Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

Summary

Wir stellen ein Protokoll zellbasierten Neurotransmitter fluoreszierenden Reportern engineered (CNiFERs) zur optischen Erfassung der volumetrischen Neurotransmitter-Freisetzung zu schaffen.

Abstract

Zell-basierte Neurotransmitter fluoreszierende entwickelt Reporter (CNiFERs) bieten ein neues Werkzeug für die Neurowissenschaftler die Freisetzung von Neurotransmittern im Gehirn in vivo zu optisch erfassen. Eine spezifische CNiFER wird aus einer humanen embryonalen Nierenzelle geschaffen , die stabil mit einer spezifischen G Protein-gekoppelten Rezeptor, der Paare G _{q / 11} G – Proteine ​​und ein FRET-basierten Ca ²⁺ -Detektor, TN-XXL ausdrückt. Aktivierung des Rezeptors führt zu einer Erhöhung in der Signal FRET. CNiFERs haben nM Empfindlichkeit und eine zeitliche Reaktion von Sekunden , weil ein CNiFER Klon mit dem nativen Rezeptor für einen bestimmten Neurotransmitter verwendet, zum Beispiel D2R für Dopamin. CNiFERs werden direkt in das Gehirn implantiert, so dass sie die Freisetzung von Neurotransmittern mit einer räumlichen Auflösung von weniger als hundert & mgr; m, so dass sie ideal zur Messung der Volumentransmissions in vivo zu erfassen. CNiFERs kann auch für mögliche andere Arzneimittel zu screenen Kreuzreaktivität in vi verwendet werdenvo. Wir vor kurzem erweitert die Familie der CNiFERs GPCRs , dass Paar G _{i / o} G – Proteine ​​enthalten. CNiFERs zum Erfassen Acetylcholin (ACh), Dopamin (DA) und Norepinephrin (NE) verfügbar. Da jede GPCR verwendet werden kann, ein neues CNiFER zu schaffen, und dass es etwa 800 GPCRs im menschlichen Genom sind, beschreiben wir hier das allgemeine Verfahren zu entwerfen, zu erkennen und zu testen, jede Art von CNiFER.

Introduction

Um vollständig zu verstehen , wie Nervenzellen im Gehirn zu kommunizieren, ist es notwendig , ein Verfahren zu haben , die Freisetzung von Neurotransmittern in vivo zu messen. Es gibt mehrere gut etablierte Techniken für Neurotransmitter in vivo zu messen. Eine üblicherweise verwendete Technik besteht darin , Mikrodialyse, in denen eine Kanüle in das Gehirn eingeführt wird , und ein kleines Volumen von Liquor wird gesammelt und analysiert unter Verwendung von Hochleistungs-Flüssigkeits – Chromatographie und elektrochemische Nachweis ^1. Microdialysis hat eine räumliche Auflösung in der Größenordnung von wenigen Durchmesser der Sonde, zB ~ 0,5 mm für einen 200 & mgr; m Durchmesser Mikro. Die zeitliche Auflösung dieses Verfahrens ist jedoch langsam aufgrund Abtastintervalle , die typischerweise dauern ~ 5 min oder länger ^1. Darüber hinaus werden Analysen nicht in Echtzeit durchgeführt. Eine andere Technik ist schnelles Scannen cyclischer Voltammetrie (FSCV), die eine Kohlenstoff-Fasersonde verwendet, die in das Gehirn eingeführt ist. FSCV hat eine ausgezeichnete Temperaturorale Auflösung (Subsekunden), hohe Empfindlichkeit (nanomolar) und räumliche Auflösung mit Sondendurchmesser von 5 bis 30 um. Allerdings ist FSCV auf Sender begrenzt , die eine charakteristische Oxidations- und Reduktionsprofil mit Spannung auf einem Kohlenstoff – potentiometrischen Sonde ² herzustellen.

Eine dritte Technik Neurotransmitter zu messen , ist direkt über genetisch kodierten Neurotransmitter (NT) Biosensoren ^3. Mit diesem Verfahren wird ein Fusionsprotein geschaffen , das eine Liganden-Bindungsdomäne für einen Sender enthält , der mit einem Fluoreszenz – Resonanz – Energietransfer (FRET) basierende Paar von Fluorophoren ⁴ oder einem permutierten GFP ^5. Im Gegensatz zu den vorherigen beiden Verfahren werden diese Biosensoren genetisch codiert und exprimiert auf der Oberfläche einer Wirtszelle, wie beispielsweise ein Neuron, durch die Produktion von transgenen Tieren oder akut mit der Verwendung von viralen Mitteln Zellen zu infizieren. Bis heute genetisch kodierten Biosensoren nur wurden für detectin entwickeltg Glutamat und GABA ^3-5. Einschränkungen mit diesen Techniken haben die geringe Empfindlichkeit, im nM – Bereich gewesen, und die Unfähigkeit , den Nachweis der großen Anzahl von Sendern, zum Beispiel klassische Neurotransmitter, Neuropeptide und Neuromodulatoren, die durch G – Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) Signal zu erweitern. In der Tat gibt es fast 800 GPCRs in das menschliche Genom.

Um diese Defizite ansprechen, haben wir ein innovatives Werkzeug zur optischen Messung Freisetzung von Neurotransmitter entwickelt, die einen GPCR-Signale durch. CNiFERs (zellbasierten Neurotransmitter fluoreszierenden Reportern engineered) sind klonale Zellen HEK293 engineered einen bestimmten GPCR zu exprimieren, der , wenn er stimuliert, eine Erhöhung der intrazellulären auslöst [Ca ^2+], die durch eine genetisch kodierte FRET-basierten Ca ²⁺ Sensor erfasst wird, TN-XXL. So verwandeln CNiFERs Neurotransmitter-Rezeptor in eine Veränderung der Fluoreszenz-Bindung, eine direkte und Echtzeit-optischen r die Bereitstellungead-out der lokalen Neurotransmitteraktivität. Durch Verwendung des nativen Rezeptors für einen bestimmten Neurotransmitter, behalten CNiFERs die chemische Spezifität, Affinität und zeitliche Dynamik der endogen exprimierter Rezeptoren. Bis heute haben wir geschaffen drei Arten von CNiFERs, einer zum Detektieren Acetylcholin unter Verwendung des M1 – Rezeptor, einer zum Detektieren Dopamin Verwendung des D2 – Rezeptors, und ein zur Erfassung des & alpha; 1A – Rezeptor ^6,7 Noradrenalin verwenden. Die CNiFER Technologie ist leicht erweiterbare und skalierbare es zugänglich für jede Art von GPCR machen. In diesem JoVE Artikel, wir beschreiben und veranschaulichen die Methodik zu entwickeln, erkennen, und in vivo Test CNiFERs für jede Anwendung.

Protocol

Alle Tierverfahren in dieser Studie durchgeführt, sind in Übereinstimmung mit Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien und wurden von den IACUCs an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai und der University of California, San Diego genehmigt. 1. Generieren Sie GPCR-exprimierenden Lentivirus für Transforming HEK293 Zellen Erhalten , die cDNA für einen bestimmten GPCR aus einer kommerziellen Quelle, beispielsweise cdna.org. Alternativ verstärken das GPCR-Gens aus einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung von PCR. Besorgen Sie sich einen Lentivirus-exprimierenden Vektor, wie pcdh-CMV-MCS-EF1-Puro (pcdh). Verwenden Sie diesen Vektor, der die DNA als auch zu propagieren als Lentiviren zu erzeugen. Klonen Sie die GPCR-cDNA in den Lentiviren-exprimierenden Vektor durch PCR. Siehe Lorenz 8, Einzelheiten über PCR Subklonierung. Erweitern und die GPCR-pcdh DNA unter Verwendung eines Endotoxin-frei "maxi" Prep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu reinigen. Bestätigen Sie, dass die GPCR-cDNA subkloniert in pcdh mutations istfrei durch DNA-Sequenzierung. Hinweis: Vor der DNA für die Virusproduktion einreichen, verdauen eines aliquoten mit Enzym geeigneten Restriktions Größe des Einsatzes zu bestätigen und die Reinheit der DNA. Generieren Sie Lentiviren ein Virus Core Facility verwenden, wie man am Salk Institute, University of Penn., Oder University of North Carolina, usw., oder generieren Sie im Haus 9. Verwenden etwa 25 & mgr; g (> 1 ug / ul) von Endotoxin-freie DNA für die Transfektion von HEK-Zellen in einem T75-Kolben. Stellen Sie sicher , dass die DNA von hoher Reinheit ist, ein Absorptionsverhältnis (A 260 / A 280) von ~ 1,8. Anmerkung: Virustiter ~ 10 11 -10 12 GC / ml optimal sind für die Transduktion von HEK293 – Zellen. 2. Die Wahl HEK293 / TN-XXL Backbone Zellentyp für In – vitro – Kultivierung Hinweis: Bestimmen der G – Protein – Spezifität Kopplungs, beispielsweise G i / o, G q / 11 oder G s G – Proteine, der GPCR, da dies dictates, ob ein G-Protein-Chimäre für die CNiFER benötigt wird. Muskarinrezeptors Für G q -gekoppelter Rezeptoren, zB M1, wählen HEK293 / TN-XXL (# 3G8) als Rückgrat HEK293 Zelltyp. Für G i / o -gekoppelter Rezeptoren wird die chimären G – Protein G qi5 10 benötigt. Für G s -gekoppelter Rezeptor, wird die G qs5 Chimäre 10 benötigt. In diesem Protokoll wird die Konstruktion eines D2R CNiFER als Beispiel verwendet. D2R Signale über G i / o G – Proteine ​​und erfordert HEK293 – Zellen, die die chimären G – Protein, G qi5 stabil exprimieren, zB HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6. Besorgen Sie sich die HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 klonalen Zellen , die aus einem Forschungslabor. Hinweis: Die folgenden klonalen Zellen, HEK293 / TN-XXL (# 3G8) für G q -gekoppelter Rezeptoren, HEK293 / TN-XXL / G qi5 (# qi5.6) für G i / o -gekoppelter Rezeptoren und HEK293 / TN -XXL / G qs5 (# qs5.47) für G s -gekoppelter reRezeptoren, sind frei verfügbar auf Anfrage 6,7. Wachsen und zu expandieren HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 zu ~ 90% Konfluenz in einem T25 – Kolben mit 5 ml HEK293 Wachstumsmedium (Tabelle 1). Wachsen die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2. Hinweis: Alle Arbeiten mit HEK293 Kultivierung von Zellen werden unter Verwendung von Standard sterilen Gewebekulturtechniken durchgeführt. Ernten Sie die HEK293-Zellen durch erste Medien von T25-Flasche abgesaugt. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 5 ml PBS Zugabe und Schaukelkolben. Entfernen Sie die PBS und 1 ml 0,05% (w / v) Trypsin / EDTA (Tabelle 2). Inkubieren für 1 bis 2 min bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2. Sammeln Zellen und Transfer 15 ml konischen Röhrchen zu steril. Zentrifuge für 5 min bei 1000 xg in einer Zellkultur-Zentrifuge. Den Überstand aspirieren. Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml HEK293 Wachstumsmedien. Zählen Sie die Zellen in einem Hämozytometer unter Verwendung vonTrypanblau. Berechnen Sie die Zelldichte und gehen Sie zu Schritt 3. 3. Lentivirale Transduktion von HEK293 / TN-XXL / Gqi5 Zellen Seed einen T25 – Kolben mit 0,7 x 10 6 HEK293 / TN-XXL / G qi5 Zellen. Wachsen die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2 , bis ~ 50% konfluent, nach ca. 1 Tag. Frieren verbleibenden Zellen (Schritte 8,2-8,3). Diese Zellen dienen als CNiFER Steuerung, dh ein CNiFER, die den GPCR fehlt. Am Tag der Infektion, verdünnen das GPCR exprimiert Lentivirus (Schritt 1,4) zu einer Endkonzentration von ~ 10 9 GC / ml in einem Gesamtvolumen von 2 ml HEK293 Wachstumsmedium (Tabelle 1). Fügen Sie zum Beispiel 20 & mgr; l 10 11 GC / ml Virus zu 2 ml Medium in einem T25 – Kolben. Hinweis: Der Virustiter Informationen sollten durch das Virus Core Facility zur Verfügung gestellt werden. Kombinieren Lentivirus und Medien in ein Zentrifugenröhrchen und verreiben sanft. Hohe Titer von lentivirus sind Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2). Saugen Sie das Medium aus dem T25-Flasche. Fügen Sie die 2 ml Virus / Medien Mischung aus Schritt 3.2. Inkubieren Sie die T25 – Flasche O / N bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2. Nach einem Tag der Infektion, das Virus / Medium – Gemisch absaugen und ersetzen sie durch HEK293 Wachstumsmedien mit Puromycin (2 ug / ml; Tabelle 1). Puromycin wählt für die transduzierten Zellen. Inkubieren der Kolben bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2 , bis etwa 90% konfluent, nach ca. 1-2 Tagen. Bereiten Sie eine 96-Well-Platte (schwarz mit durchsichtigem Boden) mit Fibronektin beschichtet, zur Erzeugung eines 10-Punkte-Agonist / Aktivierungskurve in Schritt 4.1. In einer sterilen Haube, fügen Sie 50 ul Fibronektin (5 ug / ml) pro Vertiefung in den Reihen A und B der 96-Well-Platte. Die Platte bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Spülen Sie zweimal für 5 Minuten pro Spülung mit PBS. Je 50 ul HEK293 Wachstumsmedien und Inkubieren O / N bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2. Hinweis: Fibronectin behandelten Platten sind im Handel erhältlich. Ernte der Zellen in T25 – Kolben wie in den Schritten 2,3-2,6 (Tabelle 2). Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml HEK293 Wachstumsmedien. Samen ein T25-Kolben mit 1,5 ml der Zellen für die FACS-Analyse. Auch eine T75-Kolben mit 1 ml der Zellen für das Einfrieren und Lagerung von Saatgut (siehe Schritte 8,2-8,3) Für die 10-Punkt-Agonist Kurve, Saatgut den ersten beiden Reihen (A und B) eines Fibronektin-beschichteten 96-Well-Platte (aus Schritt 3.5) mit 100 ul der Zellsuspension pro Vertiefung. Inkubieren HEK293 – Zellen in einem T25 – Kolben wachsen, einem T75 – Kolben und einer Platte mit 96 Vertiefungen bis zu ~ 90% konfluent bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2, nach ca. 1-2 Tagen. 4. FACS und Isolierung einzelner CNiFER Clones Verwenden Sie die 96-Well-Platte einen 10-Punkte-Agonist Aktivierungskurve zu erzeugen. Hinweis: Vor dem fluoreszenzaktivierten Zellstartsortierung (FACS) -Analyse, es wichtig ist, die zur BestätigungExpression des GPCR von transduzierten Zellen für einen Agonisten Antwort Test (10-Punkte-Agonisten Kurve). Dieser Test wird mit einem fluorimetrischen Plattenleser. Bereiten Sie eine Droge Platte für die 10-Punkte-Agonisten Aktivierungskurve. Wählen , 10 verschiedene Agonisten Konzentrationen , die die vorhergesagte Halterung 50 EG, die aus der Literatur bestimmt werden kann. Hinweis: Die Droge Platte enthält 3-fache jeder Konzentration (in zweifacher Ausfertigung) für die 1 einzustellen: 3 Verdünnung in der CNiFER Platte. Beispielsweise enthält das Medikament Platte eine D2 CNiFER zum Testen von 10 verschiedenen Konzentrationen von Dopamin bei 3-facher Konzentration; 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50 und 1000 nM. In der CNiFER Platte, daher sind die Endkonzentrationen von Dopamin 0,067, 0,167, 0,333, 1,00, 1,67, 3,33, 6,67, 10,0, 16,7 und 333 nM. Bereiten Sie die Agonisten – Lösungen unter Verwendung von künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) (Tabelle 1). Verwenden Sie zwei Brunnen für 'ACSF', zB A1 und A2,und zwei Brunnen für 'ohne Zellen ", zum Beispiel, B1 und B2. Hinweis: Bereiten verschiedenen Konzentrationen von Medikamenten mit einer Reihenverdünnungsverfahren. Erstellen Sie eine Vorlage Spur von CNiFER Klone zu halten und die Wirkstoffkonzentrationen (Abbildung 3). Verwenden Sie die Software, um die 96-Well-fluorometrische Plattenleser zu programmieren für FRET Messung und Lösungstransfers durchführen. Stellen Sie den Plattenleser Temperatur auf 37 ° C. FRET mit TN-XXL Zur Messung, stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 436 ± 4,5 nm (Mitte ± HWHM). Stellen Sie die Emissionsfilter auf 485 ± 7,5 nm für eCFP und auf 527 ± 7,5 nm für Citrine. Stellen Sie den Cutoff-Filter 475 und 515 nm für eCFP und Citrine sind. Programmieren der Plattenleser Emission bei 485 nm und 527 nm alle 4 Sekunden für insgesamt 180 Sekunden zu messen. Wählen Sie die Option 50 & mgr; l aus dem 3-fach Arzneimittel Platte zu den 100 & mgr; l in der CNiFER Platte zu liefern, nach dem Sammeln von 30 Sekunden vonBaseline-Fluoreszenz. Saugen Sie das Medium aus Reihen A und B und fügen 100 ul ACSF auf die 96-Well-Platte, die CNiFER ~ 90% konfluent (Schritt 3.9) ist. Laden Sie die 96-Well-CNiFER Platte und die "3-fach" Drogenplatte in den Plattenleser. Erlauben ~ 30 min, die Platten bei 37 ° C äquilibrieren. Dann starten Sie das Programm. Um Plattenleser Daten exportieren die Fluoreszenzwerte in eine Tabelle zu analysieren. Erstellen Sie eine Formel, um die Hintergrundmessungen zu subtrahieren (für jedes Signal aus Vertiefungen ohne Zellen aufgenommen) aus Brunnen mit CNiFERs. Normalisieren Fluoreszenzintensitäten Pre-Stimulus Basislinien, F Citrine (t) / F Citrine (Baseline), und berechnen Sie die FRET – Verhältnis (& Delta; R / R;. Eqn 1) die Spitzenantworten bei 527 nm und 485 nm Emissions (siehe Schritt 11 ). Hinweis: Wenn in & Delta; R / R mit dem Agonisten eine wesentliche Änderung ist, dann zeigt dies die Expression des GPCR und man kann auf die FACS-Analyse (Schritt 4.2) um fortzufahren. Wenn there ist kein FRET Reaktion mit Agonisten, zu beheben , indem ein Ca 2+ Ionophor unter Verwendung von zB A21387, die Ca 2+ Reaktion zu testen , und dass FRET-basierten Sensor bestätigen arbeitet. Wenn der Ionophor funktioniert, dann wurde der Rezeptor nicht wahrscheinlich, ausgedrückt. Am Tag vor FACS, bereiten vier 96-Well-Platten mit Fibronektin beschichtet (siehe Schritt 3.5) für die sortierten Zellen zu sammeln. Je 50 ul HEK293 Wachstumsmedien und Inkubieren O / N bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2. Bereiten 5% (w / v) BSA in PBS (5 g / 100 ml) und Filter (0,2 um) in eine sterile Flasche. Ernten Sie die Zellen in der T25 – Kolben gezüchtet (siehe Schritte 2,3-2,5, Tabelle 2). Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml von 5% (w / v) BSA in PBS. Zentrifugieren der Zellen bei 1000 × g für 5 min. Aspirieren die Medien und Zellpellet in ~ 5 ml von 5% (w / v) BSA in PBS zu einer Endkonzentration von ~ 5 × 10 6 Zellen / ml zu ergeben. Hinweis: Prüfen Sie mit der FACS Core Facility für spezifische Anforderungen an die Zelldichte und Sortierbedingungen. Filtern Sie die resuspendierten Zellen mit einer 40 & mgr; m Zelle Sieb, um die Klumpen zu entfernen. Übertragung der Zellen auf eine 5 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen. Das Röhrchen auf Eis für den Transport zur FACS-Anlage. Sortieren Sie die transduzierten HEK 293-Zellen in einer FACS-Anlage. Programm die Parameter auf einem FACS Durchflußzytometer wie folgt: Satz 4 ° C für den Probenhalter, 100 & mgr; m für die Düse und 20 psi. Basierend auf der Pre-Sortieranalyse, markieren Sie die Zellen, das heißt, wählen Sie ein "Tor", die eine große eCFP Fluoreszenz haben (eCFP Anregung, eCFP Emission) und große FRET (eCFP Anregung, Citrine Emission) Fluoreszenz (siehe Ergebnisse unten, Abbildung 2 ). Deposit einzelnen, sortierten Zellen in eine 96-Well-Platte, hergestellt in Schritt 4.2, mit einem Klon pro Vertiefung 50 ul HEK293 Wachstumsmedien mit Puromycin enthält. In 50 ul HEK293 Wachstumsmedien mit Puromycin (Table 1) für eine Gesamtmenge von 100 & mgr; l pro Vertiefung. Pflegen Zellen O / N bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2. Hinweis: HEK293 Nährmedien Puromycin für die Selektion von transduzierten Zellen enthält. 5. Die Anzucht und Erweiterung der Sorted, Geklonte CNiFERs Pflegen Sie die CNiFERs in den 96-Well – Platten mit 50 ul alten Medien aus jeder Vertiefung entfernt und ersetzt mit 50 ml frisches HEK293 Wachstumsmedien enthält Puromycin (Tabelle 1). Wiederholen Sie diesen Vorgang alle 5 bis 7 Tage, bis ~ 90% konfluent, nach 2-3 Wochen. Ernte CNiFER Zellen durch sanft die Medien abgesaugt und einmal vorsichtig mit PBS spülen. Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 20 ul von 0,05% (w / v) Trypsin / EDTA. Inkubieren für 1 bis 2 min bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2. Füge 100 & mgr; l Wachstumsmedium HEK293 Trypsin-behandelten Zellen und die Zellen zu resuspendieren. Übertragen Inhalt auf eine 24-Well-Platte mit 400 & mgr; l frisch HEK293 Nährmedien with Puromycin. In der 24-Well-Platte, pflegen Zellen durch 250 ul HEK293 Wachstumsmedium ersetzt alle 5-7 Tage bis Brunnen sind ~ 90% konfluent. 6. Identifizieren Candidate CNiFERs Basierend auf FRET Antwort Mit Fluorometrische Plate Reader Hinweis: Mit vier 96-Well-Platten FACS folgende, sollte es> 100 prüfbar Klone, die an die 24-Well-Platte Bühne überleben und zu erweitern, da viele der ursprünglichen Klone wachsen scheitern. Zur Identifizierung potentieller Kandidat CNiFERs, verwenden Sie einen 3-Punkt – Analyse für die FRET – Reaktion mit artverwandten Agonisten, zum Beispiel Dopamin für D2R. Wenn die Zellen sind ~ 90% konfluent in der 24-Well-Platte, aspirieren sanft den Medien. Hinzufügen ~ 100 & mgr; l 0,05% (w / v) Trypsin / EDTA und Inkubation für 1-2 min bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2. In 400 ul HEK293 Wachstumsmedien zu Trypsin-behandelten Zellen und mischen Sie die Zellen durch vorsichtiges Zerreiben. Richten Sie die 3-Punkt-Agonisten Kurve für die ersten Screening des CLOang. Für jeden CNiFER Klon, das heißt, einer der Vertiefungen der Platte mit 24 Vertiefungen, Aliquot 100 ul der Zellsuspension (ca. 4 x 10 3 Zellen / Vertiefung) in jede von drei Vertiefungen, beispielsweise A1, A2, A3, der eine Fibronektin-beschichteten 96-Well-Platte (schwarz mit durchsichtigem Boden) (siehe Schritt 3.5). Übertragung der verbleibenden ~ 200 & mgr; l der Zellsuspension in eine 12-Well-Platte mit 1000 & mgr; l Wachstumsmedium HEK293 (1,2 ml Endvolumen). Inkubieren beide Platten bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2, bis ~ 90% konfluent. Die 96-Well-Platte für die fluorometrische Assay und die 12-Well-Platte ist für den Anbau und die Klone expandiert. Für die 3-Punkt – Analyse, bestimmen drei verschiedenen Konzentrationen von Agonisten , die 0,1- sind, 1,0- und 10-fachen der 50 EG für die spezifische GPCR. Bereiten Agonisten Konzentrationen in einer Droge Platte als 4.1.1-4.1.2 in Schritten beschrieben. Führen Sie einen fluorimetrischen Plattenleser Assay als 4.1.3-4.1.5 in Schritten beschrieben. Berechnen Sie die FRET-Verhältnis (& Delta; R / R), wie in Schritt 4.1.6 beschrieben. Wählen Sie CNiFERs die entsprechende Empfindlichkeit und größte FRET Antwort für die Expansion haben, das Einfrieren zurück, und umfassendere Analysen (Schritt 7). Für die Klone, die in Schritt ausgewählt wurden 6,5 und werden in der 12-Well-Platte wachsen, zu entfernen und 600 ul der HEK293 Nährmedien konfluenten alle 5 bis 7 Tage, bis ~ 90% ersetzen. Erweitern den Klonen aus einer 12-Well – Platte zu einer 6-Well – Platte, und dann in einen T25 – Kolben (Schritte von 2,3 bis 2,6 und Tabelle 2). Wenn die T25-Flasche ist ~ 90% konfluent, Ernten der Zellen, wie beschrieben (Schritte 2,3-2,5). Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml HEK293 Wachstumsmedien. 1 ml der Zellsuspension in einem T75-Kolben mit 9 ml HEK293 Wachstumsmedien. Verwenden Sie die restlichen 4 ml der Zellsuspension für Kryokonservierung und Lagerung in flüssigem N 2 (Schritte 8,2-8,3). Bereiten Sie acht 1,5 ml Kryoröhrchen und auf Eis. In dem T75-Kolben aufrechtzuerhalten Zellen durch Ersetzen der Medien with frischen HEK293 Wachstumsmedien, zB 10 ml alle 3-5 Tage bis 70-80% konfluent, nach ca. 1-2 Wochen. 7. Die endgültige Auswahl des CNiFER Klone Mit Fluorometrische Plate Reader Am Tag vor dem Plattenleser Test: Ernten Sie die Zellen aus einer ~ 90% konfluent T75 – Flasche (siehe Schritte 2,3-2,6, Tabelle 2). Samen ein 96-Loch – Fibronektin-beschichtete Platte (schwarz mit durchsichtigem Boden) bei 5 x 10 4 / Vertiefung mit ~ 100 & mgr; l der Zellsuspension. Hinweis: Ein Klon wird verteilt in einer einzigen 96-Well-Platte. Bereiten Sie eine Droge Platte für die umfassende Überprüfung von CNiFER Klone, spezifischen Agonisten Antworten von unspezifischen CNiFER Antworten zu unterscheiden. Um eine volle Dosis-Wirkungs-Kurve zu erzeugen, wählen Sie 10 verschiedene Agonisten Konzentrationen um den vorhergesagten EC 50. Verwenden Sie zwei Vertiefungen für "ohne Zellen" und zwei Brunnen für 'ACSF'. unspezifische Reaktionen zur Bestimmung wählen three Konzentrationen von 12 verschiedenen Neurotransmittern oder Modulatoren (72 Vertiefungen) (Abbildung 3). Wie der Agonist enthält die Arzneimittelplatte 3-fach-Konzentrationen in zweifacher Ausfertigung. Beispielsweise 100 & mgr; l von drei verschiedenen Konzentrationen von Acetylcholin, Glutamat, Orexin, VIP, Adenosin, Serotonin, Norepinephrin, GABA, Substance P, Melatonin, Somatostatin und Histamin, die jeweils mit einer 3-fach-Konzentration von 50, 1.000 und 3.000 nM werden in die Platte mit 96 Vertiefungen Wirkstoff beladen. Stellen Sie die Parameter auf dem fluorimetrischen Plattenleser für FRET Messung und Durchführung Lösung Transfers wie 4.1.3-4.1.5 in Schritten beschrieben. Für die volle Dosis-Wirkungs-Kurve zu analysieren, berechnen die Spitzen FRET-Verhältnis (& Delta; R / R) (Schritt 4.1.6), die Handlung als Funktion der log-Agonisten-Konzentration und passen mit der Hill-Gleichung (Schritt 11.4). Bestimmen Sie die EC 50, Hill – Koeffizient, und die maximale FRET – Verhältnis. Für die 12 anderen Neurotransmittern / Modulatoren, Grundstück Spitzen & Delta; R / R als Funktion of Wirkstoffkonzentration. Wählen ~ 10 CNiFER Klone , die eine große FRET – Verhältnis aufweisen, eine entsprechende EC 50 für die kognate Agonist, und wenig oder keine Hintergrundantworten auf andere Neurotransmitter – Agonisten (unspezifische Antwort). 8. Gefrier zurück Ausgewählte CNiFER Clones Verwenden Sie eine ~ 90% konfluent T75-Flasche eines einzelnen CNiFER Klon. Ernte Zellen wie beschrieben (Schritte 2,3-2,5, Tabelle 2). Für Zellen, Einfrieren, Resuspendieren in 5 ml Wachstumsmedium HEK293 Zellpellet. Beschriften zehn 1,5 ml Kryoröhrchen und setzen auf Eis. Zur Kryoprotektion, Mischungs Zellen 1: 1 mit 20% (v / v) DMSO in HEK293 Wachstumsmedien, beispielsweise 5 ml der 20% (v / v) DMSO / Medium – Gemisch vorsichtig mit 5 ml der Zellsuspension vermischt wird (endgültige Konzentration von DMSO beträgt 10%). Aliquot 1 ml in jede der Kryoröhrchen. Gefriert Röhrchen mit Zellen in einem -80 ° C Gefrierschrank O / N, in einem schaumisolierten Box (siehe Materialien). Transfer Kryoröhrchen zu LIQUid Stickstoff zur Langzeitlagerung. 9. CNiFER Implantierung in Maus Cortex Sterilisieren alle chirurgische Instrumente in einem Autoklaven vor der Operation. Bereiten Sie eine semi-sterilen Bereich für die Operation, indem sie mit 70% Ethanol abgewischt und zur Schaffung eines sauberen Labor Windel nach unten. Bereiten Sie die CNiFER Injektionspipette durch eine Glaskapillare (id von 0,53 mm) Ziehen an einer vertikalen Elektrode Abzieher. Verwenden Sie ein Paar nicht. 5 Feinspitze Zange die Spitze der Elektrode mit einem Durchmesser von ~ 40 & mgr; m zu brechen. Hinweis: Dies wird am besten unter einem Stereo-Zoom-Mikroskop mit einem Raster durchgeführt. Anästhesieren einen Erwachsenen (postnataler Tag 60-90) C57BL / 6-Maus mit Isofluran: 4% (v / v) für die Induktion und 1,5 bis 2,0% (v / v) für die Wartung. Verwenden Schwanz oder Zehen Prise, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt. Hinweis: Re-Pinch in regelmäßigen Abständen und Whisker Zucken im gesamten Operation beurteilen Narkosetiefe neu zu bewerten. Decken Sie die Augen mit Augensalbe zu prevent Trocknen. Montieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen mit Ohr-Bars. Pflegen Sie die Maus Körpertemperatur bei 37 ° C ein Heizkissen durch eine rektale Sonde geregelt werden. Shave eine Fläche von etwa 5 mm bis 12 mm mit einem Tier Elektrorasierer. Apply Betadine um 70% (v / v) Isopropanol. Verwenden Sie ein Skalpell zu schneiden und die Haut über der Schädeloberfläche zu entfernen. Verwenden, um eine Skalpellklinge das Periost von der Oberfläche des Schädels zu entfernen. Expose und reinigen Sie die Oberfläche des Schädels, wie für stereotaktische Operation 11 beschrieben. Senken Sie eine leere Glaspipette zu Bregma und die anteroposteriore (A / P) und mediolaterale (M / L) Koordinaten aufzeichnen. Bezugnehmend auf die Mausgehirnatlas, die Berechnung der Position der Injektionsstelle. Verschieben Sie die Pipette an den Zielort und markieren Sie den Schädel für nachfolgende Fenster Bildung. Siehe Cetin et al. Einzelheiten zur stereotaktischen Injektionen mit Nagetieren 11. Hinweis: Die Injektionsstelle und Fenster sind abhängig von der Ausrichtungion untersucht und die Verteilung von Neurotransmittern oder Peptid freisetzende Vorsprünge in der Hirnrinde werden. Beispielsweise in einer neueren Veröffentlichung 7 koordiniert die stereotaxische 1,0-2,0 mm A / P und 1,0 bis 2,0 mm M / L verwendet wurden CNiFER Zellen in frontalen Kortex für in vivo Bildgebung von Dopamin – Freisetzung während der klassischen Konditionierung einzuspritzen . Bilden Sie einen 2 mm x 3 mm ausgedünnten Schädel Fenster wie zuvor 12,13 beschrieben. Hinweis: Die Knochen im Fenster sollte 15-20 um dick sein. Die kleinen weißen Flecken in den Knochen sollte nicht sichtbar sein , wenn die Schädeloberfläche befeuchtet, wenn der Knochen ausreichend 12,13 verdünnt wird. Legen Sie eine ACSF getränkten Schwamm auf dem Fenster, um es feucht zu halten, während Zellen Vorbereitung zu injizieren. Ernten Sie die CNiFER Klon, der in einem T75-Kolben gezüchtet wurde auf ~ 80% Konfluenz. Absaugen die Medien und die Zellen mit sterilem PBS waschen. Hinweis: Trypsin für diese Schritte weggelassen. Entfernen PBS und verwenden 10 ml of ACSF Zellen vom Boden des Kolbens zu entfernen. Man reibt Zellen Zellklumpen zu distanzieren. Zentrifuge und das Pellet in 100 ul ACSF resuspendieren. Zentrifuge für 30 Sekunden bei 1.400 xg und entfernen Sie den Überstand, so dass ein Pellet in ACSF bedeckt. Dieser Schritt lässt einen Klumpen von Zellen in Suspension. Verfüllen die Injektionspipette hergestellt in Schritt 9.2 mit Mineralöl, laden Sie die Pipette auf eine nanoinjector, und rückt den Kolben eine kleine Perle von Öl auszuwerfen. Setzen 5 ul CNiFER Zellsuspension auf einem Streifen aus Kunststoffparaffinfilm in der Nähe der Maus Zubereitung. Zeichnen Sie sich entweder die CNiFERs oder CNiFER Zellen in die gezogen Pipette steuern. Bewegen der Pipette zum Ziel X und Y – Koordinaten, das heißt, A / P und M / L festgestellt in Schritt 9.5. Senken Sie die Pipette, die ausgedünnten Schädel-Piercing, und weiter auf ~ 200-400 & mgr; m unter der Schädeloberfläche, CNiFER Zellen in Schichten 2/3 der Hirnrinde zu deponieren. Injizieren ~ 4.6 nl von CNiFER Zellen an der tiefsten Stelle mit dem nanoinjector, beachten Sie Bewegung in der Öl- und Zelloberfläche und dann für 5 Minuten für die Zellen warten zu verzichten. Ziehen Sie die Pipette ~ 100 & mgr; m und injizieren eine andere ~ 4.6 nl von CNiFER Zellen, warten 5 Min. Zurückziehen dann die Pipette langsam und vorsichtig Rückstau der CNiFERs zu verhindern. Wiederholen Injektion an einer oder mehreren benachbarten Stellen. Wiederholen Sie die Schritte Injektion 9,8-9,12 mit Steuer HEK293 – Zellen (dh HEK293 / TN-XXL / G qi5 Klon fehlt GPCR). Trennen Sie die CNiFER und steuern Zellinjektionsstellen von ~ 200 & mgr; m. Nach der Zellimplantationen Abschluss, spülen Sie die ausgedünnten Schädel Fenster mit ACSF und warten Sie auf den Schädel zu trocknen. Geben Sie einen Tropfen Sekundenkleber (siehe Materialien) über das Fenster und legen Sie schnell eine vorgeschnittene sterile Deckglas oben auf den Leim. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas gegen den Schädel für ein paar Sekunden. Lassen Sie den Kleber trocknen 2 min 12,13. Seal die Ränder des Deckglases mit Zahnzement und Form awell um das Fenster Wasser für das Tauch Ziel zu halten. Für die Maus des Kopfes Immobilisierung während der Bildgebung, fügen Sie eine maßgeschneiderte Kopf-Bar mit einem kleinen Tropfen Sekundenkleber hinter dem Fenster (14 Einzelheiten zur Dimension und Materialien sehen). Lassen Sie den Leim trocknen gründlich und fügen Sie dann weitere Dentalzement, um die maßgeschneiderte Kopf-Bar stärken. Decken Sie den Rest der Schädeloberfläche, mit Ausnahme der Fenster, mit einer Schicht aus Zahnzement. Stellen Sie die Ränder der Haut sicher von Zement bedeckt sind und lassen Sie es für 20 Minuten trocknen lassen. Im Anschluss an die Operation, Isofluran Verwaltung stoppen und mit der Maus auf einem Heizkissen in einem Käfig verlassen, bis er aus der Narkose vollständig erholt. Injizieren Sie 5% (w / v) Glukose in Kochsalzlösung (sc) für die Rehydrierung und 0,05 bis 0,1 mg / kg Buprenorphin (ip, Instant-Release) für die postoperative Analgesie. Hinweis: Um mögliche immunologische Reaktion auf die menschliche CNiFERs minimieren, injizieren die Maus täglich mit 20 & mgr; l / 100 g Cyclosporin (ip) am Tag vor der Injektion von CNiFERs beginnen. Bringen Sie die Maus in seinen Heimkäfig für Nahrung und Wasser. 10. In – vivo – Bildgebung von CNiFER Clones Hinweis: Live-Bildgebung mit Mäusen führte eine Zwei-Photonen-Mikroskop und einem Kopf-festen Vorrichtung verwendet wird. Keine Anästhesie während der Imaging-Sitzungen benötigt. Wenn die Tiere im Wachzustand Bebilderung begrenzen Kopfstütze in einer Zeit, ein paar Stunden nur Stress zu reduzieren. Bringen Sie das Tier, um es zu Hause Käfig zwischen Imaging-Sitzungen für Nahrung und Wasser. Potenzielle Stress wird durch Verdunkelung die Raumbeleuchtung und der umgebenden Teil der Maus in einem Gehäuse minimiert. Am Tag nach der Operation, montieren Sie die Maus auf einer Imaging-Plattform durch den Metallkopf-Bar auf dem Schädel an den Rahmenkopffixierung implantiert zu schrauben. Hinweis: Wenn Sie wach Mäuse Bildgebung, die Imaging-Sitzung nicht ein paar Stunden wegen der möglichen Stress induziert durch den Kopf-Rückhalteeinrichtung nicht überschreiten sollte. Legen Sie die Imaging-Plattform mit dem Kopf bändigen Maus in einem Zwei-Photonen-Imaging-Mikroskop mit 10-facher (0,30 NA) und 40x (0,80 NA) Wassertauchziele. Einfügen Filterwürfel für FRET imaging (eCFP und Citrine), die einen dichroitischen Spiegel bei 505 nm und Bandpassfiltern aufweist, die zur Messung eCFP und 520 nm bis 560 nm zum Messen Citrine 460 nm bis 500 nm umfassen. In ACSF auf den gut ausgedünnten Schädel Fenster enthält, und das Eintauchen in Wasser Ziel in das ACSF senken. Verwenden Sie das Okular in Verbindung mit Quecksilberlampe und GFP-Filterwürfel, die Oberfläche des Kortex und Vaskulatur unter dem Fenster zu lokalisieren. Hinweis: Das Muster der Vaskulatur unterstützt lokalisieren und Bild die gleiche Region in wiederholten Tagen Bildgebung. Wechseln Sie in das Wasser eintauchen Ziel 40X CNiFERs zu finden, indem Sie manuell die Konzentration auf Oberfläche der Hirnrinde in den Zellen unter Verwendung des GFP-Filterwürfel und eine Quecksilberlampe. Richten Sie für Zwei-Photonen-Imaging. Wählen Sie die apchenden Lichtweg für Zwei-Photonen-Imaging. Für ein typisches kommerzielles System, verwenden Sie die Software auf zwei-Photonen-Imaging-Modus zu wechseln und Licht zu den Photomultiplier (PMT) in den nichtdescannten Detektoren umleiten. Schalten Sie den nahen Infrarot-Femtosekunden gepulsten Lasers, wählen Sie eine Wellenlänge von 820 nm und eine Leistungseinstellung von 5 bis 15%. Hinweis: 5% Leistung liefert typischerweise ~ 25 mW an der Probe. Stellen Sie die PMT1 & PMT2 Spannung nahe dem Maximalwert, typischerweise 700-1000 V an der PMT abhängig. Stellen Sie die Verstärkung auf 1 für jeden Kanal und Null die z-Position für das Ziel. Senken Sie die Ziel ~ 100 bis 200 & mgr; m von der kortikalen Oberfläche und starten Sie die xy-Scan. Stellen Sie die Laserleistung, Verstärkung und PMT – Spannung für jeden Kanal, das heißt eCFP und Citrine, um das Signal-Rausch – Verhältnis der CNiFER Fluoreszenz zu optimieren. Verwenden Sie die Zoom-Funktion in der Software das Bild auf eine Region zu beschränken, die die CNiFER Zellen sowie eine backgroun enthältd Region. Verwenden Sie eine Abtastrate nicht langsamer als ein Rahmen alle 2 Sek (0,5 Hz) bei 4 & mgr; s pro Pixel. Passen Sie die Linie im Durchschnitt für geeignete Signal-zu-Rausch – Verhältnis, zB Kalman 2 Linie Mittelung. Zeichnen Sie eine Region-of-Interest (ROI) um CNiFER Zellen, rund um ca. 3 bis 4 Zellen pro Ebene. Echtzeit-Analyse von ROI mittleren Intensitäten einrichten. Starten Erwerb CNiFER Fluoreszenz über die Zeit zu überwachen. Sammeln von Fluoreszenz CNiFERs vor und während der experimentellen Manipulationen, beispielsweise eine elektrische Stimulation, Stimulation ChR2, Verhalten, wie durch den Benutzer bestimmt. Wenn die Abbildungs ​​Experiment beendet ist, kehren Sie mit der Maus in seinen Heimkäfig. Wiederholen Sie die Abbildung über Tage, wie gewünscht. Beim erneuten Abbilden der Zellen auf die zuvor erworbenen Nieder Vergrößerung Gefäß Bild beziehen sich auf das gleiche Bildfeld (Schritt 10.4) zu orientieren zurück. Hinweis: Implantierte CNiFERs kann für mindestens 7 Tage abgebildet werden. 11. Datenanalyse </p> Öffnen Sie Imaging-Datei und wählen Sie ROIs für CNiFERs und ein ROI für den Hintergrund. Wählen Sie "Reihenanalyse" für beide Kanäle jedes ROI. Export durchschnittliche Fluoreszenzintensität für jeden ROI als tabstoppgetrennte Datei. Verwenden Sie eine mathematische Software (siehe Materialien) Programm Fluoreszenzwerte zu analysieren. Tiefpassfilter (0.3 Hz) jedes Signal und dann die Fluoreszenz-Intensitäten der Hintergrundfluoreszenz in jedem ROI von eCFP und Citrine subtrahieren. Berechnen durchschnittliche Fluoreszenz für Baseline und Verhältnisse zu berechnen, wie in Gleichung 1 beschrieben, um die FRET-Verhältnis & Delta; R (t) / R zu messen. die Empfindlichkeit der CNiFERs, zeichnen Sie die FRET-Verhältnis als Funktion der log-Agonisten-Konzentration zu bestimmen. Fit mit der Hill – Gleichung , die EC 50 und Hill – Koeffizienten (n) unter Verwendung von wissenschaftlichen Statistik – Software und der Hill – Gleichung (Gleichung 2) zu bestimmen.

Representative Results

A CNiFER wird aus einer menschlichen embryonalen Nieren (HEK 293) -Zellen abgeleitet , die stabil konstruiert ist mindestens zwei Proteine ​​zu exprimieren: eine spezifische G-Protein – gekoppelten Rezeptor (GPCR) und eine genetisch kodierte [Ca 2+] Sensor, TN-XXL. TN-XXL erfährt Fluoreszenz – Resonanz – Energie – Transfer (FRET) zwischen Cyan und Gelb fluoreszierende Proteine, eCFP und Citrine jeweils als Antwort auf Ca 2+ -Ionen 6,15. Die Aktivieru…

Discussion

Die Schaffung von CNiFERs bietet eine innovative und einzigartige Strategie zur optischen Messung Freisetzung von Neurotransmittern im Gehirn in vivo. CNiFERs zur Messung extrasynaptischen Freisetzung ideal geeignet, dh Volumenleitung, für Neurotransmitter. Wichtig ist, besitzt jede CNiFER die Eigenschaften des nativen GPCR, eine physiologische optischen Messung der Veränderungen der Konzentrationen von Neurotransmittern im Gehirn bereitstellt. Bisher wurden CNiFERs Acetylcholin (M1-CNiFER) ^6,</…

Materials

pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro	System Biosciences	CD510B-1	Cloning: for generating lentivirus
12×75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube	BD Biosciences	352063	FACS
BD 40 um Falcon cell strainers	BD Biosciences	352340	FACS
0.05% Trypsin EDTA	Invitrogen	25200056	FACS
96 Well Plate, flat bottom, clear	Corning	3596	FACS
96 well cell culture plates	Corning	CLS3997	Flexstation
Optilux black clear bottom	Corning	3603	Flexstation
Flexstation pipet tips	Molecular Devices	9000-0911	Flexstation
Acetylcholine Chloride	SimgaAldrich	A2661	Flexstation
Norepinephrine	SimgaAldrich	A7256	Flexstation
Dopamine Hydrochloride	SimgaAldrich	PHR1090	Flexstation
GABA	SimgaAldrich	A2129	Flexstation
Histamine	SimgaAldrich	H7125	Flexstation
Glutamate	SimgaAldrich	49621	Flexstation
Epinephrine	SimgaAldrich	E4642	Flexstation
Somatostatin	SimgaAldrich	S1763	Flexstation
5HT	SimgaAldrich	H9523	Flexstation
VIP	Alpha Diagnostics Inc.	SP-69627	Flexstation
Orexin A	Alpha Diagnostics Inc.	12-p-01	Flexstation
Substance P	SimgaAldrich	S6883	Flexstation
Adenosine	SimgaAldrich	A4036	Flexstation
Melatonin	SimgaAldrich	M5250C	Flexstation
Fluorescence Plate Reader & software	Molecular Devices	Flexstation 3	Flexstation
DMEM (high glucose) with Glutamax	Life Technologies	10569-010	Tissue culture
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082-139	Tissue culture
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Tissue culture
Puromycin	InvivoGen	ant-pr-1	Tissue culture
Fibronectin	SimgaAldrich	F0895	Tissue culture
CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box	Bioexpress	D-3508)	Tissue culture
cyanoacrylate glue	Loctite	Loctite no. 495	surgery and stereotaxic injection
plastic paraffin film	VWR	Parafilm®	surgery and stereotaxic injection
NANOINJECTOR	Drummond	3-000-204	surgery and stereotaxic injection
GLASS ELECTRODES	Drummond	3-000-203G	surgery and stereotaxic injection
hand held drill	OSADA	Exl-M40	surgery and stereotaxic injection
Burrs for drill	Fine Scientific	19007-05; 19007-07)	surgery and stereotaxic injection
Sterilizing bath	FST	18000-45, Hot Bead Sterilizer	surgery and stereotaxic injection
isoflurane chamber/mask	Highland Medical Equipment	564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm	surgery and stereotaxic injection
3D scope with arm	Zeiss		surgery and stereotaxic injection
fiber optic light			surgery and stereotaxic injection
Betadine			surgery and stereotaxic injection
70 % (v/v) isopropyl alcohol			surgery and stereotaxic injection
Povidone-Iodine Prep Pads	dynarex	1108	surgery and stereotaxic injection
NaCl 0.9% (INJECTION, USP, 918610)			surgery and stereotaxic injection
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP)			surgery and stereotaxic injection
Buprenex (INJECTION) buprenorphine (0.03 μg per g rodent)	Sigma		surgery and stereotaxic injection
Ophthalmic ointment	Akorn	NDC 17478-235-35	surgery and stereotaxic injection
Surgifoam	Ethicon		surgery and stereotaxic injection
Grip dental cement	Dentsply	#675571, 675572	surgery and stereotaxic injection
Instant SuperGlue	NDindustries		surgery and stereotaxic injection
LOCTITE 4041			surgery and stereotaxic injection
METABOND	C&B		surgery and stereotaxic injection
no. 0 cover glass	Fisher		surgery and stereotaxic injection
stereotaxic frame	Kopf		surgery and stereotaxic injection
Rectal probe and heating pad	FHC	40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe	surgery and stereotaxic injection
optical breadboard for imaging	Thorlabs		surgery and stereotaxic injection
Mineral oil	Fisher	S55667	surgery and stereotaxic injection
Kwik-Cast (Silicone elastomer)	World Precision Instruments		surgery and stereotaxic injection
Suture	Ethicon	18’’, 1667, 4-0	surgery and stereotaxic injection
Scissors	Fine Scientific Tools	91500-09, 15018-10	surgery and stereotaxic injection
Forcepts	Fine Scientific Tools	11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10	surgery and stereotaxic injection
Student Halsted-Mosquito Hemostats	Fine Scientific Tools	91308-12	surgery and stereotaxic injection
Small Vessel Cauterizer Kit	Fine Scientific Tools	18000-00	surgery and stereotaxic injection
Hot Bead Sterilizers	Fine Scientific Tools	18000-45	surgery and stereotaxic injection
Instrument Case with Silicone Mat	Fine Scientific Tools	20311-21	surgery and stereotaxic injection
Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat	Fine Scientific Tools	20810-01	surgery and stereotaxic injection
2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging	Olympus	FV1200 MPE	in vivo imaging
Multiphoton laser	SpectraPhysics	Mai Tai DeepSee	in vivo imaging
Green Laser	Olympus	473 nm Laser	in vivo imaging
xy translation base	Scientifica	MMBP	in vivo imaging
FRET filter cube for YFP and CFP	Olympus		in vivo imaging
25-X water immersion objective	Olympus		in vivo imaging
air table	Newport		in vivo imaging
custom built light-tight cage	Thorlab		in vivo imaging