay bestimmt. Schließlich ist die Glucose äquivalents der Polysaccharide wurden durch Subtrahieren der verbleibenden Glucose nach der Gel-Filtration von der Gesamtkohlenhydratgehalt berechnet, die mit dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren nachgewiesen worden war. Gel-Filtration und Glucose-Assay in Kombination mit dem Phenol-Schwefelsäure-Methode zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten und imstande sind, das erste, vollständig automatisierte Erfassungssystem ist.

Zwei neue Analysemodule wurden in der automatisierten Screening-Plattform enthalten, die Menge von Informationen von dem EPS-Erkennungssystem zu erhöhen: die Fällung und die Beobachtung einer Erhöhung der Viskosität.

Viele verschiedene EPS - zB Succinoglycans, Xanthan und Kolon - Säure ¹² - berichtet , mit einem nicht-Kohlenhydrat - Pyruvat - Ketal auf Zucker Positionen C4 und C6 modifiziert werden. Diese Pyruvat Ketale (wie Succinyl Halbester und Uronsäuren) tragen zur polyanionische Natur und daher auf die physische properties des Polymers durch über zweiwertige Kation Brücken ¹³ zusammenwirkt. Um diese speziellen Polymere die Bestimmung von Pyruvat zu identifizieren wurde als ein weiteres zusätzliches Analysemodul etabliert. Dadurch erhöht sich die Information über die Polysaccharid-Substituenten und ihre möglichen makroskopischen Eigenschaften.

sowie eine schnelle und effiziente Bestimmung der EPS-Hersteller alle Module Kombination ermöglicht die Identifizierung verschiedener EPS. Durch diesen Ansatz kann die Screening - Plattform in zwei Hauptteile (1) aufgeteilt werden. Im Rahmen der automatisierten Screening (Teil I) tritt der Workflow vollautomatisiert (Tabelle 1) , um schnell die EPS - produzierenden Stämme vorgewählt werden . Das Kohlenhydrat Fingerabdruckanalyse (Teil II) bestimmt quantitativ die Monomerzusammensetzung der durch den vorgewählten Stämme produzierten EPS. Dadurch wurde die Datenanalyse minimiert, um das Screening von großen Stammsammlungen zu optimieren. Diesbietet die Möglichkeit, 384 Stämme in einem einzigen automatisierten Screening-Lauf und mit zwei Läufen zu analysieren, die pro Tag von 768 Stämme pro Tag möglich sind. Darüber hinaus gibt der Kohlenhydrat-Fingerprint-Analyse einen noch detaillierteren Überblick über alle identifizierten EPS. Dies ermöglicht die gezielte Analyse und Identifizierung von nur leicht unterschiedlichen EPS-Varianten oder ganz neue im Vergleich zu den bereits beschriebenen chemischen Strukturen von EPS.

Protokoll

1. Automatisierte Screening

Hinweis: Alle Flüssigkeitshandhabungsschritte werden mit einem Roboter-Liquid-Handling-System. Die Zusammensetzung des Roboterwerktisch ist in Abbildung 2 dargestellt. Alle Verbrauchsmaterialien werden in dem Speicherkarussell gespeichert ist , wenn nicht anders erwähnt. Für alle die automatisierte Screening-Schritte einen Roboter-Manipulator (RM) bewegt, um die Verbrauchsmaterialien, (Deep-Well-Platte (DWP); Mikrotiterplatte (MTP), Polymerase-Kettenreaktion Platte (PCR-Platte) und so weiter) zwischen den Karussellpositionen (CP ) und den Arbeitstisch Positionen (WTP). Alle Pipettierschritte sind mit einem 96-Kanal-Pipette-Arm durchgeführt, außer wenn es anders angegeben ist. Alle Schritte werden programmiert und werden automatisch in 96-Well-Format durchgeführt.

1. Der Stamm Anbau (Aufgabe 1 in Abbildung 1)
   Hinweis: Behandeln Sie die Inokulation der vermeintlichen EPS-Stämme und die Abdichtung der Anbauplatten unter sterilen Bedingungen (Laminar Flow) zu erzeugen. die automatisierteschnelle Screening kann vier 96-Well-Platten pro Lauf verarbeiten. Verschiedene Stämme von mehreren Gattungen wurden bereits ⁶ getestet.
   1. impfen manuell die Vorkultur (1 ml EPS-Medien in einer DWP) mit einem 96-poligen Replikator aus einer 96-Well Glycerolstammlösung Platte. Die Platte mit einem atmungsfähigen Dichtungsfolie zu vermeiden, Verdunstung und Belüftung zu ermöglichen. bei 30 ° C inkubieren, für 48 Stunden bei 1000 Upm auf einem MTP-Schüttler.
   2. Beimpfen der Hauptkultur (990 & mgr; l EPS-Medien in einer DWP) von 10 ul der Vorkultur Übertragung eines 50 & mgr; l 12-Kanal Multipipette und unter den gleichen Bedingungen wie die Vorkultur inkubiert. Nehmen Sie eine Kenntnis von allen Stämmen, die nicht wachsen.
2. Herstellung der Roboter-Arbeitstisch und dem Speicherkarussell
   1. Stellen Sie alle aufgeführten Verbrauchsmaterialien in Materialien und Ausrüstung in die richtige Position in dem Speicherkarussell. Hinzufügen , 990 & mgr; l doppelt destilliertem Wasser (ddH ₂ O) in jeder Vertiefung der DWP für die 1: 100 - Verdünnungen für the Glucose-Test (Karusselposition 4-1 bis 4-4).
   2. Vereinbaren Sie einen 250 - ml - Schale mit 150 ml ddH ₂ O bei dem Werktisch Position (WTP) 11.
   3. Abzuscheiden einen 250 ml Schale mit 50 ml Glucose-Assay-Reagenz-Mischung (4 ml 500 mM Kaliumphosphat (pH 5,7), 1,5 ml 50 mM 2,2-azinobis- (3ethylbenzthiazoline) -6-sulfonsäure, 2 ml 100 U Glucoseoxidase, 10 ul 1.000 U Meerrettich - Peroxidase und 42.49 ml ddH ₂ O) an Position WTP 1-2.
   4. Legen Sie zwei leere Dummy-F-Boden MTPs an Position WTP 3-1 und 3-2.
   5. Entfernen Sie die atmungsaktive Siegelfolie, weisen die Hauptkulturen in den Karussellpositionen (CP) 1-1 bis 1-4 und den automatisierten Roboter-Programm zu starten.
3. Die Äquilibrierung der Platten Gel-Filtration
   Hinweis: Die Gel-Filtrationsplatten, die während dieses Screening verwendet werden, können wiederverwendet werden. Hierzu waschen und zentrifugieren dreimal mit jeweils 150 & mgr; l ddH ₂ O bei 2000 xg für 2 min bei 20 ° C. Danach lagern bei 4° C mit 75 & mgr; l 20% Ethanol und Deckel mit einer Silikonkappe Matte.
   1. Bewegen, um die 250 ml Mulde (CP 5-7) mit 5 mM Ammoniumacetat-Puffer (pH 5,6) zu dem WTP 3-3.
   2. Übertragen Sie die Gel-Filterplatten (CP 1-6, 1-7, 2-6 und 2-7) aus dem Karussell zum WTPs 4-1 bis 4-4.
   3. Aspirat 150 ul Ammoniumacetat-Puffer unter Verwendung von 200 & mgr; l Spitzen und abzugeben in der Mitte aller Gel-Filtrationsplatten zur Äquilibrierung.
   4. Übertragen die Gel-Filtrationsplatten in die Zentrifuge (2.000 × g für 2 min bei 20 ° C).
   5. Übertragen Sie die Platten wieder auf dem Werktisch, wiederholen Sie die Schritte 1.3.3, 1.3.4 und 1.3.3. Sie nicht den Zentrifugationsschritt wiederholen Dehydratisierung der Gel-Filtrationsplatten zu vermeiden. Lagern Sie die äquilibrierte Gel-Filtrationsplatten wieder im Karussell.
4. Zellentfernung durch Zentrifugation (Aufgabe 1 in Abbildung 1)
   Hinweis: Um einen niedrigen Hintergrund innerhalb des Screening-Ansatz, um sicherzustellen, analysieren Zelle freiEPS Stände nur und entfernen Zellen durch Zentrifugation nach der Kultivierung enthält.
   1. Übertragen die Hauptkultur DWP von dem Karussell (1-1 bis 1-4) in die Zentrifuge (4.300 xg für 30 min bei 20 ° C).
   2. Bereiten Sie den Arbeitstisch über die RM die Hauptkultur zu verarbeiten.
      Hinweis: Für die Schritte 1.4.2 das System 1.4.3.5 immer zwei Platten parallel behandelt und wiederholt dann alle Schritte mit den nächsten zwei Platten.
      1. Zur Fällung vor der Filtration die MTP von CP bewegen 6-1 und 6-2 4-1 und 5-1 bis WTP. Bewegen Sie den pH-Indikator MTPs von CP 7-1 und 7-2 4-2 und 5-2 zu WTP.
      2. Übertragen Sie die Filtrationsplatte zusammen mit der Kollektorplatte aus dem CP 2-1 und 2-2 4-3 und 5-3 zu WTP. Den Hauptkultur DWP 1-1 und 1-2 aus der Zentrifuge 4-4 und 5-4 zu WTP.
      3. Bereiten Sie die Analysemodule.
         Hinweis: Nehmen Sie 200 ul-Tipps von der Spitze Lagerung (Position 2-1 bis 2-4). Um Verbrauchsmaterialien zu reduzieren, verwenden die gleiche Spitze-Set für Schritt 1.4.3.1.
         1. Übertragung von 180 & mgr; l der Hauptkulturüberstand auf die Filtrationsplatte. Absaugen 150 & mgr; l aus dem Hauptkulturüberstand und verzichtet werden 50 & mgr; l in die MTP für die Fällung vor der Filtration und 100 & mgr; l auf den pH-Indikator Platte.
            Hinweis: Der pH-Wert-Bestimmung nicht wesentlich ist; jedoch nach der Zugabe von 12,5 ml Methylrot-Indikator (50 mg in 50 ml Ethanol) in jeder Vertiefung mit einem mehrstufigen Pipette zeigt es hohe Säure produzierenden Stämmen. Diese Information kann hilfreich sein , die Wachstumshemmung zu vermeiden (bei ​​niedrigem pH - Wert) für weitere Züchtungen, zB für eine zweite Screening mit höheren Pufferkonzentration. Darüber hinaus kann niedrigem pH-Wert auch EPS Produktion, um die Zelle vor der sauren Umgebung zu schützen, zu induzieren.
         2. Wiederholen Sie Schritt 1.4.3.1 für die zweite Hauptkulturplatte. Verwenden Sie eine frische Spitze-Set.
         3. Verschieben Sie die Filterplatten in die Zentrifuge und entfernen Sie alle anderen Platten aus dem Werktisch zurück in ihre Ausgangspositionen in der carousel.
         4. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.2.1 bis 1.4.3.3 für das dritte und vierte Hauptkulturplatte.
         5. Nehmen Sie eine Kenntnis von diesen Fermentationsbrühen, die zeigen Sedimentation nach dem Zentrifugieren der wichtigsten Kulturplatten verringert wird, wenn sie wieder auf dem Karussell (Viskositätskontrolle) übertragen werden.
5. 96-Well - Filtration für komplette Zellentfernung (Aufgabe 2 in Abbildung 1)
   Hinweis: Um die Zellentnahme aus viskosen Fermentationsbrühe gewährleisten ein Filtrationsschritt im Screening enthalten ist.
   1. Zentrifugiere die Filtrationsplatten bei 3.000 xg für 10 min bei 20 ° C und bringt sie wieder in ihre Ausgangsposition Karussell.
   2. Bereiten Sie die Gel-Filtrationsplatten.
      1. Bewegen, um die äquilibrierte Gel-Filtrationsplatten von dem Karussell zur Zentrifuge und Schleudern bei 1000 xg für 2 min bei 20 ° C.
      2. Übertragen Sie die Gel-Filtrationsplatten aus der Zentrifuge zu WTP 4-1 bis 44.
      3. Bewegen Sie das frische Gel-filtration Kollektorplatten von CP (3-1 bis 3-4) zu WTP (5-1 bis 5-4).
      4. Übertragen Sie die äquilibrierte Gel-Filtrationsplatten (WTP 4-1 bis 4-4) an die frische Kollektorplatten (5-1 bis 5-4).
      5. Reinigen Sie den Werktisch außer Positionen 5-1 und 5-2 und bewegen Position 5-1 4-1 zu positionieren.
   3. Bereiten Sie den Arbeitstisch über den RM die Filtrate zu verarbeiten.
      Hinweis: Für die Schritte 1.5.3 Das System behandelt zwei Platten parallel zu 1.6.3.5 und wiederholt alle Schritte mit den nächsten zwei Platten.
      1. Bewegen Sie 50 ul-Tipps aus dem Karussell (4-6 und 4-7) auf WTP 3-3 und 3-4.
      2. Übertragen Sie die Filterplatten von CP 3-1 bis 3-2 auf dem Werktisch (4-4 und 5-4).
      3. Verlagern die DWP (1: 100 Verdünnung) für den Nachweis der Glukoseaufnahme aus dem CP 4-1 und 4-2 4-2 und 5-1 bis WTP.
      4. Bewegen Sie den MTP für die zweite Fällung nach der Filtration von CP 8-1 und 8-2 4-3 und 5-3 zu WTP.
      5. Heben Sie die Filterplatten von der Kollektorplattes (WTP 4-4 und 5-4) und sie zu WTP 3-1 und 3-2 zu bewegen.
   4. Bereiten Sie die Analysemodule nach der Filtration. Um Verbrauchsmaterialien zu reduzieren, verwenden die gleiche Spitze-Set für die Schritte 1.5.4.1 und 1.5.4.3.
      1. Bis zu 50 & mgr; l und Pipettenspitzen ein 10 ul Aliquot des Filtrats zur DWP (1: 100 Verdünnung) für die Glucose-Assay (Glucoseverbrauch).
      2. Pipette 35 ul des Filtrats auf die Mitte des äquilibrierten Gel-Filtrationsplatte und 50 & mgr; l auf die MTP, die für die Fällung eingesetzt wird.
      3. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.4.1 für die zweite Filterplatte zu 1.5.4.2.
      4. Verschieben Sie die Gel-Filterplatten in die Zentrifuge und bewegen sich alle anderen Platten aus dem Werktisch zurück zu den Ausgangspositionen im Karussell.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.3.1 für das dritte und vierte Filtrationsplatte zu 1.5.4.4.
      6. Nach der Lagerung aller Platten zurück in in dem Karussell zur Kenntnis zu nehmen hochviskose Stände, wie durch Rückstände in der Filterplatte angegeben (hohe viskosität Kontrolle nach dem Filtrationsschritt). Ein Mangel an Filtrat kann in den folgenden analytischen Module zu falsch negativen Ergebnissen führen.
6. Entfernen der Glucose über 96-Well - Gel-Filtration (Aufgabe 3 in Figur 1)
   1. Zentrifugieren der Gel-Filtrationsplatten bei 1000 xg für 2 min bei 20 ° C.
   2. Bereiten Sie den Arbeitstisch über den Roboter-Manipulator die Gel-Filtrate zu verarbeiten.
      1. Geben Sie 50 ul-Tipps aus dem Karussell (5-3 und 5-4) auf WTP 3-3 und 3-4.
      2. Für die Bestimmung der verbleibenden Glucose nach Gelfiltrationsexperimente bewegen zwei MTPs von CP 9-1 und 9-2 4-1 und 5-1 bis WTP.
      3. Für das Phenol-Schwefelsäure-Verfahren bewegen zwei MTPs von CP 8-5 und 8-6 4-2 und 5-2 zu WTP.
      4. Bringen Sie zwei Gel-Filtrationsplatten aus der Zentrifuge zu WTP (4-3 und 5-3).
      5. Heben Sie die Gel-Filtrationsplatten von der Kollektorplatte (4-3 und 5-3) und verschieben Sie sie 3-1 und 3-2 zu WTP.
   3. Bereiten Sie den Arbeitstisch über den Roboter-Manipulator die Gel-Filtrate zu verarbeiten.
      Hinweis: Um Verbrauchsmaterialien zu reduzieren, verwenden die gleiche Spitze-Set für die Schritte 1.6.3.1 und 1.6.3.2.
      1. Um die verbleibenden Glucose nach Gelfiltrationsexperimente (1:10 Verdünnung) nehmen 50 ul - Tipps und Transfer 25 ul ddH ₂ O (WTP 1-1) zu einem frischen MTP erkennen. Absaugen 20 ul ddH ₂ O (WTP 1-1), 5 l Luft und 5 ul Gel-Filtrat und verzichten in der gleichen Platte.
      2. Für die Phenol-Schwefelsäuremethode Pipette 20 ul Gel-Filtrat auf der MTP.
      3. Wiederholen Sie die Schritte 1.6.3.1 und 1.6.3.2 für das zweite Gel-Filtrat Platte.
      4. Übertragen Sie alle Platten aus dem Werktisch zurück zu den Ausgangspositionen in ihrem Karussell.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 1.6.2.1 bis 1.6.3.4 für das dritte und vierte Gel-Filtrationsplatte.
7. Glucose-Test-Module
   1. Bereiten Sie den Arbeitstisch über den Roboter-Manipulator die Glukose-as auszuführensagen.
      1. Stellen Sie den DWP (1: 100 Verdünnung) von CP 4-1 und 4-4 5-1 und 5-4 zu WTP.
      2. Verschieben Sie alle MTPs von CP 9-5 und 9-8 4-1 und 4-4 zu WTP.
      3. Nehmen Sie 200 ul-Tipps und die Verdünnung mischen durch Ansaugen und Abgeben von zehnfache Volumen von 180 ul. Dann Pipette ein 50-ul-Aliquot auf die MTP.
      4. Wiederholen Sie die Schritte 1.7.1.2 und 1.7.1.3 für alle vier DWPs (1: 100 Verdünnung).
      5. Entfernen Sie alle DWPs (5-1 bis 5-4) aus dem Werktisch.
   2. Bereiten Sie den Arbeitstisch die Glukose-Test zu starten.
      1. Für die Bestimmung der verbleibenden Glucose nach Gelfiltration Übertragung alle MTPs von CP (9-1 bis 9-4) zu WTP (5-1 bis 5-4).
      2. Bewegen Sie den Glukose-Test Kalibrierungsplatte - mit drei mal 50 & mgr; l der folgenden Glucose-Konzentrationen (90, 45, 18, 9, 4.5, 1.8, 0.9, 0.45 und 0 mg / L) - von CP 09.09 3- bis WTP 3.
      3. Nehmen Sie 200 ul Tipps und absaugen 50 ul Glucose-Assay-Reagenz-Mischung aus WTP 1-2, um den ersten Test zu starten. Bewege die MTPs in den Inkubator (30 ° C bei 150 Upm für 30 min).
      4. Stellen Sie den Zeitplan, das Programm mit 5 min Verzögerung zwischen den Platten zu starten.
      5. Nach 30 min Inkubation bewegen die Platten aus dem Inkubator zu dem MTP-Leser und Aufzeichnung der Absorption bei 418 und 480 nm.
      6. Nach der Messung in dem Karussell um die Platten in ihre Ausgangsposition bewegen.
8. Herstellung der Fällungs
   Hinweis: Um die EPS-Produktion führen eine Fällung des Überstandes mit 2-Propanol vor und nach dem ersten Filtrationsschritt zu beurteilen. Darüber hinaus beurteilt der Adsorption des Polymers auf der Filtermembran durch Beobachtung von Fasern und Flocken in dem ersten, aber nicht in dem zweiten Niederschlag.
   Achtung: Griff 2-Propanol als brennbare Flüssigkeit streng unter einer Abzugshaube.
   1. Entfernen Sie alle Fällungsplatten (CP 6-1 bis 6-4 und 8-1 bis 8-4) aus dem Karussell. und fügenmanuell 150 & mgr; l 2-Propanol zu jedem Well mit einer 12,5 ml mehrstufiges Pipette.
   2. Decken Sie alle MTPs mit einer Silikonkappe Matte und schütteln bei Raumtemperatur (RT) (10 min bei 900 Umdrehungen pro Minute). beobachten Optisch Faser oder Flocke Formationen nach dem Schütteln, die EPS-Produktion zeigen.
9. Phenol-Schwefelsäure-Methode
   Vorsicht: Behandeln Sie konzentrierte Schwefelsäure-und Phenol unter einer Abzugshaube. Phenol ist ein ätzender und mutagenen Mittel.
   1. Für das Phenol-Schwefelsäure-Verfahren, entfernen Sie die Platten (CP 8-5 bis 8-8) aus dem Karussell und legen Sie sie in das Liquid-Handling-System (Position 4 bis 8). Fügen Sie die Kalibrierungsplatte mit 20 ul verschiedener Glukosekonzentrationen (10; 5; 2,5; 1; 0,5; 0,25; 0,1; 0,05; 0 g / L) in dreifacher Ausführung.
   2. Stellen Sie einen Abfallbehälter an der Position 1, eine 200 ul Spitze Feld an Position 2 und eine 250 - ml - Mulde mit 110 ml Phenol-Schwefelsäure-Säure (frisch zubereitet auf Eis with18.3 ml Phenol 5% (w / v) in ddH ₂ O und 91,7 ml konz. sulfuric Säure) an Position 3.
   3. Verwenden Sie einen 8-Kanal-Pipette mit 300 & mgr; l-Tipps und Transfer 180 ul Phenol-Schwefelsäure-Säure in jeder Reihe aller Platten.
   4. Decken Sie alle MTPs mit Deckel, mischen sie durch Schütteln (5 min bei 900 Umdrehungen pro Minute, RT) und inkubieren für 35 min bei 80 ° C in einem Ofen für die Farbreaktion. Nach dem Abkühlen unter einer Abzugshaube nach unten, der Extinktion bei 480 nm messen.
10. Auswahl von EPS Positive Überstände (Aufgabe 4 in Abbildung 1)
    1. Für die Auswertung der EPS-Produktion, wählen diese Stämme aus dem automatisierten Screening, die mindestens zwei der drei Kriterien als positive (Viskositätskontrolle 2.6.1 und 2.6.2, 2.6.3 Nachweis von Polymer, Glucose äquivalent 2.6.5) erfüllen. Übertragen Sie die restlichen Filtrate von den positiven Treffern zu einem neuen MTP für die weitere Verarbeitung.
       Hinweis: Wenn die Platten mit einer Aluminiumversiegelungsfolie abgedeckt werden, können sie für mindestens eine Woche bei -20 ° C gelagert werden. Innerhalb dieser Zeit die Determination des Kohlenhydrat Fingerabdrucks durchgeführt werden muss.

2. Carbohydrate Fingerabdruck

Hinweis: Alle Schritte für die Kohlenhydrat-Fingerabdrucks werden manuell durchgeführt.

1. Gel-Filtration des Positive Überstände (Aufgabe 5 in Figur 1)
   Hinweis: Gel-Filtration notwendig ist, da kein Filtrat aus dem automatisierten Screening gelassen ist. Gel-Filtration mit einem Volumen von mehr als 35 & mgr; l führt zu einer verringerten Reinigungsleistung.
   1. Bereiten Sie ein Abgleichen der Gel-Filtrationsplatten durch Abgabe 150 ul Ammoniumacetatpuffer in alle Vertiefungen über einen 12,5 ml mehrstufiges Pipette.
   2. Übertragen, um das Gel-Filtrationsplatte in die Zentrifuge (2.000 × g für 2 min bei 20 ° C).
   3. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1, 2.1.2 und 2.1.1 wieder. Zentrifugieren Sie die Gel-Filtrationsplatte bei 1000 × g für 2 min bei 20 ° C vor der weiteren Verwendung.
   4. Pipette 35 ul Filtrat indas Zentrum der Gel-Filtrationsplatte mit einem 12-Kanal 50 ul-Pipette.
   5. Zentrifugieren Sie die Gel-Filtrationsplatte bei 1000 × g für 2 min bei 20 ° C und dann heben sie sich von der Kollektorplatte.
   6. Bereiten Sie die Glukose-Test vor der Hydrolyse: Führen Sie eine 1:10 Verdünnung durch Zugabe von 45 & mgr; l ddH ₂ O und 5 ul Gel-Filtrat mit einem 12-Kanal 50 ul Pipette und decken die MTPs mit einer Silikonkappe Matte.
      Hinweis: Für die korrekte Bestimmung der Glukosewert des Polymers, messen Sie den Glucosegehalt vor der Hydrolyse und subtrahieren sie von der Glucosegehalt nach dem Hydrolyseschritt quantifiziert.
   7. Bereiten Sie die Pyruvat-Test vor der Hydrolyse: Führen Sie eine Verdünnung von 1:20 mit einem 12-Kanal 200 ul Pipette 95 ul ddH ₂ O, Transfer 5 ul Gel-Filtrat hinzufügen zu jedem Loch und versiegeln Sie die MTP mit einer Silikonkappe Matte .
2. 96-Well - Mikro Hydrolyse (Aufgabe 6 in Abbildung 1)
   Hinweis: aufheizendie Inkubation Ofen (einschließlich einem Sandbad) bis 121 ° C für mindestens 1,5 Stunden vor dem Gebrauch. Es wurde eine spezielle Spannvorrichtung Verdunstung während der kleinen skalierten Hydrolyseschritt zu vermeiden, entwickelt.
   1. Nehmen Sie eine neue PCR-Platte und Transfer 20 ul Gel-Filtrat mit einem 12-Kanal 50 ul Pipette.
      Achtung: Trifluoroacetic Säure ist eine ätzende Säure und toxisch. Ammonium-Lösung ist ätzend. Behandeln Sie beide Chemikalien nur unter einer Abzugshaube.
   2. Geben Sie 20 ul 4 M Trifluoressigsäure mit 1,25 ml mehrstufiges Pipette in jede Vertiefung. Dann decken Sie die PCR-Platte mit einem thermoplastischen Elastomer (TPE) Kappe Matte und legen Sie die PCR-Platte in der speziellen Spannvorrichtung.
   3. Mischen Sie die Lösungen über Invertierung der Klemmvorrichtung zehnmal. Setzen Sie die PCR-Platte in einer Zentrifuge und Schleudern bei 2000 xg für 2 Minuten auf dem Boden die gesamte Flüssigkeit zu sammeln. Setzen Sie die PCR-Platte zurück in die Spannvorrichtung und befestigen Sie das Gerät mit Schrauben.
   4. Setze dasgesicherten Klemmvorrichtung in dem Sandbad vorgewärmt und für 90 min bei 121 ° C inkubieren.
   5. Entfernen Sie die Klemmvorrichtung aus dem Sandbad und lassen Sie es auf RT abkühlen.
   6. Die Schrauben und Spin wieder in einer Zentrifuge bei 2000 × g für 2 min, um all das Kondensat am Boden der Vertiefungen zu sammeln und eine Kreuzkontamination während der Entfernung der Kappe Matte zu verhindern.
   7. Hinzufügen, 3,2% Ammoniaklösung zur Einstellung des pH auf ca. 8 mit einem 12-Kanal 200 ul Pipette. Decken Sie die PCR-Platte mit einer TPE Kappe Matte und schütteln Sie sie manuell die Klemmvorrichtung.
   8. Nach dem Neutralisieren Zentrifuge bei 2000 × g für 2 min, um die PCR-Platte.
3. Hochdurchsatz-1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolon (HT-PMP) -derivatization der Kohlenhydrate (Aufgabe 7 in Figur 1)
   1. Transfer 25 ul des neutralisierten Hydrolysat in einer frischen PCR-Platte mit einem 12-Kanal 50 ul Pipette.
      Hinweis: Nach dem aliquoten, überprüfen Sie die Neutrlisierung der verbleibenden Flüssigkeit in der Hydrolyse Platte 12,5 ul Phenolrot-Indikator über die Zugabe (0,05 g Phenolrot in 5 ml 20% Ethanol) mit einem 1,25 ml mehrstufiges Pipette. Alle Vertiefungen, die sich nicht drehen in rosa Farbe (pH 8) nicht korrekt derivatisiert.
   2. In 75 ul Derivatisierungsreagenzes-Mischung (125 mg PMP, 7 ml Methanol, 3,06 ml ddH ₂ O und 438 ul 3,2% Ammoniumlösung) und die Platte abgedeckt mit einer TPE Kappe Matte.
   3. Nach dem Schütteln der Platte bei 2.000 xg die PCR-Platte in der Klemmvorrichtung Zentrifuge für 2 min die gesamte Flüssigkeit am Boden zu sammeln.
   4. Für Derivatisierung Ort der PCR-Platte in einer PCR-Cycler bei 70 ° C für 100 min, gefolgt von Abkühlen auf 20 ° C nach unten.
   5. Die Übertragung eines 20-ul-Aliquot in eine neue MTP einen 12-Kanal 50 ul Pipette. Dann mit einem 12-Kanal 200 ul Pipette und fügen 130 ul 19,23 mM Essigsäure (0,962 ml 1 M Essigsäure + 49,038 ml ddH ₂ O) zu jeder Zeile. Mischen Sie direkt über aspirating und (mindestens sechsmal) und übertragen die gesamte Flüssigkeit auf eine 0,2 & mgr; m Filterplatte mit einem MTP-Kollektorplatte zu verzichten.
   6. Zentrifugieren Sie die Platte (1000 × g für 5 min), entfernen Sie die Filterplatte, versiegeln Sie die MTP mit einer Silikonkappe Matte und legen Sie die MTP in die UHPLC-UV-ESI-MS zur Bestimmung des Kohlenhydrat Fingerabdruck ^14.
4. Herstellung des Glucose-Assay
   1. Führen Sie eine Verdünnung von 1:10 über das Hinzufügen 45 & mgr; l ddH ₂ O und 5 ul neutralisierten Hydrolysat einen 12-Kanal 50 ul - Pipette und die MTPs mit einer Silikonkappe Matte abzudecken. Hinzufügen dreimal 50 ul verschiedener Glukosestandards (500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2,5 und 0 & mgr; M) in eine neue MTP für die Kalibrierung verwendet.
   2. In 50 ul Glucose-Assay-Reagenz-Mischung (Rezept step1.2.3) mit einem 12-Kanal 50 ul Pipette. Dann decken Sie die Platten mit einer Silikonkappe Matte und Inkubation bei 30 ° C und 400 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten in einem MTP-Inkubator.
5. Herstellung des Pyruvat-assay
   1. Führen Sie eine Verdünnung von 1:20 eine 12-Kanal 200 ul Pipette. Hinzufügen , 95 & mgr; l ddH ₂ O und Transfer 5 & mgr; l neutralisiertes Hydrolysat zu jeder Vertiefung. Decken Sie die MTP mit einer Silikonkappe Matte.
   2. Füge 100 & mgr; l Pyruvat-Assay - Reagenz-Mischung (3 ml 1 mM N - (Carboxymethylamino-carbonyl) -4.4'-bis (dimethylamino) -diphenylamin - Natriumsalz (DA-64), 300 ul 10 mM Thiaminpyrophosphat, 60 ul 100 mM Magnesiumchlorid - Hexahydrat, 2,4 ml 500 mM Kaliumphosphat - puffer (pH 5,7), 30 & mgr; l 100 U Pyruvatoxidase, 12 ul 1.000 U Meerrettichperoxidase und 24.19 ml ddH ₂ O) , um eine 12-Kanal 200 ul Pipette.
   3. Decken Sie die Platten mit einer Silikonkappe Matte einnd inkubieren bei 37 ° C und 150 Upm für 30 min. Direkt nach der Inkubation messen Absorption in einem MTP-Reader bei 727 und 540 nm.
6. Auswertung aller Ergebnisse der automatisierten Screening und der Kohlenhydrat-Fingerabdrücken.
   1. Beachten Sie die Proben, die Sedimentation verringert zeigen, nachdem die Hauptkulturplatten zentrifugiert wurden, und zurück zu dem Karussell (Viskositätssteuerungsschritt 1.4.1) gespeichert. Die Proben, die nicht Pelletbildung zeigen positive (Kriterium 1 für die automatisierte Screening).
   2. Beachten Sie hochviskose Überstände, die durch Rückstände in der Filterplatte nach dem Filtrationsschritt (hochviskos Steuerschritt 1.5.4.6) angegeben sind. Ein Mangel an Filtrat kann in den folgenden analytischen Module zu einem falsch negativen Ergebnis führen. Proben, die Kulturüberstand in den Filterbrunnen sind positiv (auch 1 Kriterium für die automatisierte Screening) aufrechtzuerhalten.
   3. Optisch beobachten nach Inkubation Faser oder Flocke Bildung. Machen Sie sich Notizen als thist, zeigt Polysaccharide. Bewertung noch keine Fällung mit (-); geringe Niederschläge von Fasern oder Flocken mit (+) und hohe Niederschläge mit (++). Weiterhin detektieren die Adsorption des Polymers auf der Filtermembran durch Beobachtung von Fasern und Flocken in dem ersten, aber nicht in der zweiten Ausfällung (2-Kriterium für das automatisierte Screening).
   4. Durchführen einer linearen Kalibrierung für die Berechnung der Glucosekonzentration.
      
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   5. Führen Sie die lineare Kalibrierung (Absorption über Konzentration) zwischen 5 und 0,1 g / l Glukose. Die Berechnung der Glucoseäquivalent der hydrolysierten Polymere und zu bewerten durch folgende Parameter: Glukose-Äquivalent:> 700 mg / L = positiv; 300-700 mg / L = mutmaßliche positiv; <300 mg / l = negativ in Bezug von EPS-FormatIon (Kriterium 3 für die automatisierte Screening).
      
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   6. Quantifizieren alle bestimmt Kohlenhydrate mit dem HT-PMP-Methode. Addiere alle Mengen und zu bewerten, wie folgt:> 300 mg / l (positiv); 150-300 mg / L (vermeintlichen positiv) und <150 mg / l (negativ).
   7. Für die Berechnung der Pyruvat-Konzentration führen eine lineare Kalibrierung (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5 und 0 & mgr; M). Um die verbleibenden Pyruvat im Überstand auszuschließen, korrigieren Sie die Pyruvat-Gehalt nach der Hydrolyse über die Pyruvat-Gehalt vor der Hydrolyse.
      
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Ergebnisse

Die Validierung des Phenol-Schwefelsäure-Verfahren zeigten gute Ergebnisse mit einem Bestimmungskoeffizienten (r²) von 0,9998 (Tabelle 2). Für die 5 g / L Konzentration der Variationskoeffizient (CV) und der Genauigkeit zeigten eine gute Leistung mit 1,8% und 2,2% Fehler, aber geringere Leistung für die 0,25 g / l Standard mit 5,3% (CV) und 6,1% Fehler ( Vorspannen).

Die Koeffizienten der Bestimmung beider Pyruvat-assay Kalibrierungskurven (mit und ohne Matrix) waren> 0,9999 in einem Kalibrierungsbereich von 150 & mgr; M (Tabelle 3). Die Variationskoeffizienten (CV) für den höchsten und den niedrigsten Kalibrierpegel waren <4,6% und die Genauigkeit zeigte eine sehr gute Leistung über den gesamten Kalibrierungsbereich mit weniger als 3,9% Fehler. Somit zeigte die Matrix aus der Hydrolysestufe keinen Einfluß auf die enzymatische Assays, die daher zu meas Lage ist,ure Pyruvat vor und nach der Hydrolyse.

Tabelle 4 zeigt die detaillierten Ergebnisse von drei beispielhaften neuen Stämme als erfolgreich mit der Screening - Plattform identifiziert. Der linke Teil der Tabelle zeigt die Ergebnisse der automatisierten Screening-Module in Bezug auf Viskosität Bildung, Polymerproduktion und die Glucoseäquivalent von der gesamten Hydrolyse, die als Bewertungsparameter für detaillierte Kohlenhydrat Fingerabdruckanalyse verwendet wurden. Der Kohlenhydrat Fingerabdruck auf kalibrierte Zucker basieren sowie unbekannten Zucker, Dimere und Substituenten werden im rechten Teil der Tabelle zu entnehmen. Durch die Nutzung dieser Informationen können die monomeren Zusammensetzung berechnet und mit bereits bekannten Polymerstrukturen verglichen werden. Darüber hinaus kann ein gezieltes Screening für interessante Monomerzusammensetzungen und seltene Kohlenhydrate durchgeführt werden.

Die hohe Leistung des MikroMaßstab Hydrolyse und die HT-PMP-Derivatisierung wurden in unserer bisherigen Arbeit ¹⁴ demonstriert. Darüber hinaus haben die Validierung der Gelfiltrationsexperimente und dem Kohlenhydrat Fingerabdruck für verschiedene Gattungen wurden in einer anderen Publikation ⁶ beschrieben. In der Summe kann die Screening-Plattform durch ihren modularen Aufbau leicht modifiziert und an die individuellen Bedürfnisse des Anwenders angepasst werden. Die automatisierte Screening der Plattform ermöglicht eine achtmal höhere Durchsatz und gibt zuverlässige Ergebnisse. Neue analytische Module wie das Pyruvat-Test kann und mit dem Kohlenhydrat Fingerabdruckanalyse bieten sie sehr detaillierte Informationen über die identifizierten EPS in Kombination integriert werden. Dabei ist die Screening-Plattform wichtig, wenn für beide leicht modifiziert und völlig neue EPS-Varianten zu suchen.

Abbildung 1: Gesamtschema des modularen high-Durchsatz Exopolysaccharidmaterial Screening - Plattform. Die automatisierte Screening umfasst die ersten drei Aufgaben. Nachdem Bakterien in 96-Well-Platten kultiviert werden, werden die Zellen durch Zentrifugation (Aufgabe 1) und einer 96-well Filtration (Aufgabe 2) entfernt wird. Dann werden die restlichen monomeren Zuckern aus dem Wachstumsmedium über eine 96-Well-Gelfiltration (Aufgabe 3) entfernt wird. Die EPS-haltigen Proben werden in Aufgabe bewertet 4. Der Kohlenhydrat Fingerabdruck der Screening-Plattform enthält die letzten drei Aufgaben. Das verbleibende Filtrat der positiven Treffer von Aufgabe 2 bildet die Grundlage für das Gel-Filtrat in Aufgabe 5. Nach hydrolyzation in Aufgabe 6 das Kohlenhydrat Fingerabdruck kann über die HT-PMP-Verfahren (High-Throughput-1-Phenyl-3-methyl analysiert werden -5-pyrazolon, Aufgabe 7). Alle Aufgaben werden durch verschiedene analytische Module und / oder eine Viskositätskontrolle gefolgt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Roboterarbeitstisch Setup für die Screening - Plattform Layouts der beiden Flüssigkeitshandhabungsroboter Arbeitstische gezeigt. (A) Roboter - Liquid - Handling - System und (B) Liquid - Handling - Station. (A) Der Aufbau besteht aus einem Mikroträger mit zwei Positionen (Positionen 1-1 bis 1-2), ein Träger für Einwegspitzen mit vier Positionen (Positionen 2-1 bis 2-4) und drei Mikroträger mit vier Positionen jeweils (Positionen 3-1 bis 3-4, 4-1 bis 4-4 und 5-1 bis 5-4). Darüber hinaus gibt es ein Speicherkarussell mit fünf Hotelträger (1 bis 5), die jeweils sieben tiefen Well-Platten (DWP) und vier Hotelträger (6-9), die jeweils 21 Mikro Titer-Platten. Die Hardware, auf der Liquid-Handling-Roboter installiert ist ein 96-Kanal-Pipette-Arm für die Verwendung mit Einwegspitzen und einem Roboter-Manipulator (RM), die Platten / Ausrüstung bewegt between der Arbeitstisch, der Speicherkarussell, das MTP-Reader, die Zentrifuge und das Schütteln-Inkubator. (B) Die Liquid - Handling - Station ist mit einem Liquid - Handling - Arm ausgestattet und ein 8-Kanal 300 ul Pipette, einen Abfallbehälter an der Position 1, ein Spitzenadapter mit 300 ul Spitzen (Position 2), einen Höhenadapter 30 mit einem 250 ml Trog (Position 3) und fünf Höhenadapter 60 für MTPs (Position 4 bis 8). Die Nummerierung der Positionen wird in diesem Protokoll bezeichnet. Alternative Arbeitstische können auch verwendet werden , wenn gleichwertige Setups zur Verfügung stehen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Pyruvat - Gehalt von 16 im Handel erhältlichen Polymeren via Pyruvat-Assay bestimmt. Nach dem 1 g / l Polymerlösungs wurden hydrolysiert und neutralisiert, das Pyruvat-Assay in einer Verdünnung von 1:10 durchgeführt wurde (n = 3). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Ablaufdiagramm des modularen Hochdurchsatz - Screening - Plattform. Das automatisierte Screening-System, das verschiedene Polysaccharid Detektionsmodule kombiniert: Analyse der Viskosität Bildung, Polymerproduktion und die Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehalts. Der zweite Teil enthält eine detaillierte Monosaccharid-Analyse für alle ausgewählten EPS Produzenten im ersten Teil identifiziert. Alle Daten aus dem automatisierten Screening und die Daten aus dem Kohlenhydrat-Fingerabdrucks über UHPLC-ESI-MS sind in einer Datenbank und ermöglichen die einfache Identifizierung von strukturell verwandte Varianten des alr gesammelteneady bekannt EPS oder neuartige EPS und daher ein gezieltes Screening. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Haupt Schritt / Analytik - Modul	Arbeitsablauf	Beobachtung / Beschreibung
Die Kultivierung der Stämme	1 ml EPS-Medium ein Vorkultur 48 h, 30 ° C, 1000 rpm a Main-Kultur 48 h, 30 ° C, 1000 Umdrehungen pro Minute ein	Herstellung von EPS
Zellentfernung / Viskosität	Zentrifugation: 30 min bei 4.300 xg	Kein Pellet = erhöhte Viskosität = positiv
Der Nachweis von Polymer: Precipitation	50 & mgr; l supernatant + 150 & mgr; l 2-Propanol b Schütteln 10 min bei RT und 900 Umdrehungen pro Minute b	Visuelle: Fasern und Flocken = positive Ausfällung von Polymer
Zellentfernung / hoher Viskosität	180 & mgr; l Überstand der Hauptkultur Zentrifugation: 10 min bei 3000 xg 1,0 & mgr; m Glasfasermembran	Kein Filter passieren = hohe Viskosität = positiv
Der Nachweis von Polymer: Precipitation	50 & mgr; l Filtrat + 150 & mgr; l 2-Propanol b Schütteln 10 min bei RT und 900 Umdrehungen pro Minute b	Visuelle: Fasern und Flocken = positive Ausfällung von Polymer
Glukoseverbrauch: Glucose-Assay	Verdünnung 1: 100: 10 & mgr; l Filtrat + 990 & mgr; l ddH 2 O 50 ul aliquote + 50 & mgr; l REAGent-Mix Inkubation 30 min bei 30 ° C 150 Upm Messung 418-480 nm	Restzucker nach der Kultivierung
Gel-Filtration	Equilibrierung: 3 x 150 ul NH 4 -acetat - Puffer pH 5,6 2 x 2 min bei 2000 · g 1 x 2 min bei 1000 · g Gel-Filtration: 35 & mgr; l Filtrat, 2 min bei 1000 × g Waschen: 3 x 150 & mgr; l ddH 2 O, 2 min bei 2000 xg 75 & mgr; l 20% Ethanol zur Lagerung	Polymer Reinigung: Entfernung von Salzen, Pyruvat, Glucose und andere Zucker-Monomere aus dem Anbau Überstand
Restzucker nach Gelfiltrationsexperimente Glucose-Assay	Dilution 01.10: 25 & mgr; l ddH 2 O + 20 & mgr; l ddH 2 O und 5 & mgr; l Filtrat + 50 & mgr; l Reagenz-mix Messung 418-480 nm	Subtrahieren der verbleibenden Glucose nach Gelfiltration von dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren
Glucose-Äquivalent: Phenol-Schwefelsäure-Methode c	20 & mgr; l Gel-Filtrat + 180 ul Phenol-Schwefelsäure-Säure (30 & mgr; l 5% (w / v) Phenol in ddH 2 O + 150 & mgr; l konz. H 2 SO 4 (ρ = 1,84 g / ml)) Schütteln 5 min bei 900 Umdrehungen pro Minute Inkubation 35 min bei 80 ° C Messung bei 480 nm	Glucose-Äquivalent: Δ (Phenol-Schwefelsäure-Wert - Restzucker nach Gel-Filtration) <300 mg / L negativen > 300 und <700 mg / l mutmaßliche positive > 700 mg / L positiv
ein manuell bearbeiteter unter sterilen Bedingungen (Laminar Flow).
b Brennbare Flüssigkeit manuell unter einer Abzugshaube behandelt.
c Phenol-Schwefelsäure-behandelt mit Brand Liquid Handling Station (LHS) unter einer Abzugshaube.

Tabelle 1:. Kompletten Workflow des automatisierten Vorschaltung mit dem Roboter - Liquid - Handling - System und dem Liquid - Handling - Station Übersicht aller Parameter für die automatisierten Analysemodule.

Linearität			LOD	LOQ
r² a	Slope ein	Offset ein	mg / L	mg / L
0,9998	0,0007	-0,021	50	100
Standard		Mittlere b	Präzisions - b	Genauigkeit b
mg / L		mg / L	LEBENSLAUF%	Bias (% Fehler)
5000		5112	1.8	2.2
250		265	5.3	6.1
ein Mittelwert von acht Messungen, Kalibrierung mit sechs Ebenen Glucose 0,1-5 g / L
b Ausgeführt mit einem Studenten-t-Test (α = 0,05; n = 8).
LOD: Bestimmungsgrenze, LOQ: Quantifizierungsgrenze, CV: Variationskoeffizient.

Tabelle 2:Validierung des Phenol-Schwefelsäure-Verfahren wurde mit der Flüssigkeitshandhabungsstation durchgeführt. Die Linearität wurde berechnet auf der Basis eines Sechspunktkalibrierung (n = 8). Mittel, Präzision und Genauigkeit von zwei beispielhaft gewählt Glucosekonzentrationen werden hier angegeben.

	Linearität			LOQ
	r² a	Slope ein	Offset ein	uM
ohne Matrix	0.99999	0,0223	-0,0019	1
1:10 Matrix	0.99999	0,0221	-0,0011	1
	Standard	Mittlere b	Präzisions - b	Genauigkeit b
	uM	uM	LEBENSLAUF%	Bias (% Fehler)
ohne Matrix	50	49,96	3.05	-0,09
	1	1.04	2.95	3,86
1:10 Matrix	50	49,98	0,44	-0,04
	1	100	4.58	0,33
ein Mittelwert von drei Messungen, Kalibrierung mit sechs Konzentrationen an Pyruvat 1-50 uM.
b (n = 3)
LOQ: Quantifizierungsgrenze, CV: Variationskoeffizient.

Tabelle 3:. Die Validierung des Pyruvat-Test mit und ohne 1:10 neutralisiert Trifluoressigsäure-Säure-Matrix Zwei sechs Punktkalibrierung (n = 3) mit und ohne Auswertung der Matrix Einflüsse durchgeführt. Mittel, Präzision und Genauigkeit von zwei beispielhaft gewählt Pyruvat-Konzentrationen mit und ohne Auswirkungen einer 1:10 Verdünnung wurden berechnet.

Tabelle 4:.. Die Ergebnisse von drei beispielhaften mit der Plattform gescreent Stämme Die gesammelten Daten aus dem automatisierten Screening und dem Kohlenhydrat Fingerabdruck Bitte chier lecken Sie diese Tabelle als Microsoft Excel-Datei zum Download bereit.

Kohlenhydrat	Absorption max [nm]	Absorption bei 480 nm Mittelwert ± Standardabweichung		Absorbanz relativ zu Glucose [%]
Diutan gum	470	0,342	± 0,010	187
Gellangummi	472	0,334	± 0,002	183
Guarkernmehl	478	0,387	± 0,017	212
Gummi arabicum	476	0,393	± 0,034	215
Hyaluronsäure	484	0,231	± 0,011	126
Karayagummi	478	0,455	± 0,023	249
Konjakgummi	480	0,297	± 0,009	163
Larch gum	480	0,337	± 0,032	185
Johannisbrotgummi	478	0,354	± 0,033	194
Scleroglucan	484	0,168	± 0.010	92
Succinoglycans	482	0,168	± 0,005	92
Tara gum	480	0,318	± 0,016	174
Tragant	478	0,513	± 0,003	281
Welangummi	472	0,226	± 0,016	124
Xylan	0,567	± 0,007	311
Xanthan Gum	482	0,245	± 0,021	134
Glucose	484	0,191	± 0,014	100
SD: Standardabweichung

472

Tabelle 5:. Die Ergebnisse , wie durch das Phenol-Schwefelsäure-Verfahren für 16 handelsübliche Polymere und Glucose erhalten Das Absorptionsmaximum und die Absorption bei 480 nm von 16 im Handel erhältlichen Polymeren (1 g / l) sowie Glucose (1 g / L ) wurden Aufbringen der Phenol-Schwefelsäure-Verfahren gemessen. Die Extinktion relativ zu Glucose aller Polymere wurde berechnet.

	Standard	Bedeuten	Precision ein	Genauigkeit a
	mg / L	mg / L	LEBENSLAUF%	Bias (% Fehler)
1:10 Verdünnung	450	460	1.01	2.14
	45	44.7	1,41	-0,70
1: 100 Verdünnung	4500	5026	1.19	11.6
	450	471	1.16	4.55
b Ausgeführt mit einem Studenten-t-Test (α = 0,05; n = 8).
CV: Variationskoeffizient.

Tabelle 6:. Validation des automatisierten Verdünnung für die Glucose-Assay Die Verdünnung für die Glucose-Assay nach der Kultivierung (1: 100) , und nach der Gelfiltration (1:10) wurden validiert. Zwei Glucosekonzentrationen (n = 8) wurden über die Flüssigkeitshandhabungssystem und bewertet verdünnt. Mittel, Präzision und Genauigkeit berechnet.

Theoretische Zuckerwert	Bedeckt mit Silikonkappe Matte			Test von Verdampfung (offene)
	bedeuten , dass ein	Precision ein	Genauigkeit a	bedeuten , dass ein	Precision ein	Genauigkeit a </ Strong>	Verdunstung
mg / L	mg / L	LEBENSLAUF %	Bias (% Fehler)	mg / L	LEBENSLAUF %	Bias (% Fehler)

<>

Diskussion

Polysaccharids Detektion mit dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren: Verschiedene Monosaccharide zeigen unterschiedliche Absorptionsmaxima und molare Extinktionskoeffizienten durch Anwendung dieser Methode ^9. Daraus ergeben sich unterschiedliche Absorptionsmaxima von Polymeren, die in unterschiedlichen Mengen mehrerer Zucker enthalten. Die verschiedenen Wellenlängen der Absorptionsmaxima für 16 verschiedene handelsübliche Polymere sind in Tabelle 5 angegeben. Die Polymere gelöst (1 g / L) in ddH ₂ O, gerührt (150 rpm) über Nacht und mit dem Phenol-Schwefelsäureverfahren gemessen . Diutan Gummi zeigte die niedrigsten Absorptionsmaxima bei 470 nm und Scleroglucan und Hyaluronsäure höchsten bei 484 nm. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde 480 nm für diese Screening-Plattform entschieden. Die relative Absorption der Polymere wurde auf der Basis der Absorption mit 1 g / l Glucose (eingestellt als 100%) erhalten wurde, berechnet. Die niedrigsten Ergebnisse wurden mit Scleroglucan und Succinoglycans erhalten, beide mit 92%. Dies war expektiert weil Scleroglucan nur Glucose enthält und Succinoglycan enthält Glucose und Galactose in einem Verhältnis von 7: 1. Beide kommerziellen Polymere unterschiedliche Verluste der Trocknung und unterschiedliche Aschegehalte haben, ist dies der Grund, warum der theoretische Wert von ~ 110% wurde nicht erreicht. Xylan zeigte die höchste relative Absorption bei 311%. Der Grund dafür liegt in der hohen molaren Extinktionskoeffizienten von Xylose erreicht aufgrund der dominanten Furanose Form. In einer Menge von 0,1 g / l Glucose wurde die Bestimmungsgrenze erreicht hat, sowie die Nachweisgrenze in einer Konzentration <0,05 g / L. Jedoch ist die Nachweisgrenze für positive Spannungen in dem Screening von mehr als 0,7 g / L, und daher der Assay zeigte eine gute Leistung. Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, die verbleibende Glucose nach Gelfiltration wurde mit einem Glucose-Assay bestimmt und dieser Wert wurde aus dem Wert aus der Phenol-Schwefelsäure-Verfahren abgezogen.

Automatisierte Glucose-Assay Verdünnung: Die Leistungder Glucosebestimmung nach der Kultivierung (Verdünnung 1: 100) untersucht. Hierzu wurden 10 ul Überstand wurden auf 990 & mgr; l ddH ₂ O in einem tiefen Well - Platte überführt und über zehnmal gemischt Ansaugen und Abgeben von 180 & mgr; l aus dieser Verdünnung. Der zweite entscheidende Schritt war die richtige Pipettieren von nur 5 ul Aliquot für die Verdünnung von 1:10 aus der Glucose-Test nach Gel-Filtration. Um die Verdünnung 25 ul ddH ₂ O übertragen wurden mit einer 50 & mgr; l-Spitze zu erzeugen , wurden zusammen abgesaugt zuerst, danach 20 ul ddH ₂ O und 5 ul Gel-Filtrat. Dies gewährleistet eine bessere Entfernung der 5 ul-Aliquot aus der Spitze. Beide Verdünnungsschritte wurden mit verschiedenen Glukosestandards über einen Glucose-Assay überprüft. Die Ergebnisse für zwei beispielhafte Konzentrationen sind in Tabelle 6 gegeben , um die . 1: 100 - Verdünnung für die Bestimmung der Glucosegehalt nach der Kultivierung hoher Präzision für beide Standards mit einem CV & # zeigten60; 1,2%. Zur gleichen Zeit wird die Genauigkeit für die höheren Standard betrug bis zu 11,6 (% Fehler). Dies ist jedoch vernachlässigbar, da die Glukose-Bestimmung nur die verbleibenden Glucosegehalt nach der Kultivierung darstellt, und daher ist nicht wichtig für die Polymerdetektion. Die Verdünnung von 1:10 für die restliche Glucose nach Gel-Filtration zeigte eine sehr zuverlässige Ergebnisse mit einem CV <1,4% und einer Genauigkeit <2,1% Fehler.

Berücksichtigung der Verdampfung: Das Screening erfordert 3,5 Stunden aus dem ersten Schritt zu dem ersten glucose-Assays. Um zu erfahren, ob dieser Zeitrahmen einen Einfluss auf die nicht begrenzten MTP Lagerung hat, 50 ul Glucose-Test Kalibrierungsstandards wurden für 3,5 Stunden in der Roboter-Karussell mit und ohne Deckel gespeichert. Im Kalibrierungsbereich (45 bis 4,5 mg / l) die Probenkonzentration kaum erhöht. Eine Erhöhung - verursacht durch Verdunstung - lag unter 2,1% und nur für die beiden niedrigsten Konzentrationen (1,8 und 0,9 mg / l) erreichte bis zu 12,4% ( Tabelle 7).

Gel-Filtration: Hohe Mengen an nicht-metabolisierten Glucose stören die quantitative Bestimmung von Glukose aus dem hydrolysierten Polymer. Daher wurde eine Gel-Filtrationsschritt erforderlich, um die verbleibende Glucose nach der Kultivierung zu entfernen. Zudem reinigt die Gelfiltration des Polymers aus Salzen und monomeren Kohlenhydratverbindungen, andere als Glucose enthaltenden Überstand, die analytische Hintergrund in der Monomer-Analyse zu minimieren. Bei dem Gel-Filtrationsschritt 35 & mgr; l des Filtrats wurden in der Mitte des Bohrloches angeordnet. Zur Validierung der Robustheit der Gel-Filtration in dem automatisierten System acht Kalibrierstandards von 0,045 bis zu 9 g / l Glucose wurden filtriert (n = 8). Die Glucose jeder Konzentration wurde stets um mehr als 95% des Ausgangswertes (Tabelle 8) reduziert. so zeigte das Gel-Filtration sehr gute Ergebnisse für verschiedene Konzentrationen von Glucose zu tun. Zusätzlich kann die verbleibende Glucose nach Gel-ffast filtration wurde auch mit einem Glukoseassay und subtrahiert von dem Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung zu empfangen, die richtige Menge an Glucose-Äquivalent für das hydrolysierte Polymer bestimmt.

Pyruvat-assay: Erstens, wurde untersucht, ob die neutralisiert und verdünnt (1:10) TFA-Matrix aus dem Hydrolyseschritt mit der enzymatischen Reaktion stört. Daher wurde die vollständige Test zweimal durchgeführt, einmal mit und einmal ohne Matrix und zeigte zuverlässige Ergebnisse. Schließlich wurde die Pyruvat - Gehalt von 16 im Handel erhältlichen Polymeren erfolgreich gemessen und ist in Figur 3 dargestellt ist . Es ist allgemein bekannt , dass nur aus diesen Polymeren 16 Succinoglycan und Xanthan natürlich Pyruvat enthalten. Mit unserem Pyruvat-Assay beide dieser Polymere wurden korrekt identifiziert. In Scleroglucan, Welangummi und Xylan Pyruvat wurde auch in signifikanten Mengen nachgewiesen. Insgesamt wurde die Fähigkeit des Ansatzes validiert und das Pyruvat-Assay showed eine hohe Leistung. Es erwies sich als in der Lage sein Pyruvat in verschiedenen Polymeren nach der Hydrolyse zu detektieren.

Carbohydrate Fingerabdruck: Nach Durchführung aller analytischen Module im automatisierten Screening, potenzielle EPS Produzenten wurden für den Kohlenhydratfingerabdruckanalyse ausgewählt. Hierzu wurden mehrere Kriterien gelten: 1) Positive Beobachtung der Viskositäts nach Zentrifugation und / oder nach der Filtration. 2) Niederschlag vor und nach der Filtration. Beobachtete Fasern und Flocken wurden als positiv bewertet. 3) Glucose-Äquivalentwert aus dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren. Werte> 700 mg / l wurden als positiv und Werte zwischen 300 und 700 mg / l wurden als mutmaßliche EPS Produzenten bewertet bewertet. Wenn zwei oder drei Kriterien als positiv bewertet wurden, wurden die Stämme zur weiteren Kohlenhydrat Fingerabdruckanalyse ausgewählt. Die Kriterien können an den individuellen Zweck der EPS - Screening (zB niedrige Viskosität EPS) angepasst werden. Unser Ansatz bei der Suche nach effici Zielent EPS Produzenten. Wenn für die Stämme zu suchen, die nur geringe Mengen an EPS die Bewertungsgrenze des Glucoseäquivalent produzieren sollte reduziert werden.

Technische Nutzen und zukünftige Anwendungen: Ein interessantes Merkmal dieses Protokolls ist der modulare Charakter der Schritte und die verschiedenen Analysemodulen. Sie können auf verschiedene Weise kombiniert werden, angepasst auf die individuellen Anforderungen und neue Module leicht implementiert werden kann. Darüber hinaus können die Analysemodule separat verwendet werden, beispielsweise die Hydrolyse - Modul in Verbindung mit dem HT-PMP-Derivatisierung Modul kann eine monomere Zusammensetzungsanalyse von verschiedenen Polymerlösungen (1 g / l) in 96-Well - Format durchzuführen. Für Laboratorien, ohne die vollständige Abschirmung manuell Zugriff auf ein Flüssigkeitshandhabungssystem, ohne Änderungen in dem Pipettierschema gehandhabt werden kann. Jedoch ein Flüssigkeitshandhabungssystem erhöht den Durchsatz bis zu 768 Stämmen (anstelle von 192 Stämmen wenn Screened manuell) pro Tag. Das Protokoll , das hier beschrieben wird , ist in der Lage ein Screening für verschiedene Gattungen und daher für das Screening von großen Stammsammlungen neuartige EPS Hersteller zu identifizieren und deren Kohlenhydrat - Fingerabdrucks analysiert in einem Ansatz (Abbildung 4). Weiterhin ist ein gezieltes Screening für Polysaccharide mit seltenen Zucker wie Fucose, können Uronsäuren oder sogar unbekannte Zucker über die detaillierte Monosaccharid-Analyse durchgeführt werden. Außerdem können verschiedene Zuckerkombinationen in definierten Verhältnissen nachgewiesen werden. Dies ermöglicht die einfache Identifizierung von strukturell verwandten Varianten bereits bekannter EPS oder neuartige EPS.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
96 Well Deep-Well-Platte 2,0 ml (DWP)	Greiner Bio-One	780271	Hauptkultur (CP 1-1 bis 1-4), Äquilibrierungsplatten für die Gelfiltration (CP 1-6, 1-7, 2-6 und 2-7), 1:100 Verdünnung für den Glukose-Assay (CP 4-1 bis 4-4) mit 990  &Mikro; l aus ddH2O
Atmungsaktive Siegelfolie	Axygen	BF-400-S	Inkubationsfolie für Vor- und Hauptkulturen DWP
Aluminium-Siegelfolie	Axygen	PCR-AS-200-80	° C Aufbewahrungsfolie für Glycerin-Lagerplatten
MCA96 Nested Disposable Tips 200 & micro; l	TECAN	30038619	Arbeitstischposition (WTP 2-1 bis 2-4)
A/B Glas-Filterplatte 1  &Mikro; m	Pall Corporation	PN 8031	Lagerung auf einer Kollektorplatte (CP 2-1 bis 2-4)
96-Well-Mikrotiterplatte V-Bottom	Greiner Bio-One	651201	Kollektorplatte für Filtrationsplatte (CP 2-1 bis 2-4)
96-Well-SpinColumn G-25	Harvard Apparatus	74-5612	Lagerung auf Waschplatte DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 und 2-7)
96-Well-Mikrotiterplatte V-Bottom	Nunc	249944	Auffangplatte für Gel-Filtrationsplatte (CP 3-1 bis 3-4)
Nested Einweg-Spitzen SBS 50 & micro; l Spitzen	TECAN	30038609	Karussellposition (CP 4-6, 4-7 und 5-1 bis 5-6)
Rinne 250 ml	Axygen	Res-SW96-HP	Wasser WTP 1-1, Glukoseassay Reagenzien-Mix WPT 1-2, Ammoniumacetat-Puffer pH 5,6 (CP 5-7)
96-Well-Mikrotiterplatte F-Boden (MTP)	Greiner Bio-One	655101	Fällung 1 (CP 6-1 bis 6-4), pH-Wert (CP 7-1 bis 7-4), Fällung 2 (CP 8-1 bis 8-4), Phenol-Schwefelsäure-Methode (CP 8-5 bis 8-8), Glukose-Assay (CP 9-1 bis 9-9), Dummy-Platten (WTP 3-1, 3-2)
96-Well-Silikonkappenmatte;	Whatmann	7704-0105	Abdeckmatte für MTP
200 & micro; l Pipettenspitzen	Sarstedt	70.760.002	Für die manuelle Handhabung
1.000 & Mikro; l Pipettenspitzen	Sarstedt	70.762	Für die manuelle Handhabung
96-Well-PCR-Mikrotiterplatten	Marke	781350	Hydrolyse, PMP-Derivatisierung
TPE (thermoplastisches Elastomer) Deckelmatte	Marke	781405	Hydrolyse, PMP-Derivatisierung
Filterplatte 0,2  &Mikro; m Supor	Pall Corporation	PN 8019	Filtration von Proben für die UHPLC-ESI-MS-Analyse mit einer MTP-Auffangplatte
Pipettenspitzen LHS 5-300  &Mikro; l	Marke	732150	Marke LHS System
Glukoseoxidase	Sigma-Aldrich	G2133	Glukose-Assay
Meerrettich-Peroxidase	Sigma-Aldrich	P6782	Glukose-Assay, Pyruvat-Assay
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)-diphenylamin-Natriumsalz)	Wako Chemicals GmbH	043-22351	Pyruvat-Assay
Pyruvatoxidase	Sigma-Aldrich	P4591	Pyruvat-Assay
Kaliumphosphat dibasisch	Carl-Roth	P749.3	Pyruvat- und Glukose-Assay
Kaliumphosphat monobasisch	Carl-Roth	3904.3	Pyruvat- und Glukose-Assay
Thiaminpyrophosphat	Sigma-Aldrich	C8754	Pyruvat-Assay
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Sigma-Aldrich	31413	Pyruvat-Assay
2-Propanol	VWR	20922.466	Fällung
Phenol	VWR	20599.231	Phenol-Schwefelsäure-Verfahren
Schwefelsäure	Carl-Roth	4623.4	Phenol-Schwefelsäure-Verfahren
Trifluoressigsäure	Sigma-Aldrich	T6508	Hydrolyse
Ammoniumlösung	Carl-Roth	P093.1	Hydrolyse, PMP-Derivatisierung
Ethanol absolut	VWR	20821.321	Hydrolyse, PMP-Derivatisierung
Phenol rot	Alfa Aesar	B21710	Hydrolyse, PMP-Derivatisierung
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolon	Sigma-Aldrich	M70800	PMP-Derivatisierung
Methanol LC-MS	VWR	83638.320	PMP-Derivatisierung
Acetonitril LC-MS	VWR	83040.320	PMP-Derivatisierung
Essigsäure	Sigma-Aldrich	338826	PMP-Derivatisierung
Ethanol absolut	VWR	20821.321	PMP-Derivatisierung
Methylrot	Alfa Aesar	36667	pH-Wert
Robotergestütztes Liquid-Handling-System	Tecan	Freedom EVO	Aufbau des Arbeitstisches in Abbildung 2Liquid-Handling-Station
LHS	Marke	709400	Aufbau des Arbeitstisches in Abbildung 2
Tip-Adapter	Brand	709434	Aufbau des Arbeitstisches in Abbildung 2
Liquid Ends MC 20-300  &Mikro; l		Arbeitstischaufstellung 709416 Marke in Abbildung 2
Adapter 60 mm	Fabrikat	709430	Aufstellung des Arbeitstisches in Abbildung 2