Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die quantitative Echtzeit-PCR (QRT-PCR) verwenden, um Tumorzellen spezifische mRNA, die Metastasen in der Maus Lungengewebe zu erkennen.

Zusammenfassung

Metastasen ist die Verbreitung von bösartigen Tumorzellen aus dem Primärkrebs Website zu einem entfernten Orgel und ist die Hauptursache von Krebs Tod ^1. Gemeinsame Standorte Metastasierung sind Lunge, Lymphknoten, Gehirn und ^Knochen 2. Mechanismen, die Metastasen zu fahren sind intensiv Bereichen der Krebsforschung. Folglich effektiven Tests, um metastatic Belastung zu messen in entfernten Stellen von Metastasen sind maßgeblich für die Krebsforschung. Bewertung der Lungenmetastasen in Mammatumor-Modellen wird im allgemeinen grob qualitative Beobachtung von Lungengewebe nach Dissektion durchgeführt. Quantitative Methoden zur Bewertung der Metastasierung sind derzeit auf ex vivo- und in vivo-Bildgebungstechniken, die auf Basis benutzerdefinierter Parameter erfordern beschränkt. Viele dieser Techniken sind in den gesamten Organismus Ebene als zellulärer Ebene ^3-6. Obwohl neuere bildgebende Verfahren, die Multi-Photonen-Mikroskopie in der Lage, metas bewertenTASIS auf zellulärer Ebene ⁷ sind diese sehr elegante Verfahren besser geeignet für die Beurteilung Mechanismen der Verbreitung statt quantitative Bewertung der metastatischen Last. Hier wird ein einfaches in vitro-Verfahren für die quantitative Erfassung der Metastasierung wird vorgestellt. Mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) kann tumorzellspezifischen mRNA in der Maus-Lungengewebe nachgewiesen werden.

Einleitung

QRT-PCR-Analyse als ein Verfahren zur Beurteilung der Tumormetastasierung vorgeschlagen. Dieses Verfahren wird als eine Alternative für die Nutzer, die sich für die Bewertung der Metastasierung sind, aber keinen Zugriff auf bestimmte Geräte wie in vivo bildgebenden Geräten oder einem Fluoreszenz fähig Stereoskop vorgeschlagen. Eine Diskussion der am häufigsten verwendeten Verfahren wird durch eine Demonstration, wie qRT-PCR-Analyse kann entweder als getrennte oder als Begleiter Verfahren zur Metastasierung auszuwerten dieser genutzt werden können gefolgt. Dieses Verfahren hat das Potenzial, eine quantitative Analyse von metastatischen Last bereitzustellen.

Standardverfahren der Brutto-Analyse, einschließlich der Visualisierung der Lunge unter einem Stereomikroskop sowie Serienschnitt gefolgt von Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung von Lungengewebe, quantifizierbar sind, sondern verlassen sich stark auf benutzerdefinierte Parameter zum Zählen ^2-5. Bei der Bewertung der gesamten Lunge mit einem Stereomikroskop, nur große Oberfläche Metastasen sind visiBLE und Analyse erfordert die Prüfer, angemessene Kenntnisse der Lungen anatomischen Struktur, um festzustellen, was eine metastatische Läsion haben. Fluoreszenzmarkierung von Tumorzellen mit einem Marker, wie GFP und die Verwendung eines Stereomikroskops, das eine Licht Würfel mit dem geeigneten Anregungs- / Emissionsmaxima (zB in der Nähe von 470/510 nm für GFP) enthält hilft bei diesem Verfahren jedoch nur Oberflächentumorknötchen nachweisbar . Zusätzlich Fluoreszenz von Blutkontamination, die unter den gleichen Parametern wie GFP sichtbar ist, kann zu falschen Identifizierung möglicher Metastasen führen.

Schneiden der Lunge, gefolgt von H & E-Färbung auf Lungenmetastasen zu visualisieren ist eine nützliche Methode, um Mikrometastasen und anderen mikroskopischen Verfahren, einschließlich Immunzellinfiltration zu bewerten, sondern erfordert oft den Einsatz des gesamten Lungengewebe für die Paraffineinbettung, Schneiden und Färbeverfahren. Daher folgt dieser metho sind nachgeschalteten Verfahren nicht ideald. Obwohl quantifizierbaren, erfordert dieses Verfahren den Forscher eine Vielzahl von gefärbten Lungenschnitten pro Tier bewerten, um sicherzustellen, dass die Analyse berücksichtigt die gesamte 3D-Struktur der Lunge. Somit ist diese Art der Untersuchung zeitaufwendig, können Zählfehler zu führen, und die Analyse stützt sich stark auf Ermittler Diskretion.

Mehrere in vivo bildgebenden Verfahren (zB MRT, PET, SPECT) werden gegenwärtig verwendet, durchzuführen oder zu testen, biologische Prozesse in experimentellen Tiermodellen ^8. In vivo Biolumineszenz-Bildgebung ist eine gängige Methode verwendet, um eine grobe Ansicht von Metastasen ⁹ zu erwerben. Diese Technik wird im allgemeinen angewandt, um die Anwesenheit von Luciferase-Reporteraktivität zu beurteilen aufgrund der Akkumulation von Tumorzellen, die dazu entworfen sind, um eine Luciferase-Reaktionselement enthält, die in bestimmten Organen wie der Brustdrüse nach der Tumorzellimplantation und der Lunge, bei einer spontanen Metastasierung aufzuhalten ¹0. Visualisierung der Luciferase-Reporteraktivität durch die Anwesenheit von Luciferin-Substrat (D-Luciferin) induziert. Luciferase katalysiert die oxidative Decarboxylierung von D-Luciferin zu Oxyluciferin Erzeugen Biolumineszenz. Während informative wird dieses Verfahren durch mehrere Faktoren, einschließlich Substratstabilität (dh kurze Halbwertszeit), eine angemessene Verteilung des Substrats, wie sie an Versuchstiere geliefert wird, hängt, und geringe Nachweisempfindlichkeit ⁹ begrenzt. Ein Haupt Vorteil dieser Technik ist, dass sie nicht invasiv ist, kann an lebenden Tieren durchgeführt werden und kann auf den Nachweis von Tumorzellmetastasen in verschiedenen Organen, die nicht normal zu Dissektion ^9,10 geerntet führen kann.

Ein positiver Aspekt der in vivo bildgebenden Verfahren ist, dass das Lungengewebe ungestört so dass für sekundäre Eingriffe wie Paraffineinbettung oder wie hier, QRT-PCR-Analyse vorgestellt. Da jedoch QRT-PCR ist theoretically ein empfindlicheres Maß für die Erkennung, kann grobe Auswertung nicht verraten geringe Zahl von Tumorzellen in der Lunge vorhanden. Zwar nützlich, können die oben beschriebenen Bildgebungstechniken ersetzt oder die unmittelbar beschriebene qRT-PCR-Verfahren ergänzt werden. QRT-PCR hat das Potential, ein empfindliches Maß tumorderivierten mRNA innerhalb einer Lunge bereitzustellen.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien und Tierpflegestandards der Medical University of South Carolina (MUSC) und seine Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC).

1. Lung Dissection

1. Mammatumor-Dissektion (optional je nach Studienziele und ob Primärtumor Analyse oder Schwanzveneninjektion durchgeführt wurde).
   1. Euthanize Maus mit einer letalen Dosis von Isofluran-Narkose nach IACUC und Hochschulverordnung. Bestätigen Euthanasie durch chirurgische Luxation.
   2. Am Schaumbrett, Stift mit Dissektion Stifte, indem Sie die Maus auf seiner Rückseite mit Gliedmaßen Verbreitung.
   3. Spray-Maus mit 70% Ethanol.
   4. Mit einer Pinzette, fassen Sie den unteren Teil des Tieres in den Mittelpunkt.
   5. Verwendung Schere, schneiden oben in Richtung auf den Hals durch die Haut, man aufpassen, nicht in die Bauchhöhle der Maus durchbohren.
   6. Schnitt zurück Haut an den Extremitäten, um Tumorgewebe zu offenbaren.
   7. Sezieren Tumorgewebe und preserve von bevorzugten Verfahren wie Gefrier- oder Fixierung, zur weiteren Analyse (nicht weiter in diesem Protokoll beschrieben).
2. Lungengewebe Dissektion.
   1. Wenn Tumorgewebe wurde wie oben beschrieben geerntet, festzunageln überschüssige Haut.
   2. Mit einer Pinzette fassen Peritoneum am unteren Ende des Tieres und beginnen Schneiden nach oben in Richtung auf die Basis des Halses.
   3. Vorsichtig entlang der linken und rechten Seite des Brustkorbs vorsichtig, um zu vermeiden Trennen keine Blutgefäße, die in die Brusthöhle bluten können geschnitten. Entfernen der Rippenknochen durch Schneiden nach links und rechts durch die Membran und den oberen Abschnitten der Rippen.
   4. Mit einer Pinzette greifen die Luftröhre des Maus und nach vorne ziehen.
   5. Sever die Luftröhre mit Dissektion Schere und der Lunge zu entfernen von der Maus.
      Hinweis: Das Herz kann in die Lunge angebracht bleiben. In diesem Fall sorgfältig sezieren Herzen von Lunge darauf achten, alle fünf Lappen zu sammeln (siehe Abbildung 1 ).
   6. Waschen Sie sich leicht mit PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen.
3. Gross Bewertung der Lungengewebe.
   1. Option 1: In-vivo-Bildgebung.
      1. Luciferase-Bildgebung, ~ 10 min vor der Bilderzeugung, geben den Tieren eine 150 mg / kg Dosis von Luciferin durch intraperitoneale (ip) Injektion. Bild Lunge in vivo bei anästhesierten Tieren oder beim Entfernen nach der Sektion (2) ^5.
   2. Option 2: Brutto Auswertung.
      1. Untersuchen Lunge unter Stereomikroskop zur Tumorknoten zu visualisieren. Hinweis: Wenn Zellen GFP-markierten kann ein Fluoreszenz-Stereomikroskop in der Lage, die eine Lichtwürfel mit dem entsprechenden Anregungs- / Emissionsmaxima (zB in der Nähe von 470/510 nm), um GFP erkennen verwendet werden, um die Lunge für die Fluoreszenz vor der Verarbeitung stereoskopisch untersucht werden.
   3. Wenn die Lunge sind sofort analysiert werden, ist dem Kapitel 'RNA Isolation' fortzufahren. Andernfalls Snap freeze Gewebe unter Verwendung liquid Stickstoff oder Trockeneis. Bei -80 ° C.

2. RNA-Isolierung

Hinweis: Für die repräsentative Analyse wurde RNA mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kit (siehe Materialliste) isoliert. Während die aktuelle Analyse eines bestimmten Herstellers Produkt verwendet, eine Vielzahl von Isolation Kits sind von verschiedenen namhaften Herstellern. Zusätzlich werden nicht-Kit auf Basis Zentrifugationsverfahren auch eine Option. cDNA sollte auch von einer positiven Kontroll-RNA Probe hergestellt werden, beispielsweise eine Zelllinie oder ein Plasmid, für Standard-Kurvenanalyse. Alternativ kann eine positive Kontrolle, die für das Primer Sondensatz erworben werden (siehe Materialliste).

1. Wenn Sie zuvor gefrorenem Gewebe, sammeln gefrorenem Gewebe auf Trockeneis.
2. Homogenisieren, mit einer der folgenden Methoden, wie beispielsweise Gewebe: Mörser Schleifen von Hand über Trockeneis nach dem Einfrieren Gewebe in flüssigem Stickstoff durchgeführt wird; Gewebehomogenisator oder mechanische Dissoziation Gerätpro Hersteller Vorschlag; Beschallung oder andere bevorzugte Methode.
   Hinweis: Für die repräsentative Analyse, ist die bevorzugte Methode der Homogenisierung Beschallung.
   1. Für die Analyse in Figur 3 dargestellt, herzustellen Lysepuffer (in RNA Isolation Kit bereitgestellt) und 2-Mercaptoethanol im Verhältnis von 20 ul 2-Mercaptoethanol für je 1 ml Lysepuffer. Resuspendieren Gewebe in 300 ul Lysepuffer ergänzt mit 2-Mercaptoethanol für jede 30 g Gewebe, und mit Ultraschall 10 s mit Beschallungsgerät bei 30% Amplitude eingestellt.
   2. Wenn Sie nach dem Schleifen Mörser und Stößel, resuspendieren Grundgewebe in 300 ul Lysepuffer.
3. Zugabe von 10 & mgr; l Proteinase K bis 590 & mgr; l TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA). Fügen Sie 600 ul Proteinase K-Lösung, um alle 300 & mgr; l (dh für jede 30 mg) von Gewebe. Inkubation für 10 min bei RT.
   Hinweis: Aufschlusszeit kann variieren.
4. Centrifuge Proben bei ≥13.000 g für 10 min, um Trümmer zu entfernen.
5. Überstand in ein neues Röhrchen.
6. Mit 450 & mgr; l Ethanol (96% -100%) für jeweils 900 & mgr; l des Überstands, um RNA auszufällen.
7. Übertragen 700 ul des Lysats / Ethanol Mischung auf die Säule.
8. Zentrifuge Proben bei ≥13,000 g für 1 min, um RNA zu Säule bindet.
9. Entsorgen flüssiger Abfall und fügen verbleibende Überstand zur Spalte wieder zu spinnen.
10. Sobald das gesamte Lysat durch die Säule geschleudert, mit 350 ul Waschpuffer 1 an dem oberen Abschnitt der Säule und Zentrifuge Proben bei ≥13,000 g für 30 sec.
11. Verwerfen von Flüssigkeit aus Säule und oberen Teil zu ersetzen.
12. Vorbereitung DNase durch Mischen von 5 Einheiten DNase I-Enzym mit 5 ul von 10x DNase und 40 ul DNase / RNase freiem Wasser pro Probe (Gesamtvolumen von 50 ul / Probe).
13. Dann werden 50 ul DNase mischen, um jede Spalte und Inkubation für 15 min bei RT.
14. Fügen Sie 350 ul Waschpuffer 1 bis Säule und zentrifugieren samsätze bei ≥13,000 g für 30 Sekunden.
15. Verwerfen von Flüssigkeit aus Säule und oberen Teil zu ersetzen.
16. Mit 600 & mgr; l Waschpuffer 2 an die Säule und Spin 30 sec bei ≥13,000 g.
17. Verwerfen von Flüssigkeit aus Säule und oberen Teil zu ersetzen.
18. Fügen Sie 250 ul Waschpuffer 2 und Zentrifuge für 2 min bei ≥13,000 g.
19. Setzen Sie Teil der Kolonne in neuen Sammelröhrchen und entsorgen Sie alte Sammelröhrchen.
20. In 50 bis 100 & mgr; l RNase / DNase freies Wasser zur Säule und Inkubation für 1 min.
21. Spin für 1 min bei ≥13,000 g.
22. Re-run bis Spalte gesammelten Eluats auf RNA-Ausbeute zu erhöhen.
23. Für den sofortigen Einsatz, halten Proben auf Eis und zur Quantifizierung. Für die spätere Verwendung, Snap freeze auf Trockeneis oder flüssigem Stickstoff. Bei -80 ° C Gefrierschrank bis sie benötigt.

3. Erststrangsynthese

Hinweis: Für die repräsentative Analyse wurde die Reverse Transkriptase (RT) -Reaktion durchgeführt a First cDNA-Synthese-Kit für QRT-PCR entwickelt (siehe Materialliste).

1. Wenn Proben wurden zuvor gesammelten, tauen Röhrchen auf Eis.
2. Messen Sie RNA-Menge mit einem Spektralphotometer.
3. Verwendung 0,5-2 ug Gesamt-RNA, führen die Erststrangsynthese unter Verwendung von reverser Transkriptase in cDNA Lager zu erzeugen.
   1. In sterile, RNase / DNase-frei PCR-Gefäße / Platten, bereiten Sie die Reaktionsmischung (Tabelle 1). Vorsichtig mischen und zentrifugieren. Programmieren Sie eine Standard-PCR-Maschine (Tabelle 2).
4. Verdünnen Sie fertigen Reaktion auf gewünschte Lautstärke (in der Regel 50 bis 100 & mgr; l) mit sterilen Nuklease-freies Wasser.

4. Echtzeit-PCR

Hinweis: Für die repräsentative Analyse, SYBR Green verwendet wurde. Jedoch kann jede bevorzugte Methode im Ermessen des Benutzers ersetzt werden.

1. Verwendung eines positiven Steuer cDNA, richten Sie eine Standardkurve für jedes Primerpaar.
   1. Für die Analyse gezeigt, in Abbildung 3, bereiten Sie die Standardkurve für den menschlichen HER2 mit dem Hersteller empfohlene positive Kontroll cDNA (siehe Materialliste). Für Maus GAPDH, verwenden Sie die Negativkontrolle Lungen-cDNA um eine Standardkurve zu erzeugen. Für jede Sonde, seriell verdünnter die cDNA 1: 4 bis 5-Norm zu erzeugen.
2. Berechnen der Gesamtzahl der Proben, die der Standardkurve und die experimentellen Proben enthalten sollte.
   Hinweis: Für die Analyse hier beschrieben, wurden 2-3 experimentellen Wiederholungen pro Probe analysiert. Standardkurvenanalyse durchgeführt, um ein einfaches lineares Regressionsmodell, die angewendet werden, um die relative Menge von HER2 und GAPDH pro Probe zur endgültigen normierte Größe berechnen bestimmen zu erzeugen. Diese Analyse wird auch dafür sorgen, dass der Primer Effizienz angemessen für die Analyse bei der Hand ist.
3. In einem sterilen, RNase / DNase-frei Rohr, bereiten Master-Mix (Tabelle 3).
   1. Berechnen Mastermix amount pro Probe. Scale-up für mehr als eine Probe. Verwenden Sie einen Master-Mix für jeden experimentellen Gen von Interesse, als auch als interne Kontrolle, wie GAPDH. Verwenden Primer für GAPDH in einer Endkonzentration von 200 nM.
      Hinweis: Der interne Kontrolle ist besonders nützlich, wenn versucht wird, zwischen Mensch und Maus-Zell Ursprungs zu unterscheiden.
      Hinweis: Primer-Konzentration für HER2 wurde optimiert und durch den Hersteller bestimmt.
4. Bereiten Testplatte, die 1 & mgr; l cDNAs entsprechend jeder Standard- oder Versuchsprobe. Hierbei mindestens 1 cDNA-Probe / Vertiefung für jedes Primersonde. In 19 ul des Master-Mix pro Vertiefung für jedes Primersonde.
   Anmerkung: Für den repräsentativen Daten in Abbildung 3 wurden die cDNA-Proben in zweifacher Ausführung für jeden Primer Sonde analysiert und als der Mittelwert der zwei Proben grafisch dargestellt.
5. Führen Reaktion in QRT-PCR-Maschine mit den empfohlenen oder zuvor PCR-Protokoll getestet. Siehe Tabelle 4 für den für die repräsentativen Daten in Abbildung 3 und 4 verwendeten PCR-Protokoll.

Ergebnisse

Über die Zeit, die für den anfänglichen Inokulation von Tumorzellen in das Versuchstier und durchzuführen, wenn die Durchführung ist ein 1-2 Tag Verfahren primären Tumor in vivo Analyse der Gewebeernte, RNA-Isolierung und qRT-PCR-Analyse (Figur 1) .

Ein Beispiel für eine grobe Analyse ist Biolumineszenz-Bildgebung, um Tumorzellen im Lungengewebe zu bewerten. Hier wurde eine Brusttumorgenese Experiment...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt Verwendung von QRT-PCR, um Brust Metastasierung von Tumorzellen in die Lunge mit einem Xenograft Mausmodell zu bewerten. Es wird anerkannt, dass andere Techniken, einschließlich Biolumineszenz-Bildgebung zur Verfügung und sind auch wirksam zum Erfassen Metastasierung obwohl ihre eigenen Werte und Grenzen. Die vorgestellten Daten zeigen, dass qRT-PCR stellt eine wirksame Maßnahme zum Nachweis von Tumor-abgeleitete mRNA im Lungengewebe zur Quantifizierung von Gesamt Metastasierung. Es wird vorg...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-Mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transkription Supermix für QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR-Template für SYBR Green Assay: ERBB2, human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer-Sequenz			für ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG