Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

Summary

Dieses Protokoll vergleicht die relativen Affinitäten von Bindungspartnern für GTPasen der Rho-Familie, einschließlich Rac1. In vivo konkurrieren Rac1-bindende Proteine um eine einzige Bindungsgrenzfläche, deren Konformation durch ein gebundenes Nukleotid bestimmt wird. Das Nukleotid ist aufgrund der hohen Hydrolyserate sowohl wichtig als auch experimentell schwer zu kontrollieren.

Abstract

In diesem Protokoll demonstrieren wir eine Methode zum Vergleich der Konkurrenz zwischen GTPase-bindenden Proteinen. Ein solcher Ansatz ist aus zwei Gründen wichtig für die Bestimmung der Bindungsfähigkeit von GTPasen: Die Tatsache, dass alle Wechselwirkungen die gleiche Oberfläche der GTPasen betreffen, bedeutet, dass Bindungsereignisse im Kontext von Wettbewerbern betrachtet werden müssen, und die Tatsache, dass das gebundene Nukleotid auch kontrolliert werden muss, bedeutet, dass herkömmliche Ansätze wie die Immunpräzipitation für die GTPase-Biochemie ungeeignet sind. Der Assay beruht auf der Verwendung von gereinigten Proteinen. Als Köderprotein wird gereinigtes Rac1 immobilisiertes Rac1 verwendet, das mit GDP, einer nicht hydrolysierbaren Version von GTP, beladen oder nukleotidfrei gelassen werden kann, so dass die zu untersuchende Signalstufe kontrolliert werden kann. Die zu untersuchenden Bindungsproteine werden mit Hilfe eines GFP-Tags aus Säugetierzellen aufgereinigt, um eine korrekte Faltung zu ermöglichen. Die Verwendung desselben Tags auf beiden Proteinen ist wichtig, da dies nicht nur eine schnelle Aufreinigung und Elution ermöglicht, sondern auch den Nachweis beider Konkurrenten mit demselben Antikörper während der Elution. Das bedeutet, dass die relativen Mengen der beiden gebundenen Proteine genau bestimmt werden können.

Introduction

Das Aktin-Zytoskelett, das die Form, Polarität und Migrationseigenschaften von Säugetierzellen bestimmt, wird durch die Rho-Familie kleiner GTPasen reguliert. Zu den GTPasen der Rho-Familie gehören RhoA, das die Kontraktion des Zytoskeletts stimuliert, Rac1, das die Aktinverzweigung und den Membranvorsprung stimuliert, und Cdc42, das ähnliche Auswirkungen auf die Aktinpolymerisation wie Rac1 hat und die Bildung von Filopodien ^1,2 verursacht. Die GTPase-Signalaktivität wird durch die Bindung eines Nukleotids bestimmt, das die Kontraktion und Entspannung der Schalter-I- und Schalter-II-Schleifen steuert, die die Protein-Protein-Wechselwirkungen sowohl mit Regulatoren als auch mit Effektoren vermitteln. Guanosin-5'-Triphosphat (GTP)-gebundene GTPasen aktivieren nachgeschaltete Effektoren, während die an Guanosin 5'-Diphosphat (GDP) gebundene Form inaktiv ist. In der Zelle ermöglichen Zyklen der GTP-Hydrolyse und des Nukleotidaustauschs einen schnellen Austausch von GTPase-Signalen, die für die Dynamik des Zytoskeletts notwendig sind. Der Nukleotidumsatz wird durch drei Mechanismen reguliert. Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) stabilisieren die nukleotidfreie GTPase, katalysieren den Austausch von GDP gegen GTP und stimulieren dadurch die GTPase-Signalaktivität ^3,4. GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) katalysieren die Hydrolyse von GTP zu GDP und hemmen dadurch die GTPase-Signalaktivität ⁵. Sequestrierende Moleküle, wie z. B. der Regulator der Chromatinkondensation 2 (RCC2) und die Guanin-Nukleotid-Dissoziationsinhibitoren (GDIs), verdecken die Schaltschleifen und entfernen im Falle von GDIs die GTPase aus der Membran durch Wechselwirkung mit dem Prenylschwanz ^6,7. Jede der drei Klassen von regulatorischen Molekülen interagiert mit den Schaltschleifen, ebenso wie die nachgeschalteten Effektoren und einige Transportregulatoren wie Coronin-1C ⁷. Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die Konkurrenz um die Bindungsstelle des Schalters I/II zwischen mutmaßlichen Regulatoren und nachgeschalteten Signalmolekülen zu messen. Es sollte beachtet werden, dass Konkurrenzassays die Bindung an eine gemeinsame Bindungsstelle testen, so dass dieses Protokoll nicht geeignet ist, um Wechselwirkungen mit anderen Stellen zu testen, wie z. B. die Bindung von GDIs an den Prenylschwanz.

Die Feinheit der Konformationsunterschiede zwischen aktiven und inaktiven Formen, kombiniert mit der labilen Natur des gebundenen Nukleotids, hat die Untersuchung von GTPase-Bindungsereignissen erschwert. Die Rolle des gebundenen Nukleotids bedeutet, dass herkömmliche Bindungsassays wie Immunpräzipitation oder Oberflächenplasmonenresonanz nicht gut für die Untersuchung geeignet sind, da das Nukleotid nicht kontrolliert werden kann. Dieses Hindernis wird durch die Überlappung der Bindungsstellen von GEFs, GAPs, Effektoren, sequestrierenden Molekülen und Transportmolekülen noch verschärft, was die Interpretation von Bindungsdaten für eine einzelne Interaktion im Kontext der Konkurrenz, die in der Zelle stattfinden wird, erschwert. Insbesondere die Immunpräzipitation wird durch die Konkurrenz zwischen den Bindungspartnern beeinträchtigt, da unter bestimmten zellulären Bedingungen ein Bindungspartner auf Kosten aller anderen identifiziert werden kann, während unter anderen Bedingungen ein anderer Partner dominieren kann. Die dynamische Natur des GTPase-Signalwegs ist essentiell für die Funktion der GTPase und muss bei der Analyse der Beziehungen zwischen den Bindungsinteraktionen verschiedener Regulatoren berücksichtigt werden. In der Tat haben wir kürzlich einen Weg beschrieben, der stark auf kompetitiver Bindung beruhte. Wir identifizierten Coronin-1C als ein Transportmolekül, das an die Schaltschleifen von GDP-Rac1 ^{bindet 7}. In Gebieten mit geringer GEF-Aktivität würde der illegale Handel dominieren und Rac1 aus diesen Regionen entfernen. Wenn Rac1 jedoch in Regionen der Zelle abgegeben wird, in denen die GEF-Aktivität hoch ist, würde das GEF Coronin-1C übertreffen und dadurch sowohl Rac1 aktivieren als auch die Coronin-1C-vermittelte Entfernung von Rac1 aus diesem Bereich verhindern. Das Modell geht noch weiter, denn die Wirkung des GEF tauscht gebundenes BIP gegen GTP aus, wodurch sich das Gleichgewicht noch weiter von Coronin-1C entfernt. Folglich könnte die Rac1-Aktivität vollständig durch Wettbewerb und relative Affinität erklärt werden.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zum Vergleich der relativen Affinitäten verschiedener Bindungspartner für kleine GTPasen am Beispiel von Rac1. Durch die Verwendung eines gereinigten Proteinansatzes ist es möglich, eine Kette von Signalereignissen durch paarweisen Vergleich in einem Experiment zusammenzusetzen, bei dem das gebundene Nukleotid genau kontrolliert werden kann.

Protocol

1. Reinigung von GST-tagged GTPase

1. Kultur ein E. coli-Stamm, wie beispielsweise BL21 mit pGEX-Rac1 O / N transformierten bei 37 ° C, bei 220 Upm Schütteln in 500 ml Autoinduktion Medium (25 mM Na _{2 HPO 4,} 25 mM KH _{2 PO 4,} 50 mM _NH 4 Cl, 5 mM Na _{2 SO 4,} 2 mM MgSO _{4, 2} mM _CaCl 2, 0,5% Glycerin, 0,05% Glucose, 0,2% Lactose, 5 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 100 ug / ml Ampicillin).
2. Ernte Bakterien durch Zentrifugation für 10 min bei 10.000 × g, 4 ° C.
3. Resuspendieren Bakterienpellet in 20 ml Protein Extraktionsreagens, 1x Proteaseinhibitor und Inkubation für 20 min bei RT mit Inversion.
4. Klärung des Lysats durch Zentrifugation bei 40.000 xg für 30 min.
5. 2 ml Glutathion-magnetische Kügelchen, mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS: 10 mM Na _{2 HPO 4,} 1,8 mM KH _{2 PO 4,} 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
6. Inkubation für 2 h, das Mischen durch Inversion bei 4 ° C.
7. Viermal Waschen Kügelchen proteinbeladene mit 10 ml PBS unter Verwendung eines magnetischen Teilchens Sortierer, um die Perlen in jedem Schritt auszufällen.
8. Resuspendieren Protein beladenen Kügelchen in 2 ml PBS und bei -80 ° C in 100 ul Aliquots bis sie benötigt.

2. Expression von GTPase-bindenden Proteinen

1. Am Tag vor dem Experiment Transfektion Plasmide grün fluoreszierende Protein (GFP) kodiert -markierte Versionen jedes GTPase-bindenden Proteins in einem separaten 75-cm ^{2 -Kolben} von HEK293T wie folgt. Zur Validierung von Nukleotid-Laden, transfizieren GFP-markierten TrioD1 in ein drittes 75-cm ^2-Kolben von HEK293T.
   1. Verdünnter polyethylamine bis 1 mg / ml in 100 & mgr; l sterilem 150 mM NaCl.
   2. In 27 ul verdünnt polyethylamine bis 223 & mgr; l reduziert Serum Medien.
   3. In 12 & mgr; g Plasmid-DNA zu 250 & mgr; l reduziert Serum Medien.
   4. Inkubieren jedes Röhrchen für 2 min bei RT.
   5. Kombinieren Sie die polyethylamine und DNA vermischt sich in einem einzigen Rohr und Vortex für 2 min.
   6. Inkubieren Sie für 15-20 min bei RT.
   7. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium, das 10% fötales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, keine Antibiotika), die auf 90% konfluent HEK293T mit 5 ml frisches Wachstumsmedium.
   8. In der kombinierten polyethylamine / DNA-Gemisch in den Kolben und Inkubation O / N bei 37 ° C, _5% CO 2.

3. Reinigung der GTPase-bindenden Proteinen

1. Spülen Sie die Flasche aus transfizierten Zellen in PBS und Drain-Kolben für 5 min, Absaugen freie Flüssigkeit.
2. Abzukratzen Zellen in 500 ul Lysepuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x Proteaseinhibitor) in Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Zellen lysieren durch Mischen durch Inversion bei 4 ° C für 30 min.
4. Während der Lyse, waschen zwei Lose von 40 ul GFP-Trap-Kügelchen dreimal mit frischem Lysepuffer, sedimentierenden Perlen bei 2700 × g für 2 Minuten zwischen den Waschvorgängen.
5. Klärung Lysate durch Zentrifugation bei 21.000 × g für 10 min.
6. Übertragungs geklärte Lysat eines jeden der Wettbewerber Proteine ​​gewaschen GFP-trap Perlen abzutrennen und zu ermöglichen GFP-Fusionsproteine, für 2 h binden, Mischen durch Umdrehen bei 4 ° C. Halten Lysat aus GFP-TrioD1 Zellen auf Eis.
7. Zweimal waschen geladen GFP-Trap-Perlen in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w / v) Nonidet P-40 und zweimal in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl ₂ , sedimentierenden Perlen bei 2700 × g für 2 Minuten zwischen den Waschgängen.
8. Eluieren GFP-Fusionsproteinen durch Zugabe von 40 ul 0,2 M Glycin (pH 2,5) und Auf- und Abpipettieren für 30 sec. Sofort Sediment Kügelchen bei 21.000 × g für 60 s und Transferflüssigkeit auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, enthaltend 4 & mgr; l 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Tun dies schnell zur Beschädigung des gereinigten Proteins zu begrenzen.
9. Analyse 1 ul jedes gereinigten Proteins durch Western-Blot und die Sonde mit einem anti-GFP-Antikörper, um die relative Ausbeute herzustellen unter Verwendung eines quantitativen Blotting System gemäß dem Protokoll des Herstellers. Alternativ bestimmen Proteinkonzentrationen von Bicinchoninsäure (BCA) Assay aber dies führt Fehler, wenn die Proteine ​​nicht mit dem Assay in einer identischen Weise reagiert oder es kontaminierende Proteine.
10. Leichen molaren Proteinkonzentration durch die Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl _2.

4. Nucleotide Belastung der GTPase

1. Tauwetter ein Aliquot von GST-Rac1 magnetische Kügelchen, die in Schritt 1 hergestellt.
2. Nehmen 90 ul von GST-Rac1 Perlen und dreimal mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA, unter Verwendung eines magnetischen Partikelsortierer, um die Perlen in jedem Schritt auszufällen.
3. Saugen Sie Puffer aus Perlen und fügen Sie 100 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA.
4. Je nachdem, ob das BIP, GTP oder keine Nukleotid-Belastung für den Wettbewerb Experiment erforderlich, fügen Sie 12 ul 100 mM BIP, 12 & mgr; l 10 mM guanosine 5 '- [γ-thio] Triphosphat (GTP & ggr;) oder keine Nukleotid bis 60 & mgr; l GST-Rac1 Perlen.
5. Für die Nukleotid-Ladesteuerungen, teilen Sie die restlichen Perlen in drei 10-ul-Aliquots und fügen Sie 2 ul 100 mM GDP, 2 & mgr; l 10 mM GTPyS oder keine Nukleotid in jedes Röhrchen.
6. Inkubieren Wulst Mischungen für 30 Minuten bei 30 ° C unter Rühren.
7. Stabilisierung Nucleotid gebundene Rac1 durch Zugabe von 1 M MgCl _{2: 3} & mgr; l auf die Versuchsmischung (Schritt 4.4), 0,5 & mgr; l zu jeder der Kontrollmischungen (Schritt 4.5).

5. Wettbewerb bindend.

1. Einrichten 6 Mikrozentrifugenröhrchen, die jeweils:
   200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl ₂
   10 & mgr; experimentelle Nukleotid-beladenen Rac1-Perlen (ab Schritt 4.7)
   5 ul Rac1-bindenden Protein A (Konstante Bindungsprotein)
2. Zu jedem Röhrchen hinzu 0, 1, 2,5, 5, 10 oder 20 ul Rac1-bindendes Protein B (variable Bindungsprotein). Diese Bände davon ausgehen, approximately gleich stock Konzentrationen der konstanten und variablen Bindungsproteine ​​und muss unter Umständen angepasst werden.
   1. Einstellen Volumina bindende Proteine ​​A und B, wenn es große Unterschiede in den Bindungsaffinitäten der beiden Proteine ​​und dies sollte empirisch durch die Versuchswiederholungen bestimmt werden. Bilden das Gesamtvolumen des Bindungsgemisch auf 235 & mgr; l durch Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl _2.
3. Einrichtung eines Mikrozentrifugenröhrchen enthält:
   200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl ₂
   10 & mgr; experimentelle Nukleotid-beladenen Rac1-Perlen (ab Schritt 4.7)
   10 ul Rac1-bindenden Protein A (Konstante Bindungsprotein)
4. Einrichten des BIP, GTPyS und keine Nukleotid-Kontrollröhrchen:
   200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl ₂
   10 ul Steuer Rac1 Perlen in Schritt 4.5 mit dem BIP, GTPyS oder kein Nukleotid geladen und in Schritt 4.7 stabilisiert.
   180 ul HEK293T GFP-TrioD1 Lysat, wie in Schritt 3.6 hergestellten
   4 & mgr; l 1 M MgCl ₂
5. Inkubieren der Mischung für 2 h, das Mischen durch Inversion bei 4 ° C.
6. Dreimal mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl ₂ Waschen der Kügelchen.
7. Eluieren die gebundenen Proteine ​​werden in 20 ul reduzierendem Probenpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% Glycerin, 0,02 mg / ml Bromphenolblau, 5% β-Mercaptoethanol).

6. Analyse der Wettbewerbs

1. Beheben 10 ul des gebundenen Proteins (Schritt 5.6), bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western-Blot.
2. Inkubieren der Membran bei 4 ° CO / N im anti-GFP-Antikörper, verdünnt 1/1000 in Blockierungspuffer verdünnt, in PBS 1X, 0,1% Tween-20 auf die beiden markierten GTPase-bindende Proteine ​​erkennen.
3. Dreimal 10 min mit PBS, 0,1% Tween-20 waschen der Membran.
4. Inkubieren der Membran für 30 min bei RT in 800 DyLight konjugiertem Anti-Kaninchen-secondary Antikörper, verdünnt 1 / 10.000 in Blockierungspuffer verdünnt, in PBS, 0,1% Tween-20 1 x auf.
5. Dreimal 10 min mit PBS, 0,1% Tween-20 waschen der Membran.
6. Scannen der Membran unter Verwendung eines Infrarot-Abbildungssystem mit der Software, um die Bandintensität nach dem Protokoll des Herstellers gemessen.
7. Zur Erstellung der Bandintensität jedes Proteins vor der Verstellpumpe Konkurrent (Protein B).
8. Teilen das Volumen der variable Konkurrent an dem Punkt, an dem die Linien sich durch das Volumen konstant Konkurrent (Protein A, 5 & mgr; l), um den Konkurrenzverhältnis, bei dem ein Gleichgewicht erreicht bestimmen.
9. Zur Validierung der Nukleotid-Ladezustand, Sondenmembranen für p21-activated kinase 1 (PAK1) (ein Effektor) und GFP-TrioD1 (a GEF), wie in den Schritten 6.1-6.6 beschrieben.

Results

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die relativen Affinitäten von Bindungspartnern für Rac1 zu berechnen, ohne die Notwendigkeit, die genaue Konzentration der Wettbewerber zu geben (Abbildung 1). Bestimmung der Proteinkonzentration führt Fehler und bei der Betrachtung der Wettbewerb zwischen Molekülen in einem Signalweg, ist nicht erforderlich. Jedoch ist es wichtig zu wissen, dass die beiden Wettbewerber haben die gleiche molare Konzentration in der Stammlösungen für einfache, Verhältnisse berechnet werden, wenn die Zugabe verschiedener Volumina auf den Test. 40 ul von GFP-Trap-Perlen eine Bindungskapazität von ~ 300 pmol so eine konfluente 75 cm ^2-Kolben hoch exprimierenden Zellen werden die Perlen zu sättigen, mit dem Ergebnis, dass die Vorbereitungen der beiden unterschiedlichen Bindungsproteine ​​ähnlich vor Anpassung (Abbildung 2A). Wenn eines der Proteine ​​schlecht exprimiert, kann dieses Problem durch Reinigen dieses Proteins aus mehr als einem Kolben von Zellen überwunden werden können.

8 (2B) erfasst werden. GEFs Substanzen binden Nukleotid freien GTPase den Übergangszustand zu stabilisieren. Wie GEFs sind von geringer Menge, in der Regel nicht aktiv und häufig schlecht auslöschen, ist es besser, ein GEF oder GEF-Fragment zu Test Nukleotid-freien GTPase überexprimieren. Wir verwenden häufig die erste Dbl Homologie von Trio, ausgedrückt als GFP-Fusions (GFP-TrioD1 ⁹⁾ (2B) aber jede GEF funktionieren würde. Proteine, die an der BIP-geladen GTPase binden, sind seltener. Vor kurzem berichteten wir RCC2 als eine solche Protein ^{7 oder} BIP-Belastung kann einfach als bindi validiert werdenng bis weder GEF noch Effektorzellen.

Der Ausgang aus dem Experiment wird ein Western-Blot-Darstellung die beiden GFP-markierten Bindungspartner für die GTPase gebunden sein. Durch die Verwendung eines einzelnen Antikörpers, beide Proteine ​​zu erkennen, können die Konzentrationen, bei denen gleiche Mengen der beiden Wettbewerber binden bestimmt und daher die relativen Affinitäten abgeleitet. In diesem Beispiel ist der Wettbewerb zwischen dem Propeller-Domäne des Rac1-Trafficking-Protein Coronin-1C (Rac1-bindenden Protein A) und die Rac1 sequestrierenden Protein RCC2 (Rac1-bindendes Protein B) wird nachgewiesen (3A). Unter Verwendung eines konstanten Volumens Coronin 1C Propeller (5 ul), und das Hinzufügen von steigenden Mengen von RCC2, wir von der GFP sehen auslöschen, dass ein Gleichgewicht bei 1,25-2,5 ul RCC2 (Sternchen) erreicht ist, was zeigt, dass RCC2 hat eine stärkere Affinität für Rac1 als Coronin-1C. Durch Messen der Intensität der Banden mittels quantitativer Western Blot und Aufzeichnen der Mittelwerte für jede competitor kann der Gleichgewichtspunkt genau durch Ermittlung der Mengen an denen die Kurven schneiden (3B) berechnet werden.

Eine der möglichen Hindernisse für eine erfolgreiche Konkurrenz-Assay ist, wenn die Bindungspartner miteinander sowie die Bindung an Rac1 binden. In 3A + B zeigen wir den Wettbewerb zwischen RCC2 und Propeller-Domäne von Coronin-1C, anstatt voller Länge Coronin-1C. Der Grund für die Verwendung des trunkierten Coronin dass Coronin 1C bindet ebenfalls RCC2 durch die Schwanzdomäne. Bei voller Länge Coronin-1C gegen RCC2 titriert, Bindung beider Proteine ​​erkannt wird, aufgrund von ternären Komplexbildung, anstatt den Wettbewerb (3C). Wenn Konkurrenz auftritt, wird Bindung eines Proteins, während das andere abnimmt erhöhen und gesamte gebundene GFP-Fusions konstant. In Fällen, in denen ein ternärer Komplex bildet es notwendig ist, eine der GTPase-bindendes Protein abzuschneiden, so dass der competitors nicht mehr interagieren.

Abbildung 1. Arbeitsablauf. Schematische Darstellung der Arbeitsablauf zur Bestimmung der Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Konkurrenz-Assays. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Validierung von gereinigten Proteinen. (A) gereinigtes GFP-markierten Rac1 bindenden Proteinen durch Western-Blot analysiert, Sondierung mit Anti-GFP, um die relative Ausbeute der beiden Proteine ​​zu bestimmen. Diese Art von Entzerrung während des Experiments kann die Konzentration der beiden Proteine ​​angepasst werden, so dass sie in dem Bindungsexperiment übereinstimmen. (B) GDP, GTPyS und keine Nukleotid-beladenen GST-Rac1 mit Lysat aus HEK293T, die GFP-TrioD1 Proteine ​​durch Auftragen einer endogenen PAK1 oder überexprimiert GFP-TrioD1 erkannt inkubiert und gebunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Western-Blot-Analyse der relativen Proteinbindung. Beispiel Ausgaben von Konkurrenz-Bindungs-Assays. (A) BIP belasteten Rac1 wurde mit 5 ul GFP-Coronin-1C-Propellerdomäne gemischt und steigenden Mengen von GFP-RCC2 wurden titriert. Durch Westernblot gebundenen Proteine ​​GFP, sind Probleme mit der Differenzerfassung der beiden Proteine ​​vermieden und das GFP-Signal meldet das Molverhältnis zwischen den beiden Fusionsproteinen. Sternchen zeigen die Wettbewerbsverhältnisse auf either Seite des Gleichgewichtspunkt. (B) Bandenintensitäten von gebundenem GFP-Fusionsproteinen aus drei unabhängigen Experimenten wurden durch quantitative Western-Blotting gemessen, wobei Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpern und Mittelwerte aufgetragen, um die Menge an RCC2 Berechnung erforderlich, um das Gleichgewicht zu erreichen. (C ) Ausgabe aus einem Experiment, wo Rac1-bindende Proteine ​​binden aneinander und bilden einen ternären Komplex, anstatt konkurrierende. BIP belasteten Rac1 wurde mit 5 ul GFP-RCC2 gemischt und steigenden Mengen von GFP-Coronin-1C in voller Länge wurden ohne Verlust an gebundenem GFP-RCC2 titriert. Der Anstieg der gebundenen GFP-Coronin-1C zeigt ternären Komplexbildung. Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Vergleich der relativen Affinitäten von Paaren kleiner GTPase-bindender Proteine. Die wichtigsten Schritte sind die Aufbereitung der gereinigten GTPase-bindenden Proteine und die Nukleotidbeladung der GTPase. Die Verwendung von GTPase-bindenden Proteinen mit dem gleichen GFP-Tag ermöglicht es, die Konzentrationen, bei denen ähnliche Mengen jedes Konkurrenten binden, genau zu bestimmen. Die Verwendung von rekombinanter nukleotidbeladener GTPase ermöglicht die Abfrage der Bindungseigenschaften der GTPase unter spezifischen Aktivitätsbedingungen. Dieser Schritt ist auch der empfindlichste, da Nukleotide sowohl hydrolysieren als auch von der GTPase lösen, wenn die Magnesiumbedingungen nicht genau eingehalten werden.

In der Zelle macht die große Anzahl von GTPase-bindenden Proteinen in Kombination mit dem schnellen Nukleotidumsatz die Interpretation solcher Signalwege schwierig. Die Einfachheit dieser Methode, bei der nur Paare von Bindungsproteinen verglichen werden und sorgfältig kontrollierte Nukleotidbeladungsbedingungen verwendet werden, ermöglicht die Aufklärung von Signalwegen. Die größte Stärke des Protokolls ist jedoch auch die größte Schwäche, da es eine Vereinfachung der In-vivo-Situation darstellt. Konkurrenz-Assays können verwendet werden, um eine robuste Hypothese aufzustellen, aber diese sollte dann durch Knockdown-Experimente in Zellen getestet werden.

Es gibt drei Merkmale, die bei der Auswahl der GFP-markierten GTPase-bindenden Proteine, die im Experiment verwendet werden sollen, berücksichtigt werden müssen. Erstens müssen die Fusionsproteine in Säugetierzellen wie HEK293T gut exprimiert werden, da Konkurrenzassays eine angemessene Menge an Protein erfordern. Zweitens muss es möglich sein, das rekombinante Protein ohne signifikanten Abbau zu reinigen, und wo dies nicht möglich ist, sollte die Klonierung eines GTPase-bindenden Fragments in Betracht gezogen werden. Drittens müssen die beiden GTPase-bindenden Proteine auf SDS-PAGE voneinander aufgelöst werden, um eine Analyse in Abschnitt 6 zu ermöglichen.

Es gibt eine Reihe potenzieller Vorbehalte bei dem Experiment, die berücksichtigt und möglicherweise behoben werden müssen:

Mögliche Denaturierung von gereinigten GTPase-bindenden Proteinen während des Säureelutionsschritts oder sterische Behinderung durch den GFP-Tag. In unseren Händen waren diese kein Problem, müssen aber getestet werden. Die gereinigten Proteine können in funktionellen Assays ¹⁰ getestet werden. Inzwischen gibt es kommerzielle Kits, um die Aktivität von GEFs oder GAPs zu testen, ohne dass isotopenmarkierte Nukleotide benötigt werden. Sequestrierende Proteine schützen GTPasen von Natur aus vor GEF- oder GAP-Aktivität und können daher als kompetitive Inhibitoren in kommerziellen GEF- oder GAP-Assays verwendet werden, wie wir es in unserer jüngsten Veröffentlichung ^{getan haben 7}. Das relevante Merkmal von Proteinen, die GTPase transportieren, ist die Fähigkeit, die GTPase zu binden, und dies kann leicht in einem Pull-Down-Assay getestet werden. Ein alternativer Ansatz zum Testen der Proteinintegrität, der auf alle Bindungsproteine anwendbar ist, besteht darin, Proteine, die aus GFP-Fallenkügelchen eluiert wurden, mit Glycin zu titrieren, wobei das gleiche Protein aus GFP-Fallenkügelchen durch enzymatische Spaltung entfernt wird. Das Experiment würde analysiert, indem sowohl das GFP-markierte als auch das gespaltene Protein mit einem Antikörper gegen das Protein selbst untersucht werden. Wenn das Protein durch Elution nicht geschädigt wird, sollte ein Gleichgewicht im Verhältnis 1:1 erreicht werden. Dieser Ansatz würde auch anzeigen, ob das Vorhandensein des GFP-Tags selbst die Bindungseigenschaften des Kandidatenproteins beeinträchtigt, obwohl dies die Herstellung eines Konstrukts mit einer enzymatischen Spaltstelle zwischen dem Tag und dem Bindungsprotein erfordert. Unabhängig davon, ob das Protein durch den Tag oder den Elutionsschritt kompromittiert wird, könnte das Problem durch eine Änderung des Protokolls gelöst werden, um eine alternative Aufreinigungsmethode zu verwenden. Anstelle von GFP könnten bindende Proteine mit His-markiert, mit Ni-NTA gereinigt und mit einem Antikörper gegen den His-Tag analysiert werden. Das wichtige Merkmal ist, dass beide Bindungsproteine eine gemeinsame Markierung haben müssen, obwohl bei Bedarf zwei Tags zu einem Protein hinzugefügt werden können, einer für die Reinigung und der andere für den Nachweis.

Das Protokoll wurde entwickelt, um den Wettbewerb zwischen den Wechselwirkungen mit den Switch-I/II-Domänen zu untersuchen. Obwohl die Mehrzahl der GTPase-Wechselwirkungen durch dieses Motiv vermittelt wird, gibt es einige Ausnahmen, vor allem die Wechselwirkungen von GDIs, die an den Prenylschwanz binden und die Schalterdomänen verschleiern. Prinzipiell könnte das Protokoll so angepasst werden, dass GTPase verwendet wird, die aus Säugetierzellen gereinigt wurde, so dass die GTPase prenyliert ist, jedoch erschwert das Vorhandensein mehrerer Bindungsstellen oder allosterischer Effekte die Interpretation von Konkurrenzbindungsdaten. Weitere Probleme, die mit einer solchen Modifikation verbunden sind, sind, dass GDIs mit GTPase aus Säugetierzellen co-reinigen, was die Reinheit der isolierten Proteine beeinträchtigt, und die hydrophobe Natur der Prenylgruppen bedeutet, dass prenylierte GTPasen entweder mit GDI oder Lipidmembran assoziiert sind und solche Faktoren im Experiment berücksichtigt werden müssten.

Die Menge an GST-Rac1, die im Assay verwendet wird. Das konstante GTPase-bindende Protein muss eine höhere Konzentration als das Rac1 haben, oder wenn der Konkurrent hinzugefügt wird, bindet es einfach an freies Rac1. Es wird sofort offensichtlich, wenn dies geschehen ist, da die Bindung des Konkurrenten ohne Verlust des konstanten Proteins auf die gleiche Weise nachgewiesen wird, wie wenn die beiden konkurrierenden Proteine aneinander binden, wie in Abbildung 3B gezeigt. Als zusätzliche Kontrolle (Schritt 5.3) sollte eine Bindungsreaktion eingeschlossen werden, die die doppelte Menge an konstantem Bindungsprotein und kein variables Bindungsprotein enthält (Schritt 5.3). Wenn der Rac1 im Titrationsexperiment gesättigt ist, hat eine Verdopplung der Menge an konstant bindendem Protein keinen Einfluss auf die Ausgabe. Die im Protokoll vorgeschlagenen Volumina sollten angemessen sein, aber die Menge an Rac1 kann leicht reduziert werden. Wenn eine Bindung des Konkurrenten ohne Verlust des konstanten Bindungspartners beobachtet wird, sollte versucht werden, die Menge an Rac1 zu reduzieren, bevor versucht wird, Bindungsstellen zu kartieren, um die Bildung ternärer Komplexe zu vermeiden.

Unspezifische Interaktion von GTPase-bindenden Proteinen mit dem GST oder Bead sowie spezifisch mit Rac1. Dieses Problem würde sich in einer Restbindung des konstanten GTPase-bindenden Proteins manifestieren, selbst wenn das variable GTPase-bindende Protein bei hoher Konzentration ein Plateau erreicht hat. Die Identifizierung dieses Problems wird durch die Durchführung reziproker Experimente unterstützt, bei denen die konstanten und variablen GTPase-bindenden Proteine ausgetauscht werden. Reziproke Experimente verbessern auch die Genauigkeit der Schätzung des Gleichgewichtspunktes erheblich und sollten daher immer einbezogen werden. In Fällen unspezifischer Bindung können die relativen Konzentrationen, bei denen ein Gleichgewicht erreicht wird, immer noch berechnet werden, indem die Bandenintensität zwischen den Maxima und Minima für jedes Protein verglichen wird, oder indem das Ausmaß der unspezifischen Bindung gemessen wird, indem GST-Kügelchen anstelle von GST-Rac1 als Köder verwendet werden.

Pull-Down-Assays mit unterschiedlichen Nukleotidbeladungsbedingungen sollten verwendet werden, um den in diesem Protokoll beschriebenen Wettbewerbsassay zu ergänzen. Die Bestimmung der Nukleotidpräferenz der Partner ist wichtig, um sowohl das Wettbewerbsgeschehen als auch den Signalweg zu verstehen, an dem das GTPase-bindende Protein beteiligt ist. In Abbildung 2B analysieren wir die Bindung von Proteinen mit einer etablierten Präferenz für GTP-beladene oder nukleotidfreie GTPase als Mittel zur Validierung der Nukleotidbeladung. Es ist jedoch sinnvoll, auch die Auswirkungen der Nukleotidbeladung auf jeden der Wettbewerber zu untersuchen. Wenn die hypothetischen Konkurrenten unterschiedliche Präferenzen zeigen, wird die Konkurrenz weniger zum Signalweg beitragen, und in der Tat ist der Nukleotidumsatz wahrscheinlich der Mechanismus, der den Austausch der Bindungsproteine steuert.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugbuster	Novagen	70584-3
COMPLETE Proteaseinhibitor	Roche	05 056 489 001
Glutathion-Magnetkügelchen	Pierce	88821
Polyethylenimin, verzweigt, durchschnittlich Mw ~25.000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fötales Rinderserum	Life Technologies	10270-1-6
L-Glutamine	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Sehr instabil. Aliquotieren und sofort nach der Rekonstrutution bei -80 lagern GTP
γ S	Sigma Aldrich	G8634	Sehr instabil. Aliquotieren und sofort nach der Rekonstitution bei -80 lagern
Blockierungspuffer	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Anti-GFP-Antikörper	Living Colors	632592	Verwendung bei 1/1000 Verdünnung
DyLight 800 konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper	Fisher Scientific	10733944
Anti-PAK1-Antikörper	Cell Signaling	2602S	Verwendung bei einer Verdünnung von 1/1000
Odyssey SA Infrarot-Bildgebungssystem	Li-cor	9260-11PC