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Methodenartikel

Wiederholte Blutentnahme für Bluttests in Adult Zebrafisch

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DOI:

10.3791/53272

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30. August 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Medical Science, Graduate School of Medicine, Mie University, 2Department of Molecular and Cellular Pharmacology, Pharmacogenomics, and Pharmacoinformatics, Graduate School of Medicine, Mie University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wiederholte Blutentnahme ist notwendig und wichtig in Tierversuchen. Wir haben eine neuartige, nicht-letale und zuverlässige Methode zur wiederholten Blutentnahme von adulten Zebrafischen entwickelt und diese Methode auf die Untersuchung der Blutbiochemie, einschließlich des Glukosestoffwechsels, angewendet.

Zusammenfassung

Wiederholte Blutentnahme ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken bei Labortieren durchgeführt. Allerdings hat eine nicht-tödliche Protokoll für die Blutentnahme aus Zebrafisch nicht nachgewiesen. Die bisherigen Verfahren zur Blutentnahme aus Zebrafisch sind tödlich, wie laterale Inzision, Enthauptung und Schwanz Ablation. So haben wir eine neuartige "wiederholte" Blutabnahmeverfahren ein detailliertes Protokoll umreißt dieses Verfahren entwickelt, und heute hier. Dieses Verfahren ist minimal-invasiv und führt zu einer sehr geringen Sterblichkeit (2,3%) für Zebrafisch, wodurch wiederholte Entnahme von Blut aus dem gleichen Individuum. Das maximale Volumen der Blutabnahme ist abhängig vom Körpergewicht der Fische. Das Volumen für wiederholte Entnahme von Blut in Abständen sollte ≤0.4% des Körpergewichts pro Woche oder ≤1% alle 2 Wochen, was durch Messungen der Hämoglobin bewertet wurden sein. Zusätzlich Hämoglobin, Nüchternblutzucker, Plasma Triacylglycerol (TG) und c insgesamtholesterol Ebenen bei männlichen und weiblichen erwachsenen Zebrafisch wurden gemessen. Wir wendeten diese Methode auch, um die Fehlregulation des Glukosestoffwechsels in ernährungsbedingte Fettleibigkeit zu untersuchen. Dieses Blutsammelverfahren wird viele Anwendungen, einschließlich Glucose- und Fettstoffwechsels und hämatologischen Studien, die die Verwendung eines Zebrafischs als menschliche Krankheitsmodell Organismus erhöhen können.

Einleitung

Zebrafische sind gewinnt zunehmend an Popularität als ein wertvolles Modell der menschlichen Krankheiten, weil ihre Organe und Genetik ähnlich denen des Menschen 1,2 sind. Auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie, haben viele Studien gezeigt, dass die Zebrafisch und Menschen zeigen deutliche Ähnlichkeit in der Hämatopoese 3, Blutstillung 4,5 und Myelopoese 6. Erwachsenen Zebrafisch sind ebenfalls für die Untersuchung immunologischer 7, neurodegenerative 8 und Fettleibigkeit bedingte Krankheiten 9, weil dieses Modellorganismus Aktien gemeinsamen Wege mit denen in menschlichen Erkrankungen gestört verwendet. Für Übergewicht und Fettleibigkeit bedingte Krankheiten (Diabetes, Fettleber und nichtalkoholische Steatohepatitis und Atherosklerose), Zebrafisch-Blutzucker und Lipide Ebenen wurden gründlich in mehreren transgenen und ernährungsbedingte Fettleibigkeit Modelle 10-13 untersucht.

Wiederholte Entnahme von Blut aus einzelnen Tiere Tiernutzung und Dezember zu reduzierenRease interindividuelle Unterschiede. Jedoch ist wiederholte Probennahme wegen ihrer relativ kleinen Blutvolumen und der Mangel an leicht zugänglichen Gefäßen technisch schwierig bei kleinen Tieren wie Zebrafisch. Verschiedene Methoden für die einmalige Blutentnahme von Zebrafisch entwickelt, obwohl diese Methoden haben ihre eigenen Nachteile, einschließlich Letalität assoziiert Gewebeschäden und begrenzte Blutvolumen. B. 1-5 & mgr; l Blut von einem seitlichen Einschnitt von etwa 0,3 cm in der Länge in dem Bereich des dorsalen Aorta 5 geerntet werden. Enthauptung mit einer Schere durch Schneiden durch den Schultergürtel kann 5-10 & mgr; l Blut 10 zu sammeln. Eine weitere praktische Blutentnahme Methode ist tail Ablation 14. Herzpunktion ist eine mögliche alternative Verfahren für wiederholte Blutentnahme aus dem gleichen Fisch, aber die sehr geringe Menge erhalten (etwa 50 nl) mit diesem Verfahren begrenzt die Anzahl der Analysen, die Leis sein kannMed. 11 Dementsprechend wird ein neues Protokoll benötigt, um wiederholter nicht-tödliche Blutabnahme, die zu kritischer Voraus erforderlich wäre dafür Organismus auf eine Standard-Modellorganismus für menschliche Krankheiten zu ermöglichen. Diese Technik würde zum Testen pharmakologische Reaktion, Entdeckung von Molekular Biomarker für die Diagnose, die Bestimmung der Prognose und die Überwachung von verschiedenen Krankheiten, wie Stoffwechselerkrankungen, degenerativen Erkrankungen und verschiedenen Arten von bösartigen Erkrankungen ermöglicht.

Deshalb entwickelte eine minimal-invasive Verfahren zur Gewinnung von Blut von Zebrafischen in Reihe 15. Hier werden wir den Vorgang visuell nachweisen und ein detailliertes Protokoll für diese Technik. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden der normale Wert auf der Grundlage verschiedener Parameter, einschließlich Hämoglobin, Nüchternblutzucker und Lipide im Blut von gesunden erwachsenen Zebrafisch ausgewertet. Zusätzlich haben wir auch bewertet, ob diese Methode eignet sich für Studien, die serielle Proben durch m verlangenBERWACHUNG die zeitlichen Veränderungen der Blutzuckerwerte während der Überfütterung Experimenten.

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Protokoll

Alle tierischen Verfahren wurden von der Ethikkommission der Universität Mie genehmigt und wurden gemäß den japanischen Tierschutzverordnung "Gesetz über die Wohlfahrt und Verwaltung von Animals '(Ministerium für Umwelt, Japan) durchgeführt und mit den internationalen Richtlinien eingehalten werden.

1. Herstellung der Nadel

HINWEIS: Alle Experimente wurden unter Vollnarkose durchgeführt, und alle Anstrengungen unternommen wurden, um das Leiden zu minimieren. Um Sterbehilfe, Fische wurden in einem Eis-Wasser-Bad (at ≤4 ° C 5 Teile Eis / 1 Teil Wasser) für ≥20 min eingetaucht.

  1. Bereiten Sie die Glas Mikrokapillare Nadeln durch Ziehen einer Glaskapillare 1,0-mm-Außendurchmesser mit einer Nadel puller (Abbildung 1A).
  2. Schneiden Sie die Spitzen der Nadeln schräg mit einer feinen Schere (1B). 200 & mgr; m (Abbildung 1c) - der ideale Spitzendurchmesser sollte etwa 100 sein. Wenn die Spitze diameter zu schmal ist, wird Blut nicht in die Nadel.
  3. Aufzulösen Heparin in Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 5 mg / ml.
  4. Legen Sie eine vorgeschnittene Nadel im Objektivrevolver Ende einer Wasserstrahlpumpe Rohranordnung und halten Sie das Mundstück in den Mund, oder schließen Sie die Nadel in einer Glühbirne Spender. Tauchen Sie die Nadelspitze in der Heparin-Lösung und Heparinisierung die Nadel durch Saugen und Blasen durch die Lösung (Abbildung 1D und 1E).
    Hinweis: Das Ansaugrohr Montage für Zebrafisch Spermien Kryokonservierung 16 verwendet. Lange Gummischlauch kann kein Blut fliegen in den Mund zu stoppen. Setzen eines Filters in der Mitte der Röhre können die Gefahren zu vermeiden.
  5. Bewahren Sie die heparinisierte Nadeln in einer 10 cm Petrischale und an der Luft trocknen für mindestens 1 Std. Eine große Anzahl von Nadeln im Voraus vorbereitet werden.

2. Anästhesie

  1. Bereiten Sie die Anästhesielösung in einem kleinen Kunststoffgehäuse durch Mischen von 200 ml Fischwasser mit 100 ul 2-Phenoxyethanol (2-PE). Endkonzentration der Anästhetika ist 500 ppm.
    VORSICHT! 2-PE hat eine schnelle Wirkung.
  2. Entfernen gewünschte Anzahl von Fischen (AB-Stamm) aus dem Kreislauf-System.
  3. Verwenden Sie ein Netz, um die Fische in die Anästhetika für 1 übertragen - 2 min (1F). Beobachten Sie die Fische nach und nach zu schwimmen, zu verbreiten, die Brustflossen horizontal, Keuchen und haben schnelle Operculum Bewegungen innerhalb 1 min.
  4. Wie die Zeit vergeht, beobachten die Fische lagen auf dem Boden des Gehäuses und schließlich zu stoppen Schwimmen. Die chirurgische Ebene der Anästhesie wird erreicht, wenn der Fisch stoppt nach Luft zu schnappen und die Operculum Bewegungen sind langsam. An dieser Stelle ist Fisch bereit für die Blutentnahme.
  5. Mit einem Schaumlöffel heben Sie den narkotisierten Fisch aus dem 2-PE und legen Sie sie vorsichtig auf ein Papiertuch mit den Anästhetika (1G) eingeweicht. Bedecken Sie den Kopf des Fisches mit weichem Tissue-Papier auch mit 2-PE-Lösung getränkt, um Augentrockenheit zu verhindern, und verwenden Sie ein anderes trockenes weiches Seidenpapier vorsichtigtrocknen die Körperoberfläche.

3. Blutentnahme

  1. Legen Sie eine heparinisierte Nadel im Objektivrevolver Ende des Ansaugrohr-Baugruppe (oder der Glühbirne Spender) und halten Sie die Mundstückende des Ansaugrohr Montage in den Mund.
  2. Fassen Sie den Objektivrevolver Ende und die Nadel zusammen, und entfernen Sie vorsichtig die störenden Waagen mit der Nadelspitze. Führen Sie die Nadel in einem 30 - 45 ° Winkel in den Blutsammel Website. Durchstechen des Gastrointestinaltraktes (Figur 1H) vermeiden. Im Falle der Verwendung von Lampenspender, drücken Sie die Lampe mit Daumen und Mittelfinger, und blockieren die Öffnung an der Spitze der Lampe mit dem ersten Finger, und setzen Sie die Nadel wie oben beschrieben.
    Hinweis: Der Ort für die Blutentnahme ist entlang der Körperachse und hinter dem Anus in dem Bereich des dorsalen Aorta. Der dorsalen Aorta (DA) und die hintere Cardinalvene (PCV) nur ventral zur Wirbelsäule (Abbildung 2).
  3. Fangen Sie an, die saugenMundstückende des Ansaugrohres Anordnung, wenn die Nadel zu berühren die Wirbelsäule zu spüren. Wenn Blut steigt nicht, bewegen Sie die Nadelspitze auf subtile Weise von Hand, um die Durchblutung zu fördern. Beachten Sie, dass, wenn Blut in die Nadel steigen, sofort aufhören zu zittern und saugen sanft (1I). Im Falle der Verwendung von Lampenspender, den Druck der Glühbirne, um das Blut zu saugen.
  4. Beachten Sie das Blut langsam pulsatil in die Nadel steigen ohne Absaugung, die wegen der arterielle Blutdruck wahrscheinlich ist. Somit ist es nicht notwendig ist, zu saugen, wenn die Nadel die Arterie richtig eindringt.
  5. Stoppen Absaugung nach dem geeigneten Volumen Blut gesammelt. Entfernen Sie die Nadel aus dem Fisch und drücken Sie die Einstichstelle mit weichem Tissue-Papier, um Blutungen zu stoppen. Beachten Sie die Blutung zu stoppen nach ca. 10 - 20 sec von Fingerdruck (Abbildung 1J).
  6. Nachdem die Blutung gestoppt ist, den Fisch sofort wieder zurück zu übertragen, um eine cleein Warmwasser (~ 28 ° C) Tank. Helfen Sie dem Fisch vorsichtig wirbelnden Wasser zu den Kiemen, bis es anfängt zu schwimmen zu erholen.
    Hinweis: Bewahren Sie bis zu 5 postsampling Fisch in einem 2 l-Tank und verbinden Sie den Tank in den Kreislauf-System, um die Fische mit Sauerstoff zu versorgen. Zugabe von Antibiotika zum Fischwasser nicht erforderlich ist. Pflegen Sie den Fisch mit normaler Haltung und Fütterung.
  7. Vertreibt das Blut von der Nadel auf eine saubere Fläche von einem Stück Parafilm (Abbildung 1 K).
  8. Messen Blutzucker mit jeder kommerziellen Hand glucometer (Abbildung 1 l).
    Anmerkung: Die glucometer verwendet eine Glucose-Dehydrogenase-Flavinadenindinucleotid Elektrode und erfordert ein Probenvolumen von 0,6 & mgr; l.
    1. Legen Sie einen Teststreifen vollständig in das Messgerät und direkt berühren Sie den Blutstropfen. Automatisch Beachten Sie die Blutentnahme in den Teststreifen und erhalten die Blutzucker 5 Sekunden auf der Anzeigefläche. Nehmen Sie das Ergebnis und entsorgen Sie den Teststreifen. Benutze einenneuen Teststreifen für jede Messung.
  9. (optionaler Schritt) Nehmen genaue Mengen von Blut durch eine Pipettiervorrichtung und übertragen das Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen für weitere Analysen (Hämoglobin, Triacylglycerin (TG), Gesamtcholesterin, etc.). Wenn nötig, verdünnen das Vollblut von einem Fisch mit Kochsalzlösung. Zentrifugieren der Blutproben für 3 min bei 680 · g bei RT und Ernte der Plasma. Übertragen des Plasmas in ein neues Röhrchen. An dieser Stelle ist es bereit, in biochemischen Analysen verwendet werden.

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Ergebnisse

Das Blutsammelverfahren bewirkt minimale Verletzung Zebrafisch (ein <1 mm Punktion; Figur 1J) und ergibt eine sehr niedrige Mortalitätsrate von 2,3%. Wir untersuchten das maximale Volumen an Blut, die von einem einzelnen Fisch gesammelt und ausgewertet werden, die die Beziehung um sein Körpergewicht (Abbildung 3) werden könnte. Wir haben festgestellt, dass der maximale Blutvolumen gesammelt wurden linear mit dem Körpergewicht (R = 0,813) korreliert. Das größte Volumen von Blut von ei...

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Diskussion

Wir stellen Ihnen hier eine detaillierte Protokoll zur seriellen Blutentnahme von erwachsenen Zebrafisch. Dieses Verfahren ist einfach durchzuführen und wir sie verwenden im Labor auf einer täglichen Basis. Das Blutsammelverfahren zum Einsetzen einer Glaskapillare Nadel in den Zebrafisch der dorsalen Aorta basiert. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, vorsichtig zu sein, um nicht zu ablatieren die Wirbelsäule, weil sie das Kriterium für die Suche nach der dorsalen Aorta ist. Die Verringerung der Wirbelsäulenverletz...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 und 25590073. Wir bedanken uns bei Frau Yui Namie für die handgezeichnete Illustration und bei Herrn Koshi Kataoka und Frau Sayuri Ichikawa für die Unterstützung bei der Pflege der Zebrafische.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Glaskapillaren mit FilamentNarishigeGD-11,0 mm Außendurchmesser.
NadelabzieherNarishigePC-10Zur Herstellung der Nadeln
HeparinWako Pure Chemical Industries081-00136Für die Heparinisierung
Aspirator SchlauchbaugruppeDrummond2-040-000Für die Blutentnahme
Bulb Dispenser Drummond1-000-9000Für die Blutentnahme
2-PhenoxyethanolWako Pure Chemical Industries163-12075Zur Betäubung von Fischen
DRI-CHEM3500VFujifilm-Zur Hämoglobinmessung
DRI-CHEM ObjektträgerFujifilmHb-WIIZur Hämoglobinmessung
Glutest Neo SuperSanwa Kagaku Kenkyusho-Zur Glukosemessung
Wako L-Typ TG KitWako Pure Chemical Industries464-44201Für TG Messung
Wako L-Typ CHO KitWako Pure Chemical Industries460-44301Für die Messung des Gesamtcholesterins
Parafilm MAlcan PackagingPM996Zum Ausstoßen des Blutes auf

Referenzen

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