Name: Der Bau der Zellbasierte Neurotransmittern Fluorescent Engineered Reporter (CNiFERs) zur optischen Erfassung von Neurotransmittern In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Konstruktion von CNiFERs zur optischen Erfassung von Neurotransmittern in vivo mit HEK293-Zellen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring von Neuromodulator-Dynamiken im Gehirn.

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Wir danken B. Conklin (University of California, San Francisco) für die Bereitstellung der G qi5 und G qs5 cDNAs, A. Schweitzer für die Unterstützung bei der Elektronik, N. Taylor für die Unterstützung bei Screening von Klonen, Ian Glaaser und Robert Rifkin für Korrekturlesen und Olivier Griesbeck für TN-XXL. (; DA037170 DA029706), dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffmann-La Roche (88610A) und der &quot;Neuroscience Diese Arbeit wurde durch Forschungsförderung durch den US-amerikanischen National Institute on Drug Abuse (NIDA) unterstützt Bezug zu Drogen von Missbrauch &quot;Ausbildungsförderung durch NIDA (DA007315).

<ol><li>Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+vivo.+microdialysis+to+the+study+of+cholinergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems.</a> Methods. 23, 21-39 (2001).</li>
<li>Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+subsecond+dopamine+release+with+fast-scan+cyclic+voltammetry+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo.</a> Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Chemical+Neurotransmission+with+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors.</a> ACS Chem Neurosci. , (2015).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extrasynaptic+glutamate+dynamics+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+fluorescent+probe+for+visualizing+glutamate+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission.</a> Nat Methods. 10, 162-170 (2013).</li>
<li>Nguyen, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+biosensor+for+neurotransmitter+release+and+in+situ+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity.</a> Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).</li>
<li>Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+reporters+reveal+in+vivo+dynamics+of+dopamine+and+norepinephrine+release+in+murine+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex.</a> Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. , e3998(2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq%CE%B1+to+that+of+Gj%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).</li>
<li>Yamauchi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+ligand-gated+ion+channel+receptors+with+genetically+encoded+Ca2%2B+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors.</a> PLoS One. 6, e16519(2011).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+during+action+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation.</a> Nature. 494, 238-242 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Schaffung von CNiFERs bietet eine innovative und einzigartige Strategie zur optischen Messung Freisetzung von Neurotransmittern im Gehirn in vivo. CNiFERs zur Messung extrasynaptischen Freisetzung ideal geeignet, dh Volumenleitung, für Neurotransmitter. Wichtig ist, besitzt jede CNiFER die Eigenschaften des nativen GPCR, eine physiologische optischen Messung der Veränderungen der Konzentrationen von Neurotransmittern im Gehirn bereitstellt. Bisher wurden CNiFERs Acetylcholin (M1-CNiFER) 6,</su...

Um vollständig zu verstehen , wie Nervenzellen im Gehirn zu kommunizieren, ist es notwendig , ein Verfahren zu haben , die Freisetzung von Neurotransmittern in vivo zu messen. Es gibt mehrere gut etablierte Techniken für Neurotransmitter in vivo zu messen. Eine üblicherweise verwendete Technik besteht darin , Mikrodialyse, in denen eine Kanüle in das Gehirn eingeführt wird , und ein kleines Volumen von Liquor wird gesammelt und analysiert unter Verwendung von Hochleistungs-Flüssigkeits - Chromatographie und elektrochemische Nachweis 1. Microdialysis hat eine räumliche Auflösung in der Größenordnung von wenigen Durchmesser der Sonde, zB ~ 0,5 mm für einen 200 &amp; mgr; m Durchmesser Mikro. Die zeitliche Auflösung dieses Verfahrens ist jedoch langsam aufgrund Abtastintervalle , die typischerweise dauern ~ 5 min oder länger 1. Darüber hinaus werden Analysen nicht in Echtzeit durchgeführt. Eine andere Technik ist schnelles Scannen cyclischer Voltammetrie (FSCV), die eine Kohlenstoff-Fasersonde verwendet, die in das Gehirn eingeführt ist. FSCV hat eine ausgezeichnete Temperaturorale Auflösung (Subsekunden), hohe Empfindlichkeit (nanomolar) und räumliche Auflösung mit Sondendurchmesser von 5 bis 30 um. Allerdings ist FSCV auf Sender begrenzt , die eine charakteristische Oxidations- und Reduktionsprofil mit Spannung auf einem Kohlenstoff - potentiometrischen Sonde 2 herzustellen. Eine dritte Technik Neurotransmitter zu messen , ist direkt über genetisch kodierten Neurotransmitter (NT) Biosensoren 3. Mit diesem Verfahren wird ein Fusionsprotein geschaffen , das eine Liganden-Bindungsdomäne für einen Sender enthält , der mit einem Fluoreszenz - Resonanz - Energietransfer (FRET) basierende Paar von Fluorophoren 4 oder einem permutierten GFP 5. Im Gegensatz zu den vorherigen beiden Verfahren werden diese Biosensoren genetisch codiert und exprimiert auf der Oberfläche einer Wirtszelle, wie beispielsweise ein Neuron, durch die Produktion von transgenen Tieren oder akut mit der Verwendung von viralen Mitteln Zellen zu infizieren. Bis heute genetisch kodierten Biosensoren nur wurden für detectin entwickeltg Glutamat und GABA 3-5. Einschränkungen mit diesen Techniken haben die geringe Empfindlichkeit, im nM - Bereich gewesen, und die Unfähigkeit , den Nachweis der großen Anzahl von Sendern, zum Beispiel klassische Neurotransmitter, Neuropeptide und Neuromodulatoren, die durch G - Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) Signal zu erweitern. In der Tat gibt es fast 800 GPCRs in das menschliche Genom. Um diese Defizite ansprechen, haben wir ein innovatives Werkzeug zur optischen Messung Freisetzung von Neurotransmitter entwickelt, die einen GPCR-Signale durch. CNiFERs (zellbasierten Neurotransmitter fluoreszierenden Reportern engineered) sind klonale Zellen HEK293 engineered einen bestimmten GPCR zu exprimieren, der , wenn er stimuliert, eine Erhöhung der intrazellulären auslöst [Ca 2+], die durch eine genetisch kodierte FRET-basierten Ca 2+ Sensor erfasst wird, TN-XXL. So verwandeln CNiFERs Neurotransmitter-Rezeptor in eine Veränderung der Fluoreszenz-Bindung, eine direkte und Echtzeit-optischen r die Bereitstellungead-out der lokalen Neurotransmitteraktivität. Durch Verwendung des nativen Rezeptors für einen bestimmten Neurotransmitter, behalten CNiFERs die chemische Spezifität, Affinität und zeitliche Dynamik der endogen exprimierter Rezeptoren. Bis heute haben wir geschaffen drei Arten von CNiFERs, einer zum Detektieren Acetylcholin unter Verwendung des M1 - Rezeptor, einer zum Detektieren Dopamin Verwendung des D2 - Rezeptors, und ein zur Erfassung des &amp; alpha; 1A - Rezeptor 6,7 Noradrenalin verwenden. Die CNiFER Technologie ist leicht erweiterbare und skalierbare es zugänglich für jede Art von GPCR machen. In diesem JoVE Artikel, wir beschreiben und veranschaulichen die Methodik zu entwickeln, erkennen, und in vivo Test CNiFERs für jede Anwendung.

<table><tbody><tr><td>pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro&nbsp;</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>Klonierung: zur Erzeugung von Lentiviren</td></tr><tr><td>12 x 75 *BD Falcon Polypropylen Reagenzglas mit rundem Boden mit hoher Klarheit</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS</td></tr><tr><td>BD 40 um Falcon Zellsiebe</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>FACS</td></tr><tr><td>0,05% Trypsin EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96 Well Platte, flacher Boden, klar&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3596</td><td>FACS</td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatten&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS3997</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Optilux schwarz klarer Boden&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3603</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Flexstation Pipettenspitzen</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0911</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Acetylcholinchlorid&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2661</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Noradrenalin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7256</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Dopaminhydrochlorid&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1090</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>GABA&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Histamin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Glutamat &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adrenalin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4642</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Somatostatin&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1763</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>5HT&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>VIP&nbsp;</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SP-69627</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Orexin A</td><td>Alpha Diagnostics Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>12-p-01</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Substanz P&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6883</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Adenosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Melatonin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5250C</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>Fluoreszenzplatten-Reader & Software</td><td>Molecular Devices</td><td>Flexstation 3</td><td>Flexstation</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM (hoher Glukosespiegel) mit Glutamax&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Gewebekultur</td></tr><tr><td>&nbsp; Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>10082-139</td><td>Gewebekultur</td></tr><tr><td>&nbsp; Kugelschreiber/Strektik&nbsp; Antibiotika</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Gewebekultur</td></tr><tr><td>&nbsp; Puromycin&nbsp; &nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td>Gewebekultur</td></tr><tr><td>&nbsp; Fibronektin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Gewebekultur</td></tr><tr><td>CoolCell LX Alkoholfreie Zellgefrierbox mit kontrollierter Rate</td><td>Bioexpress</td><td>D-3508)</td><td></td>Gewebekultur-Cyanacrylat-Kleber</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Loctite</td><td>Loctite Nr. 495</td><td>für Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>von Kunststoff-Paraffinfilm&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Parafilm&reg;</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Nanoinjektor</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Glaselektroden</td><td>Drummond</td><td>3-000-203G</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Handbohrer</td><td>OSADA</td><td>Exl-M40</td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Grate für Bohrer</td><td>Fine Scientific</td><td>19007-05; 19007-07)</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Sterilisationsbad</td><td>FST</td><td>18000-45, Heißperlen-Sterilisator</td><td>für Chirurgie und stereotaktische Isofluran-Injektionskammer</td></tr><tr><td>/-maske</td><td>Highland Medical Equipment</td><td>564-0427, HME 109 Tisch-Anästhesiegerät mit Isofluran-Verdampfer, O2-Durchflussmesser, Gang-Ventil; 564-0852, Induktionskammer 16 x 7 x 7,5 cm</td><td>für Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion 3D-Zielfernrohr mit Arm</td><td>Zeiss-Chirurgie</td><td></td><td>und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Faseroptische Lichtchirurgie</td><td></td><td></td><td>und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Betadine&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>70 % (v/v) Isopropylalkohol</td><td></td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Povidon-Jod Prep Pads</td><td>Dynarex</td><td>1108</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>NaCl 0,9 % (Injektion, USP, 918610)</td><td></td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion CYCLOSPORIN (INJEKTION, USP)</td><td></td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Buprenex (Injektion) Buprenorphin (0,03 &mu; g pro g Nagetier)</td><td>Sigma-Aldrich-Chirurgie</td><td></td><td>und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Ophthalmische Salbe&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Surgifoam</td><td>Ethicon</td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Grip Zahnzement</td><td>Dentsply</td><td>#675571, 675572</td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Instant SuperGlue&nbsp;</td><td>NDindustries</td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>LOCTITE 4041</td><td></td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>METABOND</td><td>C& B</td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Nr. 0 Deckglas</td><td>Fisher</td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>stereotaktischer Rahmen&nbsp;</td><td>Kopfchirurgie</td><td></td><td>und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Rektumsonde und Heizkissen</td><td>FHC</td><td>40-90-8D, DC Temperature Controller, 40-90-2-06, 6,5 x 9,5 cm Heizkissen40-90-5D-02, Rektalthermistor</td><td>Sondenchirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>optisches Steckbrett für die Bildgebung</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Fisher</td><td>S55667</td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Kwik-Cast (Silikonelastomer)</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Naht&nbsp; &nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>18' ', 1667, 4-0</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>91500-09, 15018-10</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Student Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91308-12</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Small Vessel Cauterizer Kit</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-00</td><td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Hot Bead Sterilisatoren</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18000-45</td><td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>Instrumentenkoffer mit Silikonmatte</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20311-21</td> für <td>Chirurgie und stereotaktische</td></tr><tr><td>Injektion Sterilisationsbehälter aus Kunststoff mit Silikonmatte</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>20810-01</td> für <td>Chirurgie und stereotaktische Injektion</td></tr><tr><td>2P-Fluoreszenzendoskop mit festem Tisch für die in vivo-Bildgebung</td><td>Olympus</td><td>FV1200 MPE</td><td>In-vivo-Bildgebung</td></tr><tr><td>Multiphotonenlaser</td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai Tai DeepSee</td><td>in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>Green Laser</td><td>Olympus</td><td>473 nm Laser</td><td>in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>xy translationale Basis</td><td>Scientifica</td><td>MMBP</td><td>in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>FRET Filter Würfel für YFP und CFP</td><td>Olympus</td><td></td><td>in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>10x und 40x Wasserimmersionsobjektive</td><td>Olympus</td><td></td><td>in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>Lufttisch</td><td>Newport</td><td></td><td>in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>kundenspezifischer lichtdichter Käfig</td><td>Thorlab</td><td></td><td>in vivo Bildgebung</td></tr></tbody></table>

der bau der zellbasierte neurotransmittern fluorescent engineered reporter (cnifers) zur optischen erfassung von neurotransmittern<em&gt; in vivo</em

Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo

Zell-basierte Neurotransmitter fluoreszierende entwickelt Reporter (CNiFERs) bieten ein neues Werkzeug für die Neurowissenschaftler die Freisetzung von Neurotransmittern im Gehirn in vivo zu optisch erfassen. Eine spezifische CNiFER wird aus einer humanen embryonalen Nierenzelle geschaffen , die stabil mit einer spezifischen G Protein-gekoppelten Rezeptor, der Paare G q / 11 G - Proteine ​​und ein FRET-basierten Ca 2+ -Detektor, TN-XXL ausdrückt. Aktivierung des Rezeptors führt zu einer Erhöhung in der Signal FRET. CNiFERs haben nM Empfindlichkeit und eine zeitliche Reaktion von Sekunden , weil ein CNiFER Klon mit dem nativen Rezeptor für einen bestimmten Neurotransmitter verwendet, zum Beispiel D2R für Dopamin. CNiFERs werden direkt in das Gehirn implantiert, so dass sie die Freisetzung von Neurotransmittern mit einer räumlichen Auflösung von weniger als hundert &amp; mgr; m, so dass sie ideal zur Messung der Volumentransmissions in vivo zu erfassen. CNiFERs kann auch für mögliche andere Arzneimittel zu screenen Kreuzreaktivität in vi verwendet werdenvo. Wir vor kurzem erweitert die Familie der CNiFERs GPCRs , dass Paar G i / o G - Proteine ​​enthalten. CNiFERs zum Erfassen Acetylcholin (ACh), Dopamin (DA) und Norepinephrin (NE) verfügbar. Da jede GPCR verwendet werden kann, ein neues CNiFER zu schaffen, und dass es etwa 800 GPCRs im menschlichen Genom sind, beschreiben wir hier das allgemeine Verfahren zu entwerfen, zu erkennen und zu testen, jede Art von CNiFER.

A CNiFER wird aus einer menschlichen embryonalen Nieren (HEK 293) -Zellen abgeleitet , die stabil konstruiert ist mindestens zwei Proteine ​​zu exprimieren: eine spezifische G-Protein - gekoppelten Rezeptor (GPCR) und eine genetisch kodierte [Ca 2+] Sensor, TN-XXL. TN-XXL erfährt Fluoreszenz - Resonanz - Energie - Transfer (FRET) zwischen Cyan und Gelb fluoreszierende Proteine, eCFP und Citrine jeweils als Antwort auf Ca 2+ -Ionen 6,15. Die Aktivierung vo...

Wir stellen ein Protokoll zellbasierten Neurotransmitter fluoreszierenden Reportern engineered (CNiFERs) zur optischen Erfassung der volumetrischen Neurotransmitter-Freisetzung zu schaffen.

Der Bau der Zellbasierte Neurotransmittern Fluorescent Engineered Reporter (CNiFERs) zur optischen Erfassung von Neurotransmittern<em&gt; In Vivo</em

Cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters (CNiFERs) provide a new tool for neuroscientists to optically detect the release of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, die Methodik zur Herstellung und Prüfung von zellbasierten fluoreszierenden Neurotransmitter-Sensoren, auch bekannt als CNiFERs, zu beschreiben, die zur optischen Überwachung der Freisetzung spezifischer Neurotransmitter in vivo verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaften bezüglich des zeitlichen Ablaufs und der Freisetzung von Neuromodulatoren im Gehirn zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie für jeden Typ von Neurotransmittern oder Neuromodulatoren angepasst werden kann, die über GPCR signalisieren.Die regionale Demonstration dieser Methode ist hilfreich. Die in-vivo-Injektion und anschließende Bildgebung von CNiFERs ist technisch anspruchsvoll. Um dieses Verfahren zu beginnen, betrachten Sie die HEK293-Zellen, die den kalziumbasierten Detektor und das chimäre G-Protein in einem T-25-Fläschchen enthalten.Anschließend die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 bis zu einer Konfluenz von etwa 50 % kultivieren. Danach das Medium aus dem T-25-Kolben absaugen. Zwei Milliliter der Lentavirus-Medium-Mischung hinzufügen und den T-25-Ko

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Mit dem wachsenden Interesse an Stammzelltherapien, sind molekulare Bildgebungsverfahren ideal für die Überwachung Stammzellen Verhalten nach der Transplantation. Luciferase Reporter Gene nicht-invasive, repetitive Beurteilung der das Überleben der Zelle, den Standort und Verbreitung in vivo ermöglicht. Dieses Video wird gezeigt, wie man hESC Proliferation in einer lebenden Maus zu verfolgen.

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

Wir haben eine neue Technik zur Quantifizierung nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors Veränderungen innerhalb subzellulären Regionen spezifischen Subtypen von ZNS-Neuronen zum besseren Verständnis der Mechanismen der Nikotinabhängigkeit, indem eine Kombination von Ansätzen einschließlich fluoreszierendes Protein Markierung des Rezeptors mit dem Knock-in-Ansatz entwickelt und spektrale konfokale Bildgebung.

Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin

Quelle: Lacin, E., et al. Konstruktion von zellbasierten Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reportern (CNiFERs) für die optische Detektion von Neurotransmittern in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt eine Technik zur Abbildung der Neurotransmitterfreisetzung in vivo unter Verwendung von zellbasierten Neurotransmitter-Fluoreszenz-Reportern (CNiFERs), spezialisierten Reporterzellen, die in die Hirnrinde der Maus vorinjiziert werden. Die Maus wird unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop...

Bildgebung der Freisetzung von Neurotransmittern mit zellbasierten Neurotransmitter-Fluoreszenz-Reportern

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Hier präsentieren wir eine neuartige Ca 2+ -Imaging Ansatz unter Verwendung eines Biolumineszenz Reporter. Dieser Ansatz verwendet einen fusionierten Konstrukts GFP-Aequorin, das Ca 2+ bindet und emittiert Licht, wodurch die Notwendigkeit für Lichtanregung. Deutlich Dieses Verfahren ermöglicht lange kontinuierliche Bildgebung, Zugang zu tiefen Hirnstrukturen und hoher zeitlicher Auflösung.

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Diese neu entwickelte Fluoreszenz basierende Technologie ermöglicht Langzeit-monitoring der Transkription der circadianen uhrengene im Suprachiasmatic Nucleus (SCN) Mäuse in Echtzeit und mit einer hohen zeitlichen Auflösung frei zu bewegen.

In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

Wir präsentieren ein zweiteiliges Protokoll, das fluoreszierende Calcium-Bildgebung mit In-situ-Hybridisierung kombiniert, so dass der Experimentator Muster der Calciumaktivität mit Genexpressionsprofilen auf einzelzelligem Niveau korrelieren kann.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Unter Verwendung transgener fluoreszierender Mäuse werden detaillierte Protokolle beschrieben, um den axonalen Transport von Signalendosomen und Mitochondrien innerhalb motorischer und sensorischer Axone des intakten Ischiasnervs bei lebenden Tieren in vivo zu beurteilen.

Erweiterung des Toolkits für die In-vivo-Bildgebung des axonalen Transports

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Erfahren Sie die Konstruktion von CNiFERs zur optischen Erfassung von Neurotransmittern in vivo mit HEK293-Zellen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring von Neuromodulator-Dynamiken im Gehirn.

Der Bau der Zellbasierte Neurotransmittern Fluorescent Engineered Reporter (CNiFERs) zur optischen Erfassung von Neurotransmittern In Vivo (Video) | JoVE Journal

Der Bau der Zellbasierte Neurotransmittern Fluorescent Engineered Reporter (CNiFERs) zur optischen Erfassung von Neurotransmittern

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