Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Zusammenfassung

Durch das Pfropfen von Kügelchen, die mit Wachstumsfaktoren oder spezifischen Inhibitoren von Signalwegen getränkt sind, in sich entwickelnde Embryonen ist es möglich, ihre Wirkung direkt in vivo zu testen. Bei diesem Protokoll werden Kügelchen in die Knospe der Gliedmaßen transplantiert, um die Auswirkungen dieser Moleküle auf die Genexpression und Signaltransduktion zu bestimmen.

Zusammenfassung

Mit Hühnerembryonen es möglich ist, zur direkten Prüfung der Wirkung von entweder Wachstumsfaktoren oder spezifische Inhibitoren von Signalwegen auf die Gen-Expression und Aktivierung von Signaltransduktionswegen. Diese Technik ermöglicht die Abgabe von Signalmolekülen an genau definierten Entwicklungsstadien für bestimmte Zeiten. Nach dieser Embryonen können geerntet werden und Genexpression untersucht, beispielsweise durch in situ Hybridisierung oder Aktivierung des Signals mit der Immunfärbung beobachtet Übertragungswegen.

In diesem Video-Heparin-Perlen in FGF18 getränkt oder AG 1-X2 Perlen in U0126, ein MEK-Inhibitor eingeweicht, in die Gliedmaßenknospe in ovo gepfropft. Dies zeigt, dass FGF18 induziert die Expression von MyoD und ERK Phosphorylierung und sowohl endogene als auch FGF18 induziert MyoD Expression durch U0126 gehemmt. Perlen in einer Retinsäure Antagonisten getränkt können vorzeitige MyoD Induktion durch FGF18 potenzieren.

Dieser Ansatz kann unsed mit einer Vielzahl von verschiedenen Wachstumsfaktoren und Inhibitoren und wird leicht auf andere Gewebe in den sich entwickelnden Embryo angepasst.

Einleitung

Vogelembryonen haben ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Entwicklung seit vielen Jahren ¹ vorgesehen. Eines ihrer nützlichen Eigenschaften ist, dass sie relativ einfach zu manipulieren sind. Externe Entwicklung macht es möglich, das Ei zu öffnen, um den Embryo zugreifen und verschiedene Mikromanipulationen mit Beispielen wie dem klassischen Wachtel-Küken Chimärensystem zur Untersuchung des Zellschicksals ^2,3, die Injektion von Retroviren für die Überexpression in bestimmten Geweben während der Entwicklung ^4,5 und Explantatkultur ^{entwicklungsSignalQuellen} 6 zu identifizieren. Jüngerer Chimären zwischen unm....

Protokoll

Ethics Statement: Alle diese Versuche folgen der Tierpflege und ethischen Richtlinien der University of Nottingham.

1. Herstellung von Heparin-Korne für Pfropfen

1. Waschen Sie Heparin Perlen sorgfältig in PBS vor dem Gebrauch. Hinweis: Die Glasperlen können bei 4 ° C als Aufschlämmung in PBS gelagert werden.
   1. Wählen Perlen zum Pfropfen von ihnen aus dem Lager entfernt mit einer 20 ul Pipette in ein 1 ml Tropfen PBS. Dann mit einem Mikropipette bis 2 & mgr; l eingestellt, um die Kügelchen in eine 20 & mgr; l Tropfen PBS in einer 3 cm Petrischale übertragen. Wählen Perlen basierend auf Größe und mit einem S....

Ergebnisse

HH Stufe 21 MyoD ist nicht in sich entwickelnden Gliedmaßen Myoblasten obwohl Färbung kann myotome der Entwicklungs Somiten (1A) zu sehen ist, ausgedrückt. 1B zeigt in situ Hybridisierung für MyoD 6 h nach einer FGF18 Wulst Transplantats. MyoD in Myoblasten dicht an dem Wulst induzierten während es keinen Ausdruck in der kontralateralen Extremität. Co-Pfropfen eines Wulstes in U0126 getränkt, einen spezifischen Inhibitor von MEK, Blöcke FGF18 Induktion von MyoD (Abbildu.......

Diskussion

Die Verwendung von Transplantaten Wulst unmittelbar entwickelnden Geweben in ovo angelegt ist ein mächtiges Werkzeug, um die Rolle von Wachstumsfaktor-Signalweges während der Entwicklung geben beispiellose Kontrolle über die Entwicklungsstufe, bei der sie angewendet werden, und die Dauer der Exposition zu sezieren.

Die Wahl der Wulst für jede Art von Molekülen ist wichtig. Kleinen hydrophoben Molekülen, wie den hier beschriebenen Inhibitoren und Retinsäure, normalerweise gut binden derivatis.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Heparin Acrylkügelchen	Sigma	H5263	Die verwendeten Acryl-Heparinkügelchen wurden abgekündigt. Es ist jedoch ein Ersatzprodukt erhältlich, Heparin-Agarose-Kügelchen, Kat.-Nr. H6508. Diese sind transparent, so dass sie schwieriger zu verarbeiten sind, können aber auf die gleiche Weise mit Phenolrot gefärbt werden wie AG 1-X2 Kügelchen,
AG 1-X2 Kügelchen	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blaue Kügelchen	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	Diese Kügelchen wurden mit einer Reihe von Wachstumsfaktoren verwendet, einschließlich Shh und FGFs, und können verwendet werden, um Heparinkügelchen
zu ersetzen FGF18	Peprotech	100-28	Resuspendieren Sie in PBS mit 0/1 % BSA, bereiten Sie Einweg-Aliquots von 0,5-1 ul vor und lagern Sie sie bei -80 °C. Chargen und Lieferanten können variieren, daher sollten unterschiedliche Konzentrationen getestet werden, um eine wirksame Dosis zu bestimmen.
U0126	Cell Signalling	9903	Auf 20 mM Lagerbestand in DMSO herstellen und in Einmal-Aliquoten bei -80 °C aufbewahren. Vor Licht schützen.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	DMSO resuspendieren und in Einmal-Aliquoten bei -80 °C aufbewahren. Vor Licht schützen.
Schwarze Tusche	Windsor and Newton	5012572003384 (30 ml)	Obwohl Alternativen zu diesem Produkt verfügbar sind, ist Vorsicht geboten, da einige Tinten für Embryonen giftig sind
Wolframdraht, Ø 0,1 mm 99,95	Alfa Aesar	10404
Penicillin / Streptomycin	Sigma	P0781	100X in PBS/Tinte und PBS/FCS verdünnen

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