Verwenden von Einzel Sensillum Aufnahme auf Riech Neuron Antworten von Bed Bugs zu Semiochemicals Detect

Zusammenfassung

Bettwanzen verlassen sich auf olfaktorische Rezeptorneuronen, die in ihren antennen olfaktorischen Sensillen untergebracht sind, um Semiochemikalien in der Umwelt zu erkennen. Mit Hilfe der Einzelsensillum-Aufzeichnung demonstrieren wir eine Methode zur Bewertung der Reaktion von Bettwanzen auf Semiochemikalien und untersuchen den damit verbundenen Kodierungsprozess.

Zusammenfassung

Das Insekt olfaktorische System spielt eine wichtige Rolle bei der Erkennung Semiochemicals in der Umwelt. Insbesondere die anten Sensillen, die einzelne oder mehrere Neuronen im Inneren zu beherbergen, werden als die großen Beitrag bei der Reaktion auf die chemische Reize machen. Durch die direkte Aufnahme Aktionspotential in der Riech Sensillum nach der Exposition auf Reize, bietet Einzel Sensillum Aufnahme (SSR) Technik einen leistungsfähigen Ansatz zur Untersuchung der neuronalen Antworten von Insekten auf chemische Reize. Für das Bett Bug, der ein notorischer menschliche Parasit ist, haben mehrere Arten von Geruchs Sensillum charakterisiert. In dieser Studie haben wir gezeigt, neuronale Reaktionen der Bettwanze olfaktorischen Sensillen auf zwei chemische Reize und die Dosis-abhängige Reaktion auf einen von ihnen mit dem SSR-Methode. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, Früherkennung für einzelne chemische Reize auf der Bettwanze olfaktorischen Sensillen, die wertvolle Informationen für die Entwick bieten würde durchführenwicklung neuer Bettwanze Lockmittel oder Repellents und Nutzen die Bettwanze Kontrolle Anstrengungen.

Einleitung

Der gemeinsame Bettwanze Cimex lectularius L (Hemiptera: Cimicidae), als eine vorübergehende Ektoparasiten, ist eine verpflichtet blutsaugende Insekten, was bedeutet, ihr Überleben, Entwicklung und Reproduktion erfordern Blutquellen von Hosts, einschließlich Menschen und Tiere ^1,2. Obwohl Virusübertragung selten aufgrund von C. gemeldet lectularius, ernsthaft beeinträchtigt die beißende Belästigung durch einen Befall generierte Hosts physisch und psychisch ^3. Die Einführung und weit verbreiteten Einsatz von chemischen Insektiziden, insbesondere DDT, verringert das Risiko eines Befalls und bis zum Ende der 1950er Jahre Befall waren auf einem so niedrigen Niveau, das sie nicht mehr eine ernste Besorgnis der Öffentlichkeit. Eine Reihe von Faktoren haben dazu geführt, weltweit im Bett Bug Bevölkerung Wiederaufleben, wie die reduzierte Verwendung von Insektiziden, ein Rückgang des öffentlichen Bewusstseins, erhöhte Fahrtätigkeit und der Entwicklung einer Resistenz gegen Insektizide ^9.4.

Chemische Signale in der Umwelt werden erkannt und durch Insekten durch Geruchsorgane wie Antennen und Kiefer Palpen anerkannt. Die olfaktorischen Sensillen auf den Insektenfühler spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufdeckung dieser chemischen Signale. Die chemische Moleküle geben Sie die Antennen Kutikula durch Poren an der Nagelhaut Oberfläche. Geruchsstoff bindenden Proteinen im Antennallobus Lymphe binden an diesen chemischen Molekülen und transportieren sie auf die Geruchsrezeptoren ^10. Die Geruchsrezeptoren und ihre Co-Rezeptor aus der nicht-selektiven Kationenkanal auf der neuronalen Membran, die einst diesen chemischen Molekülen depolarisiert werden, sind durch die Geruchsrezeptoren ¹¹ erfasst.

Einzel Sensillum Aufzeichnungs (SSR) wurde entwickelt, um die extrazelluläre Änderung des Aktionspotentials durch die Anwendung entweder durch chemische oder nicht-chemische Reize verursacht werden. Durch Einfügen eines Aufzeichnungselektrode in Sensillum Lymphe und einer Referenzelektrode,in einem anderen Teil des Insektenkörpers (in der Regel entweder die Verbindung Augen oder der Bauch) kann die Feuerrate der Neuronen in Abhängigkeit von Stimulus aufgezeichnet ^12. Veränderungen in der Anzahl von Spitzen darstellen, die Empfindlichkeit des Insekts auf bestimmte Reize. Chemische Reize verschiedener Identität und Konzentration werden verschiedene neuronale Antworten hervorrufen, mit verschiedenen Feuerungsraten und zeitlichen Strukturen, und können so verwendet werden, um die Codierung des Insekts, um bestimmte Chemikalien zu untersuchen.

Für die gemeinsame Bettwanze, teilen beide Geschlechtsformen das gleiche Muster von olfaktorischen Sensillen auf den Antennen: neun genuteten Zapfen C Sensillen, 29 Haar-ähnliche E (E1 und E2) Sensillen, und jeder von D & alpha;, D & beta;, d & ggr; glatte Zapfen ein Paar Sensillen ^13,14. Als mehrere Neuronen in jeder Art von Sensillum identifiziert wurde, ist es nicht leicht, die Aktionspotentiale aus verschiedenen Neuronen der gleichen Sensillum gebracht zu unterscheiden, so dass für dieses Experiment die total Zahlen von Aktionspotentialen wurden off-line für einen 500 ms Zeit vor und nach der Stimulation gezählt. Die Anzahl der Aktionspotentiale nach Stimulation wurde dann aus der Anzahl von Aktionspotentialen vor der Stimulation subtrahiert und mit zwei multipliziert, um die Änderungen in der Befeuerungsrate in jedem einzelnen Sensillum in Spikes pro Sekunde ¹⁵ zu quantifizieren.

Protokoll

1. Herstellung des Instruments, Stimuli Solutions, und Bed Bugs

1. Vorbereitung einer 50% KNO _{2 -Lösung (w} / v) in einer 20 ml Flasche.
2. Schärfen zwei Wolfram-Mikroelektroden in KNO _{2 -Lösung bei} 5 V durch wiederholtes Eintauchen der Wolframelektroden in und aus der Lösung.
   1. Etwa Schärfen der Wolframdraht durch Eintauchen von etwa 10 mm des Wolframdrahts in die und aus der KNO _{& sub2; -Lösung} mit einer Geschwindigkeit von 2 Dips / s für etwa 5 min, die das vordere Ende des Wolframdrahtes erheblich verbrauchen kann.
   2. Die Elektrode vorsichtig schärfen durch Eintauchen von etwa 1 mm von der Drahtspitze in die und aus der Lösung mit einer Geschwindigkeit von 2 Dips / sec für mindestens 1 min, um eine feine und scharfe Spitze der Elektrode bilden. Überprüfen Sie die Elektrodenspitze Durchmesser unter dem Mikroskop häufig, bis sie von 0,2 bis 0,5 & mgr; m, die fein genug, um die Nagelhaut von Bettwanzen olfaktorischen Sensillum Punktion sollte erreicht.
      Hinweis: Während manuell scharfkung der Elektrode, die Eintauchgeschwindigkeit des Wolframdrahtes in die KNO _{2 -Lösung} ist nicht konstant, die ganze Zeit. Mit der Praxis ist es viel einfacher, eine relativ konstante Drehzahl für die Präzisierung der Elektrode zu halten. Das Schärfen Es ist auch unsicher, je nachdem, wie fein die Elektrode sollte. Hier ist ausreichend genug, um durch das olfaktorische Sensillum stechen eine Elektrodenspitze mit einem Durchmesser von ~ 0,2 um.
3. Verdünnen jedes der chemischen Stimuli in Dimethylsulfoxid (DMSO) von der reine Verbindung zu einer Anfangskonzentration von 1:10 v / v als eine Stammlösung. Eine Serie von kleinen decadic Verdünnungen je nachdem, wie viele Dosen in dem Experiment mit DMSO Bedarf wieder von jeder der Vorratslösungen für jede Chemikalie. Hierbei kann die Verwendung von 10% (+) - β-Pinen und Eucalyptol.
4. Legen Sie die ungefüttert oder sieben Tage nach der Fütterung erwachsenen Wanzen (entweder männlich oder weiblich) vom Ft. Dix-Kolonie (ein Geschenk von Dr. Haynes in University of Kentucky) in t verwendet werdener in einer Petrischale zu experimentieren.
   Hinweis: Es gibt keine genaue Zahl für Bettwanzen in der Petrischale gelegt. Es kann ein paar oder eine Menge sein.

2. Bed Bug Antennen Vorbereitung

1. Betäuben die Bettwanzen auf Eis (2-3 min).
2. Fix sowohl die Antennen und Insektenkörpers auf einem Mikroskop Deckglas mit doppelseitigen Klebeband und entfernen Sie die Beine mit einer feinen Schere.
3. Verwenden Sie einen kleinen Stift, um sanft berühren Sie die Antenne, um sie auf dem Band stetig bleiben.
4. Ruhen die Deck gegen eine kleine Kugel (~ 1 cm Durchmesser) von Dentalwachs, um eine Manipulation zu erleichtern, und stellen sie einem geeigneten Winkel (~ 90 °) für die Aufzeichnungselektrode (Abbildung 1).
5. Einmal befestigt, legen Sie das Bett Bug unter einem Stereomikroskop, schalten Sie die Kaltlichtquelle und stellen Sie die Intensität der Beleuchtung, bis die Antenne übersichtlich dargestellt wird, und sich das Mikroskop auf die zweite Geißel der Bettwanze Antenne bei hoher Vergrößerung (720X) .
   Notiz: Die Intensität der Beleuchtung in dem Experiment verwendet wird nicht quantifiziert, das hängt wirklich davon ab, wie die Augen des Experimentators spüren Sie die Intensität der Beleuchtung.

3. Einzel Sensillum Recording

1. Verbinden den Vorverstärker (10X) mit der Signalerfassungssteuereinrichtung, die mit dem Computer für die Signalaufzeichnung und Visualisierung verbunden ist. Schalten Sie den Computer und starten Sie die Software, zB AutoSpike32 und klicken Sie auf "Record" -Modus aus der Menüleiste. Dann wählen Sie die "Welle", um die Aufzeichnung der Wellensignale zu starten.
   Hinweis: Eine flache Linie, die von links nach rechts des Monitors immer wieder sollte jetzt sichtbar sein. Hier dauert die Aufnahmefenster 40 sec. Max wave Aufnahme ist 10 Sek. Ausgewählte Abtastrate 96000 und digitale Abtastrate ist 240. Es gibt 0% Offset und keine Filterung, keine Berichtigung für die Aufnahmesignale. Nach Bedarf können alle diese Parameter in der Software geändert werden.
2. Einschalten des Lautsprechers an den Vorverstärker, der verwendet wird, um den Modus für die straffende neuronale Antworten von antennal Sensillum präsentieren verbunden.
3. Legen Sie die Referenzelektrode in die Bauchhöhle des stabilisierten Bett Bug.
   Anmerkung: Die Referenzelektrode wurde durch einen Metallständer gehalten, die magnetisch mit dem Lufttisch befestigt.
4. Nachdem die Referenzelektrode wurde auf der Bettwanze Leib verbunden wurde, bewegen Sie den Aufnahme-Elektrode, die mit dem Vorverstärker von einem Mikromanipulator zum hinteren Ende der Antenne des Bettwanze verbunden ist und manipuliert.
5. Wenn der Aufzeichnungselektrode in Kontakt mit der rechten Spitze der Antenne, schalten Sie das Mikroskop und suchen Sie die Elektrode bei geringer Vergrößerung.
6. Kann die Aufnahmeelektrode, während die schrittweise Erhöhung der Vergrßerung, bis sowohl die Elektrode und der Fühler Sensillum sind in der gleichen Ebene und unter dem Mikroskop sichtbar.
   Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt ist das Mikroskop üblichenly bei maximaler Vergrößerung.
7. Einfügen der Aufzeichnungselektrode in den Schaft des Sensillum mit dem Mikromanipulator und gehen ein wenig tiefer, wenn das Hintergrundrauschen hoch ist im Vergleich zu dem Aktionspotential.
8. Sobald klar Aktionspotentiale aus dem aufgezeichneten Sensillum beobachtet, füllen einer Mikropipette mit 10% (+) - β-Pinen. Verwenden Sie die Mikropipette auf 10 ul-Aliquot von 10% (+) zu hinterlegen - β-Pinen auf eine Filterpapierstreifen (~ 3 x 15 mm) in einer Glaspasteurpipette gesetzt.
   1. Verbinden den geladenen Pipetten zum Auslass des Impulsdurchflussrohr des Stimulus-Controller und Ort der Spitze der Pipette in die kleine Öffnung in der Röhre in Richtung der Antenne ausgerichtet sind.
9. Wenn alle diese Verbindungen stabilisiert drücken Fußschalters der Stimulus-Controller, um eine 0,5 sec Stoß Stimulus (0,5 l / min) in die kontinuierlich befeuchtete Luftstrom zu liefern. Die Aufnahme von Aktionspotentialen gleichzeitig ausgelöst werden, wenn der footswitch gedrückt. Der Aufnahmeprozess wird für 10 Sekunden ab 1 Sekunde vor der Stimulation letzte sein.
10. Zählen Sie die Aktionspotentiale off-line für zwei 500 ms Perioden, eine vor und eine nach der Stimulation. Subtrahieren jeder Änderung des Spike-Rate während der 500 ms nach der Stimulation der Spontanaktivität in den vorangegangenen 500 ms aufgenommen und konvertieren die Zählungen in den herkömmlichen Skala von Spitzen / s durch Multiplikation mit 2.

4. Stimulus Ersatz in der SSR

1. Sobald der Fußschalter ausgelöst wurde, liefern die 10% (+) - β-Pinen in der Pipette auf die Bettwanze Antennen und notieren Sie die Antwort auf diese spezifischen Duftstoff für 10 Sekunden, nach der die Pipette wird entfernt.
2. Etiketts über neue Pipette mit der 0,001% Eucalyptol getestet werden. Stellen ein kleines Stück Filterpapier, auf welche 10 ul des Stimulus angewendet wurde, in die neue Pipette.
3. Warten Sie 2-5 Minuten, bis der Stimulus ist völlig vaporiin der Glaspipette zed. Befestigen Sie die Pipette auf den Auslass des Impulsdurchflussrohr.
4. Setzen Sie die Pipettenspitze in die kleine Öffnung des Rohres in Richtung der Antenne ausgerichtet ist. Drücken Sie den Fußschalter und starten Sie die 10 Sek Aufnahme.
5. Trennen Sie die Pipette und bereiten eine andere Pipette mit 0,01% Eucalyptol.
6. Testen Sie den ganzen Rest der Dosen von Eukalyptol (von 0,001% bis 10%) an der Antennen Sensillen, die dosisabhängige Reaktionen zu beobachten. Testen aus dem die meisten zu verdünnen, um den am wenigsten verdünnten Dosen.

Ergebnisse

Einzel Sensillum Aufnahme ist eine leistungsfähige Untersuchungsverfahren in Studien von Insekten chemische Ökologie und neuronalen Physiologie verwendet. Die Untersuchung der neuronalen Antworten von Insekten, verschiedene flüchtige Verbindungen, insbesondere diejenigen gedacht, ökologisch Zusammenhang mit dem Überleben und die Entwicklung der Insekten zu sein, gibt uns nicht nur wertvolle Einblicke in die Insekten olfaction Prozess, sondern eröffnet auch vielversprechende neue Wege, di...

Diskussion

Die Einzel Sensillum Aufnahmetechnik wurde umfassend in die Prüfung der neuronalen Antworten der Insekten wie Fruchtfliegen, Mücken und Wanzen auf verschiedene chemische Reize in der Umgebung verwendet werden. Diese chemische Reize sind oft gelöst und in einem gemeinsamen Lösungsmittel, um unterschiedliche Dosen von Behandlungen vorzubereiten verdünnt. Allerdings können verschiedene Lösungsmittel ganz andere Freisetzungsraten für die Reize zu erzeugen. Frühere Studien bei einigen umfangreich untersucht Insekten wie ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Wolframdraht	A-M SYSTEMS	#716500	Wird zur Vorbereitung der Elektrode
KNO2	Sigma	#310484	Wird zum Schärfen des Wolframdrahtes
verwendet AC-Netzteil	BK Precision	1653A	Liefert die Spannung beim Schärfen des Wolframdrahtes
Leica Z6 APO Mikroskop Leica		10447424	Wird zur Beobachtung der Sensillen an Antennen verwendet
Simulus-Controller	Syntech	CS-55	Zur Steuerung der Stimulusanwendung
4-Kanal-USB-Erfassungscontroller	Syntech	IDAC-4	Echtzeit-Bildschirmanzeige aller Signale vor und während der Aufnahme
Lichtquelle	SCHOTT	A20500	Bereitstellung von Lichtquellen für die Beobachtung
Mikromanupulator	Leica	115378	Wird für geringfügige Bewegungen von Elektrodenlautsprecher
	Juster	95a	Verbunden mit dem Erfassungscontroller IDAC-4 und Ton für das Signal Magnetischer
Ständer	Narishige	GJ-1	Wird verwendet, um die Referenzelektrode, die stabilisierte Bettwanze und die Stimulusabgaberöhre
TMC Vibrationsisolationstisch	TMC	63-500	Wird verwendet, um die Schwingung von den Geräten
zu isolieren Deckglas	Tedpella	2225-1	Wird zum Halten der Bettwanze
verwendet Doppelseitiges Klebeband	3M	XT6110	Wird verwendet, um die Bettwanze auf dem Abdeckclip zu stabilisieren
Zahnwachs	Dentakit	DK-R012	Wird verwendet, um den Abdeckclip zu stützen, wo die Bettwanze stabilisiert ist