Name: Der Bau der Zellbasierte Neurotransmittern Fluorescent Engineered Reporter (CNiFERs) zur optischen Erfassung von Neurotransmittern In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Konstruktion von CNiFERs zur optischen Erfassung von Neurotransmittern in vivo mit HEK293-Zellen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring von Neuromodulator-Dynamiken im Gehirn.

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Wir danken B. Conklin (University of California, San Francisco) für die Bereitstellung der G qi5 und G qs5 cDNAs, A. Schweitzer für die Unterstützung bei der Elektronik, N. Taylor für die Unterstützung bei Screening von Klonen, Ian Glaaser und Robert Rifkin für Korrekturlesen und Olivier Griesbeck für TN-XXL. (; DA037170 DA029706), dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffmann-La Roche (88610A) und der &quot;Neuroscience Diese Arbeit wurde durch Forschungsförderung durch den US-amerikanischen National Institute on Drug Abuse (NIDA) unterstützt Bezug zu Drogen von Missbrauch &quot;Ausbildungsförderung durch NIDA (DA007315).

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Schaffung von CNiFERs bietet eine innovative und einzigartige Strategie zur optischen Messung Freisetzung von Neurotransmittern im Gehirn in vivo. CNiFERs zur Messung extrasynaptischen Freisetzung ideal geeignet, dh Volumenleitung, für Neurotransmitter. Wichtig ist, besitzt jede CNiFER die Eigenschaften des nativen GPCR, eine physiologische optischen Messung der Veränderungen der Konzentrationen von Neurotransmittern im Gehirn bereitstellt. Bisher wurden CNiFERs Acetylcholin (M1-CNiFER) 6,</su...

Um vollständig zu verstehen , wie Nervenzellen im Gehirn zu kommunizieren, ist es notwendig , ein Verfahren zu haben , die Freisetzung von Neurotransmittern in vivo zu messen. Es gibt mehrere gut etablierte Techniken für Neurotransmitter in vivo zu messen. Eine üblicherweise verwendete Technik besteht darin , Mikrodialyse, in denen eine Kanüle in das Gehirn eingeführt wird , und ein kleines Volumen von Liquor wird gesammelt und analysiert unter Verwendung von Hochleistungs-Flüssigkeits - Chromatographie und elektrochemische Nachweis 1. Microdialysis hat eine räumliche Auflösung in der Größenordnung von wenigen Durchmesser der Sonde, zB ~ 0,5 mm für einen 200 &amp; mgr; m Durchmesser Mikro. Die zeitliche Auflösung dieses Verfahrens ist jedoch langsam aufgrund Abtastintervalle , die typischerweise dauern ~ 5 min oder länger 1. Darüber hinaus werden Analysen nicht in Echtzeit durchgeführt. Eine andere Technik ist schnelles Scannen cyclischer Voltammetrie (FSCV), die eine Kohlenstoff-Fasersonde verwendet, die in das Gehirn eingeführt ist. FSCV hat eine ausgezeichnete Temperaturorale Auflösung (Subsekunden), hohe Empfindlichkeit (nanomolar) und räumliche Auflösung mit Sondendurchmesser von 5 bis 30 um. Allerdings ist FSCV auf Sender begrenzt , die eine charakteristische Oxidations- und Reduktionsprofil mit Spannung auf einem Kohlenstoff - potentiometrischen Sonde 2 herzustellen. Eine dritte Technik Neurotransmitter zu messen , ist direkt über genetisch kodierten Neurotransmitter (NT) Biosensoren 3. Mit diesem Verfahren wird ein Fusionsprotein geschaffen , das eine Liganden-Bindungsdomäne für einen Sender enthält , der mit einem Fluoreszenz - Resonanz - Energietransfer (FRET) basierende Paar von Fluorophoren 4 oder einem permutierten GFP 5. Im Gegensatz zu den vorherigen beiden Verfahren werden diese Biosensoren genetisch codiert und exprimiert auf der Oberfläche einer Wirtszelle, wie beispielsweise ein Neuron, durch die Produktion von transgenen Tieren oder akut mit der Verwendung von viralen Mitteln Zellen zu infizieren. Bis heute genetisch kodierten Biosensoren nur wurden für detectin entwickeltg Glutamat und GABA 3-5. Einschränkungen mit diesen Techniken haben die geringe Empfindlichkeit, im nM - Bereich gewesen, und die Unfähigkeit , den Nachweis der großen Anzahl von Sendern, zum Beispiel klassische Neurotransmitter, Neuropeptide und Neuromodulatoren, die durch G - Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) Signal zu erweitern. In der Tat gibt es fast 800 GPCRs in das menschliche Genom. Um diese Defizite ansprechen, haben wir ein innovatives Werkzeug zur optischen Messung Freisetzung von Neurotransmitter entwickelt, die einen GPCR-Signale durch. CNiFERs (zellbasierten Neurotransmitter fluoreszierenden Reportern engineered) sind klonale Zellen HEK293 engineered einen bestimmten GPCR zu exprimieren, der , wenn er stimuliert, eine Erhöhung der intrazellulären auslöst [Ca 2+], die durch eine genetisch kodierte FRET-basierten Ca 2+ Sensor erfasst wird, TN-XXL. So verwandeln CNiFERs Neurotransmitter-Rezeptor in eine Veränderung der Fluoreszenz-Bindung, eine direkte und Echtzeit-optischen r die Bereitstellungead-out der lokalen Neurotransmitteraktivität. Durch Verwendung des nativen Rezeptors für einen bestimmten Neurotransmitter, behalten CNiFERs die chemische Spezifität, Affinität und zeitliche Dynamik der endogen exprimierter Rezeptoren. Bis heute haben wir geschaffen drei Arten von CNiFERs, einer zum Detektieren Acetylcholin unter Verwendung des M1 - Rezeptor, einer zum Detektieren Dopamin Verwendung des D2 - Rezeptors, und ein zur Erfassung des &amp; alpha; 1A - Rezeptor 6,7 Noradrenalin verwenden. Die CNiFER Technologie ist leicht erweiterbare und skalierbare es zugänglich für jede Art von GPCR machen. In diesem JoVE Artikel, wir beschreiben und veranschaulichen die Methodik zu entwickeln, erkennen, und in vivo Test CNiFERs für jede Anwendung.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&nbsp;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>Klonierung: zur Erzeugung von Lentiviren</td></tr><tr><td>12 x 75 *BD Falcon Polypropylen Reagenzglas mit rundem Boden mit hoher Klarheit</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um Falcon Zellsiebe</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0,05% Trypsin EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 Well Platte, flacher Boden, klar&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3596</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatten&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux schwarz klarer Boden&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Flexstation Pipettenspitzen</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Acetylcholinchlorid&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2661</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Noradrenalin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Dopaminhydrochlorid&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Histamin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Glutamat &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adrenalin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Somatostatin&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&nbsp;</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Substanz P&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adenosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Melatonin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Fluoreszenzplatten-Reader & Software</td><td>Molecular Devices</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM (hoher Glukosespiegel) mit Glutamax&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Gewebekultur</td></tr><tr><td>&nbsp; Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139</td><td>Gewebekultur</td></tr><tr><td>&nbsp; Kugelschreiber/Strektik&nbsp; Antibiotika</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Gewebekultur</td></tr><tr><td>&nbsp; Puromycin&nbsp; &nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>Gewebekultur</td></tr><tr><td>&nbsp; Fibronektin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Gewebekultur</td></tr><tr><td>CoolCell LX Alkoholfreie Zellgefrierbox mit kontrollierter Rate</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td><td></td>Gewebekultur-Cyanacrylat-Kleber</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Loctite</td><td>Loctite Nr. 495</td><td>für Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>von Kunststoff-Paraffinfilm&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Parafilm&reg;</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Nanoinjektor</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Glaselektroden</td><td>Drummond</td><td>3-000-203G</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Handbohrer</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Grate für Bohrer</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05; 19007-07)</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Sterilisationsbad</td><td>FST</td><td>18000-45, Heißperlen-Sterilisator</td><td>für Chirurgie und stereotaktische Isofluran-Injektionskammer</td></tr><tr><td>/-maske</td><td>Highland Medical Equipment</td><td>564-0427, HME 109 Tisch-Anästhesiegerät mit Isofluran-Verdampfer, O2-Durchflussmesser, Gang-Ventil; 564-0852, Induktionskammer 16 x 7 x 7,5 cm</td><td>für Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion 3D-Zielfernrohr mit Arm</td><td>Zeiss-Chirurgie</td><td></td><td>und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Faseroptische Lichtchirurgie</td><td></td><td></td><td>und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>70 % (v/v) Isopropylalkohol</td><td></td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Povidon-Jod Prep Pads</td><td>Dynarex</td><td>1108</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>NaCl 0,9 % (Injektion, USP, 918610)</td><td></td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion CYCLOSPORIN (INJEKTION, USP)</td><td></td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Buprenex (Injektion) Buprenorphin (0,03 &mu; g pro g Nagetier)</td><td>Sigma-Aldrich-Chirurgie</td><td></td><td>und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Ophthalmische Salbe&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Surgifoam</td><td>Ethicon</td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Grip Zahnzement</td><td>Dentsply</td><td>#675571, 675572</td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Instant SuperGlue&nbsp;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C& B</td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Nr. 0 Deckglas</td><td>Fisher</td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>stereotaktischer Rahmen&nbsp;</td><td>Kopfchirurgie</td><td></td><td>und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Rektumsonde und Heizkissen</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, DC Temperature Controller, 40-90-2-06, 6,5 x 9,5 cm Heizkissen40-90-5D-02, Rektalthermistor</td><td>Sondenchirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>optisches Steckbrett für die Bildgebung</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Fisher</td><td>S55667</td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Kwik-Cast (Silikonelastomer)</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Naht&nbsp; &nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>18' ', 1667, 4-0</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Student Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91308-12</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Small Vessel Cauterizer Kit</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-00</td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Hot Bead Sterilisatoren</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-45</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Instrumentenkoffer mit Silikonmatte</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20311-21</td> für <td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Sterilisationsbehälter aus Kunststoff mit Silikonmatte</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20810-01</td> für <td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>2P-Fluoreszenzendoskop mit festem Tisch für die in vivo-Bildgebung</td><td>Olympus</td><td>FV1200 MPE</td><td>In-vivo-Bildgebung</td></tr><tr><td>Multiphotonenlaser</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>Green Laser</td><td>Olympus</td><td>473 nm Laser</td><td>in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>xy translationale Basis</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>FRET Filter Würfel für YFP und CFP</td><td>Olympus</td><td></td><td>in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>10x und 40x Wasserimmersionsobjektive</td><td>Olympus</td><td></td><td>in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>Lufttisch</td><td>Newport</td><td></td><td>in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>kundenspezifischer lichtdichter Käfig</td><td>Thorlab</td><td></td><td>in vivo Bildgebung</td></tr></tbody></table>

der bau der zellbasierte neurotransmittern fluorescent engineered reporter (cnifers) zur optischen erfassung von neurotransmittern<em&gt; in vivo</em

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Zell-basierte Neurotransmitter fluoreszierende entwickelt Reporter (CNiFERs) bieten ein neues Werkzeug für die Neurowissenschaftler die Freisetzung von Neurotransmittern im Gehirn in vivo zu optisch erfassen. Eine spezifische CNiFER wird aus einer humanen embryonalen Nierenzelle geschaffen , die stabil mit einer spezifischen G Protein-gekoppelten Rezeptor, der Paare G q / 11 G - Proteine ​​und ein FRET-basierten Ca 2+ -Detektor, TN-XXL ausdrückt. Aktivierung des Rezeptors führt zu einer Erhöhung in der Signal FRET. CNiFERs haben nM Empfindlichkeit und eine zeitliche Reaktion von Sekunden , weil ein CNiFER Klon mit dem nativen Rezeptor für einen bestimmten Neurotransmitter verwendet, zum Beispiel D2R für Dopamin. CNiFERs werden direkt in das Gehirn implantiert, so dass sie die Freisetzung von Neurotransmittern mit einer räumlichen Auflösung von weniger als hundert &amp; mgr; m, so dass sie ideal zur Messung der Volumentransmissions in vivo zu erfassen. CNiFERs kann auch für mögliche andere Arzneimittel zu screenen Kreuzreaktivität in vi verwendet werdenvo. Wir vor kurzem erweitert die Familie der CNiFERs GPCRs , dass Paar G i / o G - Proteine ​​enthalten. CNiFERs zum Erfassen Acetylcholin (ACh), Dopamin (DA) und Norepinephrin (NE) verfügbar. Da jede GPCR verwendet werden kann, ein neues CNiFER zu schaffen, und dass es etwa 800 GPCRs im menschlichen Genom sind, beschreiben wir hier das allgemeine Verfahren zu entwerfen, zu erkennen und zu testen, jede Art von CNiFER.

A CNiFER wird aus einer menschlichen embryonalen Nieren (HEK 293) -Zellen abgeleitet , die stabil konstruiert ist mindestens zwei Proteine ​​zu exprimieren: eine spezifische G-Protein - gekoppelten Rezeptor (GPCR) und eine genetisch kodierte [Ca 2+] Sensor, TN-XXL. TN-XXL erfährt Fluoreszenz - Resonanz - Energie - Transfer (FRET) zwischen Cyan und Gelb fluoreszierende Proteine, eCFP und Citrine jeweils als Antwort auf Ca 2+ -Ionen 6,15. Die Aktivierung vo...

Wir stellen ein Protokoll zellbasierten Neurotransmitter fluoreszierenden Reportern engineered (CNiFERs) zur optischen Erfassung der volumetrischen Neurotransmitter-Freisetzung zu schaffen.

Der Bau der Zellbasierte Neurotransmittern Fluorescent Engineered Reporter (CNiFERs) zur optischen Erfassung von Neurotransmittern<em&gt; In Vivo</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, die Methodik zur Herstellung und Prüfung von zellbasierten fluoreszierenden Neurotransmitter-Sensoren, auch bekannt als CNiFERs, zu beschreiben, die zur optischen Überwachung der Freisetzung spezifischer Neurotransmitter in vivo verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaften bezüglich des zeitlichen Ablaufs und der Freisetzung von Neuromodulatoren im Gehirn zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie für jeden Typ von Neurotransmittern oder Neuromodulatoren angepasst werden kann, die über GPCR signalisieren.Die regionale Demonstration dieser Methode ist hilfreich. Die in-vivo-Injektion und anschließende Bildgebung von CNiFERs ist technisch anspruchsvoll. Um dieses Verfahren zu beginnen, betrachten Sie die HEK293-Zellen, die den kalziumbasierten Detektor und das chimäre G-Protein in einem T-25-Fläschchen enthalten.Anschließend die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 bis zu einer Konfluenz von etwa 50 % kultivieren. Danach das Medium aus dem T-25-Kolben absaugen. Zwei Milliliter der Lentavirus-Medium-Mischung hinzufügen und den T-25-Kolben bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren.Am nächsten Tag die infizierten HEK293-Zellen ernten, indem ein Milliliter Trypsin hinzugefügt wird. Anschließend den Zellpellet in fünf Millilitern HEK293-Wachstumsmedium resuspendieren. Ein Milliliter Zellen in einem T-75-Fläschchen zum Einfrieren und Lagern ansäen und 1,5 Milliliter Zellen in einem T-25-Fläschchen für die FACS-Analyse ansäen.Für die 10-Punkte-Agonistenkurve, um die infizierten Zellen zu testen, die ersten beiden Reihen einer mit Fibronectin beschichteten 96-Loch-Platte mit jeweils 100 Mikrolitern der Zellsuspension pro Loch beimpfen. Anschließend die in einem T-25-Fläschchen, einem T-75-Fläschchen und einer 96-Loch-Platte wachsenden HEK293-Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 für ein bis zwei Tage inkubieren, bis sie etwa 90 % konfluent sind. Vor der FACS-Analyse die funktionelle Expression des GPCR bestimmen, indem eine Wirkstoffplatte mit 10 unterschiedlichen Agonistenkonzentrationen vorbereitet wird, die den vorhergesagten EC50-Wert umschließen.Stellen Sie verschiedene Konzentrationen des Agonisten mithilfe einer seriellen Verdünnungsmethode her und erstellen Sie eine Vorlage, um die Arzneimittelkonzentrationen nachverfolgen zu können. Stellen Sie anschließend die Temperatur des Plattenlesegeräts auf 37 Grad Celsius ein. Programmieren Sie danach das fluorometrische 96-Well-Plattenlesegerät zur Messung von FRET und zur Durchführung von Lösungsübertragungen.Zur Messung des FRET mit einem genetisch kodierten, auf FRET basierenden Kalziumsensor, TNXXL, stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 436 ± 4,5 Nanometer ein. Danach stellen Sie die Emissionsfilter und die Sperrfilter für ECFP und Citrin ein. Programmieren Sie anschließend den Plattenreader, um alle vier Sekunden die Emissionen über insgesamt 180 Sekunden zu messen.Wählen Sie die Optionen für ein Volumen der 100-Mikroliter-Platte, eine Pipettierhöhe von 150 Mikrolitern und die Abgabe von 50 Mikrolitern Wirkstoff aus der dreifachen Komponentenplatte. Legen Sie den Zeitpunkt der Wirkstoffabgabe auf 30 Sekunden fest. Danach saugen Sie das Medium aus den Reihen A und B ab und geben 100 Mikroliter ACSF auf die 96-Well-Snifferplatte, die etwa zu 90 % konfluent ist. Danach die dreifache Medikamentenplatte und die 96-Well-Snifferplatte in das Plattenlesegerät einlegen. Die Platten vor dem Starten des Programms 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius equilibrieren lassen. Nach dem Durchlauf des Plattenlesegeräts die Fluoreszenzlesewerte in eine Textdatei exportieren.Importieren Sie anschließend diese Datei in eine zuvor erstellte Tabellenvorlage, die die Fluoreszenzintensitäten auf die Basislinien vor der Stimulation normiert, das maximale FRET-Verhältnis für jede Agonistenkonzentration berechnet und eine Dosis-Wirkungs-Kurve erstellt. Bereiten Sie die CNiFER-Injektionspipette vor, indem Sie eine Glas-Kapillare auf einen vertikalen Elektrodenzieher setzen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze der Elektrode auf einen Durchmesser von etwa 40 Mikrometern zu brechen.Legen Sie einen mit ACSF getränkten Schwamm auf ein zuvor angefertigtes zwei mal drei Millimeter großes dünnes Schädel-Fenster einer anästhesierten Maus, um es feucht zu halten, während die Zellen für die Injektion vorbereitet werden. Danach gewinnen Sie den CNiFER-Klon, der in einem T-75-Fläschchen bis zu einer Konfluenz von etwa 80 % kultiviert wurde. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit steriler PBS.Entfernen Sie PBS und verwenden Sie 10 Milliliter ACFS, um die Zellen vom Boden des Kolbens zu lösen. Anschließend werden die Zellen pipettierend dispergiert, um Zellklumpen aufzulösen. Zentrifugieren Sie zwei Minuten in einer Zellkulturzentrifuge.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern ACSF. Zentrifugieren Sie anschließend 30 Sekunden bei 1400 × g und entfernen Sie den Überstand, wobei ein in ACSF bedecktes Pellet zurückbleibt. Danach füllen Sie die Injektionspipette mit Mineralöl auf.Befestigen Sie die Pipette an einem Nanoinjektor. Geben Sie fünf Mikroliter der CNiFER-Zellsuspension auf einen Streifen aus Paraffinfolie in der Nähe der Mausbearbeitung. Ziehen Sie die CNiFER-Zellen in die gezogene Pipette ein.Bewegen Sie die Pipette nun zu den Zielkoordinaten x und y. Senken Sie die Pipetten ab und durchbohren Sie den zuvor präparierten d&uuml;nnwandigen Sch&auml;del. Fahren Sie fort bis etwa 200 bis 400 Mikrometer unterhalb der Sch&auml;delfl&auml;che, in die Schichten zwei und drei der Hirnrinde.Injizieren Sie 4,6 Nanoliter CNiFER-Zellen mit dem Nano-Injektor an der tiefsten Stelle. Achten Sie auf die Bewegung an der Grenzfläche zwischen Öl und Zellen. Warten Sie anschließend fünf Minuten, bis die Zellen abgegeben wurden.Ziehen Sie die Pipette etwa 100 Mikrometer zurück und injizieren Sie weitere 4,6 Nanoliter CNiFER-Zellen; warten Sie anschließend erneut fünf Minuten. Danach ziehen Sie die Pipette langsam und vorsichtig zurück, um einen Rückfluss der CNiFERs zu verhindern. Platzieren Sie bei diesem Verfahren die Bildgebungsplattform mit der fixierten Maus unter ein 10x-Wasser-Immersion-Objektiv in einem Zwei-Photonen-Bildgebungsmikroskop.Setzen Sie den Filterwürfel für die FRET-Bildgebung ein, der einen Dichroitspiegel bei 505 Nanometern und Bandpassfilter umfasst, die von 460 Nanometern bis 500 Nanometern für die Messung von ECFP und von 520 Nanometern bis 560 Nanometern für die Messung von Citrin reichen. Anschließend geben Sie ACSF in die Vertiefung, die das dünne Schädel-Fenster enthält, und senken das 10x-Wasserimmersionsobjektiv in das ACSF ab. Nutzen Sie das Okular in Verbindung mit der Quecksilberlampe und dem GFP-Filterwürfel, um die CNiFERs zu lokalisieren.Wechseln Sie nun zum 40x-Wasserimmersionsobjektiv. Wählen Sie danach den geeigneten Lichtpfad für die Zwei-Photonen-Bildgebung aus. Schalten Sie den Nahinfrarot-Femtosekunden-Pulslaser ein.Wählen Sie die Wellenlänge von 820 Nanometern und eine Leistungseinstellung von fünf bis 15 %. Stellen Sie die Spannung des PMT eins und des PMT zwei auf einen submaximalen Wert ein, typischerweise 500–1000 Volt, abhängig vom PMT. Danach stellen Sie den Verstärkungsfaktor (Gain) für jeden Kanal auf eins ein und setzen die z-Position des Objektivs auf null. Senken Sie das Objektiv etwa 100 bis 200 Mikrometer von der kortikalen Oberfläche ab und beginnen Sie den xy-Scan.Stellen Sie die Laserleistung, den Verstärkungsfaktor und die PMT-Spannung für jeden Kanal so ein, dass das Signal-Rausch-Verhältnis der Fluoreszenz der CNiFER-Zellen optimiert wird. Begrenzen Sie anschließend mithilfe der Software die Aufnahme auf einen Bereich, der die CNiFER-Zellen sowie einen Hintergrundbereich enthält. Wählen Sie die Cowman-Linie mit einer Mittelung von zwei für ein geeignetes Signal-Rausch-Verhältnis und verwenden Sie eine Abtastrate von 3 bis 1 Hertz bei vier Mikrosekunden pro Pixel.Zeichnen Sie danach eine ROI um die CNiFER-Zellen. Umgeben Sie etwa drei bis vier Zellen pro Ebene. Richten Sie die Echtzeitanalyse der durchschnittlichen Intensitäten der ROI ein.Danach beginnen Sie die Datenaufnahme, um die Fluoreszenz der CNiFER über die Zeit zu überwachen, und starten Sie die elektrische Stimulation oder das Verhaltensexperiment, während Sie den FRET überwachen. In diesem Beispiel wurde die FRET-Antwort von D2R-CNiFERs mit einem Plattenreader und einem Lösungszufuhrsystem gemessen. Dieses Diagramm zeigt die FRET-Antwort während der Applikation von Dopamin an D2-CNiFERs.Beachten Sie, dass die ECFP-Emission bei Dopamin abnimmt, während die Citrin-Emission zunimmt. Hier sehen Sie eine Darstellung des entsprechenden FRET-Verhältnisses. Dargestellt sind hier die Dosis-Wirkungs-Kurven für die Reaktion von D2-CNiFERs auf Dopamin und Noradrenalin.Außerdem wird die reaktionsfähige Kontroll-CNiFERs ohne D2R präsentiert. Dieses Balkendiagramm zeigt die FRET-Verhältnisreaktion auf andere Neurotransmitter und Modulatoren bei 50 Nanomolar und einem Mikromolar. Hier führt die elektrische Stimulation von DA-Neuronen in der Substantia nigra zu einer starken Änderung des FRET-Verhältnisses bei D2-CNiFERs.Beachten Sie, wie die Amplitude der Antwort mit zunehmender Intensität der elektrischen Stimulation ansteigt. Die Kombination der Stimulation mit einer Kokaininjektion verstärkt die CNiFER-Antwort. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man CNiFERs zur in-vivo-Bildgebung erzeugt, testet und verwendet.Während der gesamten Entwicklung von CNiFERs ist es unerlässlich, sterile Techniken anzuwenden, da diese Zellen letztendlich in lebende Mäuse implantiert werden. Die Realisierung von CNiFERs stellt ein wichtiges Werkzeug für die Forschung im Bereich der Neurowissenschaften dar, um die Freisetzung jedes Neurotransmitters oder Neuromodulators, der über einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor signalisiert, optisch zu messen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Der Bau der Zellbasierte Neurotransmittern Fluorescent Engineered Reporter (CNiFERs) zur optischen Erfassung von Neurotransmittern In Vivo (Video) | JoVE Journal

Der Bau der Zellbasierte Neurotransmittern Fluorescent Engineered Reporter (CNiFERs) zur optischen Erfassung von Neurotransmittern

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