Der Bau der Zellbasierte Neurotransmittern Fluorescent Engineered Reporter (CNiFERs) zur optischen Erfassung von Neurotransmittern In Vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, die Methodik für die Konstruktion und Erprobung von zellbasierten Neurotransmitter-Fluoreszenz-Reportern (CNiFERs) zu beschreiben, die zur optischen Überwachung der Freisetzung spezifischer Neurotransmitter in vivo verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaften zum Timing und zur Freisetzung von Neuromodulatoren im Gehirn zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie an jede Art von Neurotransmitter oder Neuromodulator angepasst werden kann, der über GPCS signalisiert.

regionale Demonstration dieser Methode ist hilfreich. Es handelt sich um die In-vivo-Injektion, und die anschließende Bildgebung von CNiFERs ist eine technische Herausforderung. Um dieses Verfahren zu beginnen, sehen Sie sich die HEK293-Zellen an, die den frontbasierten Kalziumdetektor und das chimäre g-Protein in einem T-25-Kolben enthalten.

Dann züchten Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent CO2, bis sie zu etwa 50 % zusammenfließen. Anschließend wird das Medium aus dem T-25-Kolben abgesaugt. Fügen Sie zwei Milliliter des Lenta-Virus-Mediengemisches hinzu und inkubieren Sie den T-25-Kolben bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2.

Ernten Sie am nächsten Tag die infizierten HEK293-Zellen, indem Sie einen Milliliter Trypsin hinzufügen. Anschließend resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern HEK293-Wachstumsmedium. Entkernen Sie einen Milliliter Zellen in einem T-75-Kolben zum Einfrieren und Lagern und 1,5 Milliliter Zellen in einem T-25-Kolben für die FACS-Analyse.

Für die 10-Punkt-Agonistenkurve wird zum Testen der infizierten Zellen die ersten beiden Reihen einer mit Fibronektin beschichteten 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern der Zellsuspension pro Well besiedelt. Inkubieren Sie dann die HEK293-Zellen, die in einem T-25-Kolben, einem T-75-Kolben und einer 96-Well-Platte wachsen, bis sie ein bis zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius zu etwa 90 % mit 5 % CO2 zusammenfließen. Bestimmen Sie vor der FACS-Analyse die funktionelle Expression des GPCR, indem Sie eine Wirkstoffplatte mit 10 verschiedenen Agonistenkonzentrationen vorbereiten, die den vorhergesagten EC 50 eingrenzen.

Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen des Agonisten mit einer seriellen Verdünnungsmethode vor und erstellen Sie eine Vorlage, um die Arzneimittelkonzentrationen zu verfolgen. Stellen Sie als Nächstes die Temperatur des Plattenlesers auf 37 Grad Celsius ein. Programmieren Sie dann den fluorometrischen 96-Well-Plattenleser zum Messen des Bundes und zum Durchführen von Lösungstransfers.

Für die Messung des Bunds mit einem genetisch kodierten bundbasierten Calcium-Sensor, TNXXL, stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 436 plus oder minus 4,5 Nanometer ein. Stellen Sie dann die Emissionsfilter und die Sperrfilter auf ECFP und Citrin ein. Programmieren Sie dann das Plattenlesegerät so, dass es die Emissionen alle vier Sekunden misst, insgesamt 180 Sekunden lang.

Wählen Sie die Optionen für ein Volumen von 100 Mikroleader-Platten, eine Pipettenhöhe von 150 Mikrolitern und die Abgabe von 50 Mikrolitern des Arzneimittels aus der Dreifach-Verbundplatte. Legen Sie den Zeitpunkt für die Verabreichung des Arzneimittels auf 30 Sekunden fest. Danach saugen Sie das Medium aus den Reihen A und B an und geben Sie 100 Mikroliter ACSF in die 96-Well-Schnüffelplatte, die zu etwa 90 % konfluent ist.

Laden Sie dann die dreifache Medikamentenplatte und die 96-Well-Snifferplatte in den Plattenleser. Lassen Sie die Platten 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius äquilibrieren, bevor Sie das Programm starten. Exportieren Sie nach dem Ausführen des Platten-Readers die Werte des Fluoreszenz-Readers in eine Textdatei.

Importieren Sie diese Datei dann in eine zuvor erstellte Tabellenkalkulationsvorlage, die die Floreszenzintensitäten auf die Basislinien vor dem Stimulus normalisiert, das Peak-Fret-Verhältnis für jede Agonistenkonzentration berechnet und eine Dosis-Wirkungs-Kurve generiert. Bereiten Sie die CNiFER-Injektionspipette vor, indem Sie eine Glaskapillare auf einen vertikalen Elektrodenabzieher setzen. Brechen Sie die Spitze der Elektrode mit einer Pinzette auf einen Durchmesser von etwa 40 Mikrometern.

Legen Sie einen ACSF-getränkten Schwamm auf ein zuvor gebildetes, zwei mal drei Millimeter dünnes Schädelfenster einer anästhesierten Maus, um es feucht zu halten, während die Zellen für die Injektion vorbereitet werden. Als nächstes ernten Sie den CNiFER-Klon, der in einem T-75-Kolben gezüchtet wurde, auf eine Konfluenz von etwa 80 %. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit sterilem PBS.

Entfernen Sie PBS und verwenden Sie 10 Milliliter ACFS, um die Zellen vom Boden des Kolbens zu entfernen. Tritcheieren Sie dann die Zellen, um die Zellklumpen zu dissoziieren. Zwei Minuten in einer Zellkulturzentrifuge zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern ACSF. Anschließend 30 Sekunden lang bei 1400 mal G zentrifugieren und den Überstand entfernen, wobei ein Pellet zurückbleibt, das mit ACSF bedeckt ist. Füllen Sie anschließend die Injektionspipette mit Mineralöl zurück.

Laden Sie die Pipette auf einen Nano-Injektor. Geben Sie fünf Mikroliter CNiFER-Zellsuspension auf einen Streifen Paraffinfolie in der Nähe der Mauspräparation. Ziehen Sie die CNiFER-Zellen in die gezogene Pipette auf.

Bewegen Sie nun die Pipette auf die x- und y-Zielkoordinaten. Senken Sie die Pipetten und stechen Sie den zuvor vorbereiteten verdünnten Schädel ein. Weiter geht es bis etwa 200 bis 400 Mikrometer unter der Schädeloberfläche, in den Schichten zwei und drei der Hirnrinde.

Injizieren Sie 4,6 Nanoliter CNiFER-Zellen an der tiefsten Stelle mit dem Nanoinjektor. Beachten Sie die Bewegung in der Schnittstelle zwischen Öl und Zelle. Und dann warten Sie fünf Minuten, bis die Zellen ausgegeben sind.

Ziehen Sie die Pipette etwa 100 Mikrometer zurück und injizieren Sie weitere 4,6 Nanoliter CNiFER-Zellen und warten Sie erneut fünf Minuten. Ziehen Sie anschließend die Pipette langsam und vorsichtig zurück, um einen Rückfluss der CNiFERs zu verhindern. Platzieren Sie bei diesem Verfahren die Bildgebungsplattform mit der an den Kopf gefesselten Maus unter einem 10-fachen Wasserimmersionsobjektiv in einem Zwei-Photonen-Bildgebungsmikroskop.

Setzen Sie den Filterwürfel für die Bundabbildung ein, der einen dichroitischen Spiegel bei 505 Nanometern und Bandpassfilter mit einem Radius von 460 Nanometern bis 500 Nanometern für die Messung von ECFP und 520 Nanometern bis 560 Nanometern für die Messung von Citrin aufweist. Fügen Sie dann ACSF zu der Vertiefung hinzu, die das verdünnte Schädelfenster enthält, und senken Sie das 10-fache Wasserimmersionsziel in das ACSF-Objektiv ab. Verwenden Sie das Okular in Verbindung mit der Quecksilberlampe und dem GFP-Filterwürfel, um die CNiFERs zu lokalisieren.

Wechseln Sie nun zum 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv. Wählen Sie als Nächstes den geeigneten Strahlengang für die Zwei-Photonen-Bildgebung aus. Schalten Sie den Nahinfrarot-Femtosekundenpulslaser ein.

Wählen Sie eine Wellenlänge von 820 Nanometern und eine Leistungseinstellung von fünf bis 15 %Stellen Sie die Spannung pmt one und pmt two auf einen submaximalen Wert ein, typischerweise 500-1000 Volt, abhängig von der pmt. Stellen Sie dann die Verstärkung für jeden Kanal auf eins ein und stellen Sie die z-Position für das Ziel auf Null. Senken Sie das Objektiv etwa 100 bis 200 Mikrometer von der kortikalen Oberfläche ab und starten Sie den xy-Scan.

Passen Sie die Laserleistung, die Verstärkung und die pmt-Spannung für jeden Kanal an, um das Signal-Rausch-Verhältnis der Fluoreszenz des CNiFER zu optimieren. Verwenden Sie als Nächstes die Software, um die Bildgebung auf einen Bereich zu beschränken, der die CNiFER-Zellen enthält, sowie auf einen Hintergrundbereich. Wählen Sie die Cowman-Linie mit Mittelung für zwei aus, um ein geeignetes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen, und verwenden Sie eine Abtastrate von 3 bis einem Hertz bei vier Mikrosekunden pro Pixel.

Zeichnen Sie danach einen ROI um die CNiFER-Zellen. Sie umgeben etwa drei bis vier Zellen pro Ebene. Richten Sie eine Echtzeitanalyse der durchschnittlichen ROI-Intensitäten ein.

Starten Sie dann die Erfassung, um die CNiFER-Floreszenz im Laufe der Zeit zu überwachen, und beginnen Sie mit der elektrischen Stimulation oder dem Verhaltensexperiment, während Sie den Bund überwachen. In diesem Beispiel wurde die Reaktion des D2R CNiFER fret auf einem Plattenleser mit einem Lösungszufuhrsystem gemessen. Diese Grafik zeigt die Bundreaktion während der Anwendung von Dopamin auf D2-CNiFERs.

Beachten Sie, dass die ECFP-Emission abnimmt, während die Citrin-Emission mit Dopamin zunimmt. Und hier ist ein Diagramm des entsprechenden Bundverhältnisses. Hier sind die Dosis-Wirkungs-Kurven für die Reaktion von D2-CNiFERs auf Dopamin und auf Noradrenalin dargestellt.

Darüber hinaus wird die reaktionsschnelle Steuerung CNiFERs ohne D2R vorgestellt. Dieses Balkendiagramm zeigt die Reaktion des Bundverhältnisses für andere Neurotransmitter und Modulatoren bei 50 Nanomolaren und einem Mikromolaren. Hier führt die elektrische Stimulation von DA-Neuronen in der Substantia nigra zu einer starken Veränderung des Bundverhältnisses für D2 CNiFERs.

Beachten Sie, wie die Amplitude der Reaktion mit zunehmender Intensität der elektrischen Stimulation zunimmt. Die Kopplung der Stimulation mit der Kokaininjektion verstärkt die CNiFER-Reaktion. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie CNiFERs für die In-vivo-Bildgebung erstellen, testen und verwenden.

Während der gesamten Entwicklung von CNiFERs ist es wichtig, die sterile Technik beizubehalten, da diese Zellen letztendlich in lebende Mäuse implantiert werden. Die Realisierung von CNiFERs stellt ein wichtiges Werkzeug für die Forschung auf dem Gebiet der Neurowissenschaften dar, um die Freisetzung von Neurotransmittern oder Neuromodulatoren, die Signale über einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor senden, optisch zu messen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.