Die immunmodulatorischen Eigenschaften von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) erscheint für die klinische Anwendung zunehmend relevant. Verwendung eines Co-Kultursystem der MSCs und peripheren Blutleukozyten mit dem Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) vorgefärbten beschreiben wir den in vitro Beurteilung der MSC Immunomodulation auf Effektorzellen Leukozyten Proliferation und bestimmten Subpopulationen.
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Methodenartikel
Beurteilung der immunmodulatorischen Eigenschaften von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs)
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die immunmodulatorischen Eigenschaften von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) mit mehreren Linien scheinen für den klinischen Einsatz bei einer Vielzahl von immunbedingten Erkrankungen von großer Bedeutung zu sein. Die beteiligten Mechanismen werden zunehmend aufgeklärt und in diesem Artikel beschreiben wir das grundlegende Experiment zur Bewertung der MSC-Immunmodulation durch Assays zur Unterdrückung der Effektor-Leukozytenproliferation. Die Leukozytenproliferation kann durch eine Reihe von Techniken beurteilt werden, und wir beschreiben in diesem Protokoll die Verwendung des fluoreszierenden zellulären Farbstoffs Carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) zur Markierung von Leukozyten mit anschließenden durchflusszytometrischen Analysen. Diese Technik kann nicht nur die Proliferation ohne Radioaktivität beurteilen, sondern auch die Anzahl der aufgetretenen Zellteilungen und ermöglicht die Identifizierung der spezifischen Population proliferierender Zellen und der intrazellulären Zytokin-/Faktorexpression. Darüber hinaus kann der Assay so angepasst werden, dass er spezifische Populationen von Effektor-Leukozyten durch Auswahl von magnetischen Bead-Oberflächenmarkern einzelner mononukleärer Blutpopulationen aus dem peripheren Blut vor der Co-Kultur mit MSCs bewertet. Die Flexibilität dieses Co-Kultur-Assays ist nützlich für die Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen zwischen MSCs und Leukozyten.
Einleitung
Humane mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind somatische Vorläufern, die in die achsparallel mesodermalen Abstammungslinien von Knochen, Knorpel und Fettgewebe 1-4, um ein paar extramesodermal Linien 5 unterscheiden kann, wie auch. Zuerst von der erwachsenen Knochenmark isoliert wurden diese multilineage Vorläufern jetzt in zahlreichen Geweben 6-8 gefunden und unerwarteterweise gezeigt, dass starke immunmodulatorische Eigenschaften, die sehr gut für die klinische Anwendung 9-12 erscheinen müssen. Detaillierte Mechanismen in den immunmodulatorische Effekte einbezogen werden aktiv für eine wirksame Anwendung auf spezifische Kra....
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Protokoll
Patientenzustimmung, wie durch die Ethikkommission genehmigt muss für die Verwendung von menschlichen Zellen gewonnen werden.
1. Dichtegradienten Isolierung von humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)
- 25 ml heparinisiertes Vollblut in eine 50-ml-Röhrchen mit einer 25 ml Pipette.
- Zellen verdünnt mit 25 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
- 15 ml Ficoll-Paque-Dichtegradienten in ein neues 50 ml Röhre und beim Kippen der Röhre, sehr langsam und vorsichtig in 25 ml der verdünnten Zellsuspension über den Dichtegradienten hinzuzufügen, so dass es zu keiner Vermischung des Vollbluts mit der ....
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Ergebnisse
Figur 1 zeigt die Gesamtschema des Experiments, und Figur 2 zeigt das Aussehen der verschiedenen Zellkulturbedingungen, wie durch Phasenkontrastmikroskopie sichtbar invertiert. MSCs sind adhärente Zellen mit Fibroblasten, spindelförmige Morphologie, wobei PBMCs und Leukozyten sind kleine, runde, nichthaftende Zellen. Diese zwei morphologisch unterschiedliche Zelltypen ist deutlich in der Co-Kultur gesehen werden. Am Ende des Tests, wenn die PBMCs (oder leuckotyes) für durchflusszytometrische abgesaugt analy.......
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Diskussion
Die immunmodulatorischen Eigenschaften von MSCs werden zunehmend schneller in den klinischen Einsatz überführt als die Multilinienkapazität dieser Stammzellen18-20. Daher sind Co-Kulturtechniken von MSCs mit Leukozyten und Assays zur Bewertung der Immunfunktion wichtig, um die spezifischen Mechanismen, die an diesen Eigenschaften beteiligt sind, weiter abzugrenzen und die effektive therapeutische Anwendung zu optimieren.
Einer der wichtigsten technischen Aspekte für den Erfolg dies.......
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Offenlegungen
Wir haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse von NHRI (CS-104-PP-06 an B.L.Y.) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Dichtegranmittel für die Isolierung von mononukleären Zellen (PBMCs) im peripheren Blut) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Zellmarkierung zum Nachweis der Zellteilung |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Aktivierung von humanen PBMCs |
| Dynabeads Humaner T-Aktivator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Aktivierung von humanen T-Lymphozyten, z.B. CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Zellseparator auf magnetischer Basis |
| autoMACS® Säulen | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | Trennsäulen |
| CD14 Mikrokügelchen, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Für die Positivselektion von CD14+ humanen Monozyten und Makrophagen aus PBMCs |
| , CD4-Mikrokügelchen, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | Für die positive Selektion von CD4+ humanen T-Lymphozyten aus PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Humanes PBMC/Leukozyten-Kulturmedium |
| DMEM, niedrige Glukose, Pyruvat | Life Technologies | 11885 | Kulturmedium für humane mesenchymale Stammzellen (MSC) |
| L-Glutamin | Life Technologies | 25030-081 | Supplementierung für MSC-Komplettmedium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementierung für PBMC/Leukozyten und MSC-Komplettmedium |
| Fötales Rinderserum (FBS) | 1) Hykllon, für MSC-Kultur 2) Life Technologies für alle anderen Zellen (d. h. PBMCs, spezifische Leukozytenpopulationen) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Vortestlose zur Unterstützung von MSC in vitro Kultur |
| 24-Well-Zellkulturplatte | Corning | COR3524 | Co-Kulturplatte |
| 50 ml Zentrifugenröhrchen | Corning | 430291 | Isolierung PBMCs aus Vollblut durch Ficoll-Paque PLUS |
| 15 ml Zentrifugenröhrchen | Corning | 430766 | Sammlung der markierten und unmarkierten Zellfraktionen |
| Röhrchen mit rundem Boden | BD Falcon | 352008 | Entnahme von Zellen für die durchflusszytometrische Analyse |
Referenzen
- Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Prockop, D. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
