Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Zusammenfassung

Durch das Pfropfen von Kügelchen, die mit Wachstumsfaktoren oder spezifischen Inhibitoren von Signalwegen getränkt sind, in sich entwickelnde Embryonen ist es möglich, ihre Wirkung direkt in vivo zu testen. Bei diesem Protokoll werden Kügelchen in die Knospe der Gliedmaßen transplantiert, um die Auswirkungen dieser Moleküle auf die Genexpression und Signaltransduktion zu bestimmen.

Zusammenfassung

Mit Hühnerembryonen es möglich ist, zur direkten Prüfung der Wirkung von entweder Wachstumsfaktoren oder spezifische Inhibitoren von Signalwegen auf die Gen-Expression und Aktivierung von Signaltransduktionswegen. Diese Technik ermöglicht die Abgabe von Signalmolekülen an genau definierten Entwicklungsstadien für bestimmte Zeiten. Nach dieser Embryonen können geerntet werden und Genexpression untersucht, beispielsweise durch in situ Hybridisierung oder Aktivierung des Signals mit der Immunfärbung beobachtet Übertragungswegen.

In diesem Video-Heparin-Perlen in FGF18 getränkt oder AG 1-X2 Perlen in U0126, ein MEK-Inhibitor eingeweicht, in die Gliedmaßenknospe in ovo gepfropft. Dies zeigt, dass FGF18 induziert die Expression von MyoD und ERK Phosphorylierung und sowohl endogene als auch FGF18 induziert MyoD Expression durch U0126 gehemmt. Perlen in einer Retinsäure Antagonisten getränkt können vorzeitige MyoD Induktion durch FGF18 potenzieren.

Dieser Ansatz kann unsed mit einer Vielzahl von verschiedenen Wachstumsfaktoren und Inhibitoren und wird leicht auf andere Gewebe in den sich entwickelnden Embryo angepasst.

Einleitung

Vogelembryonen haben ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Entwicklung seit vielen Jahren ¹ vorgesehen. Eines ihrer nützlichen Eigenschaften ist, dass sie relativ einfach zu manipulieren sind. Externe Entwicklung macht es möglich, das Ei zu öffnen, um den Embryo zugreifen und verschiedene Mikromanipulationen mit Beispielen wie dem klassischen Wachtel-Küken Chimärensystem zur Untersuchung des Zellschicksals ^2,3, die Injektion von Retroviren für die Überexpression in bestimmten Geweben während der Entwicklung ^4,5 und Explantatkultur ^{entwicklungsSignalQuellen} 6 zu identifizieren. Jüngerer Chimären zwischen unmarkiertem Hosts mit Transplantaten von einem transgenen Huhn Linie, die GFP generiert hat gezeigt, dass die Kombination von klassischen Pfropfen und genetische Modifikation kann wichtige Einsichten in die Entwicklung ^7,8 bereitzustellen.

Die Leichtigkeit, mit der der Vogelembryo kann manipuliert werden, ist es ein hervorragendes Modell für die Untersuchung des Körpers gemachtEntwicklungs ^9. Anwendung spezifischer Wachstumsfaktoren auf die Entwicklung Gliedmaßen in vivo war maßgeblich an der Identifizierung von Faktoren, die Gliedmaßen Musterung ^10,11 verändern und weiterhin Einblicke in diesen Prozess ¹² bereitzustellen. Dieser Ansatz ist auch verwendet worden, um die Faktoren, die die Entwicklung der Muskulatur regulieren zu studieren und hat Rollen für zahlreiche Signale wie Wnts ^{13, 14 und} BMPs HGF ¹⁵ freigelegt.

Kürzlich wurde diese Technik verwendet, um die Signale, die myogene Genexpression in der Extremitätenknospe untersuchen und zu zeigen, dass Interaktionen zwischen FGF18 und Retinsäure kann das Timing MyoD Expression ^{16 zu steuern.} Mit einer Kombination von Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle, die auf Kügelchen geladen werden kann und dann direkt in spezifischen Geweben in bestimmten Entwicklungsstadien gepfropft die Möglichkeit gibt, zu fast jeder Zeit und Region bei der Entwicklung einzugreifen. Dies wurde verwendet, um INVEstigate viele Prozesse einschließlich Somiten Musterung ^17,18, neuronale Spezifikation ^19, Neuralleiste Migration ^{20 und} Achse ^{Verlängerung} 21.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Pfropfen von Kügelchen in entweder Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren in der Entwicklung Hühnerschenkel eingeweicht. Dies kann genutzt werden, um die Auswirkungen dieser Signale auf myogenesis durch Analysieren muskelspezifische Genexpression in situ-Hybridisierung zu bestimmen. Wir beschreiben Transplantate unter Verwendung von entweder Heparin getränkten Kügelchen, die für Wachstumsfaktoren oder AG 1-X2 Perlen für kleine hydrophobe Moleküle, wie Retinsäure oder Kleinmolekül-Inhibitoren spezifischer Signalwege verwendet. Aber auch andere Perlen sind ebenfalls verfügbar, die verwendet wurden, um sowohl FGFs und Shh ^{23 22} zu liefern.

Protokoll

Ethics Statement: Alle diese Versuche folgen der Tierpflege und ethischen Richtlinien der University of Nottingham.

1. Herstellung von Heparin-Korne für Pfropfen

1. Waschen Sie Heparin Perlen sorgfältig in PBS vor dem Gebrauch. Hinweis: Die Glasperlen können bei 4 ° C als Aufschlämmung in PBS gelagert werden.
   1. Wählen Perlen zum Pfropfen von ihnen aus dem Lager entfernt mit einer 20 ul Pipette in ein 1 ml Tropfen PBS. Dann mit einem Mikropipette bis 2 & mgr; l eingestellt, um die Kügelchen in eine 20 & mgr; l Tropfen PBS in einer 3 cm Petrischale übertragen. Wählen Perlen basierend auf Größe und mit einem Stereo-Binokular, Transfer ausgewählten Perlen mit einem P2 Pipettenspitze; die um 100 & mgr; m Durchmesser sind ideal.
2. Entfernen Sie das PBS aus den Perlen. Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit mit einer 20 ul Pipette und der Restflüssigkeit durch Kapillarwirkung mit feinen Uhrmacher Pinzette. Anmerkung: Es ist wichtig, so viel wie möglich, damit das Wachstum facto entfernenR nicht verdünnt, wenn es an den Beads zugegeben.
3. Pipettieren den Wachstumsfaktor direkt auf die Perlen. Für FGF18 werden 0,5 ul rekombinanter FGF18 bei 0,5 mg / ml in 0,1% BSA in PBS rekonstituiert. Einige Tropfen von Wasser um die Ränder der Schale, um die Flüssigkeit verflüchtigt.
4. Inkubieren der Kügelchen für 1 h bei RT. Nehmen Sie die Tropfen von Wasser aus der Schale mit einer Pasteurpipette und auf Eis bereit für die Transplantation.
5. Bei Bedarf (für transparente Kügelchen) Transfer 4-5 Kügelchen bis 2% Phenolrot vor dem Pfropfen zu helfen, zu visualisieren. Spülen in PBS vor der Übertragung auf den Embryo.

2. Herstellung der AG 1-X2 Perlen zum Pfropfen

1. Vor derivatisieren Perlen mit 0,2 N Ameisensäure verwenden.
   1. Verwenden Sie hierzu einen Spachtel, um die Kügelchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. In 1 ml 0,2 N Ameisensäure und waschen auf einem Schütteltisch für 1 Stunde.
   2. Entfernen Sie dann die Ameisensäure mit einer Pipette p1000 und ersetzen 1ml Wasser. Waschen für 1 Stunde und wiederholen Sie sechs Mal zu entfernen restlichen Ameisensäure.
   3. Entfernen Sie verbleibende Flüssigkeit mit einer Pipette p1000 und die Perlen lagern bei 4 ° C. Anmerkung: Es ist nicht notwendig, alle das Restwasser in dieser Stufe zu entfernen.
2. Entfernen Sie ein kleines Pellet von Kügelchen von etwa 5-10 & mgr; l Volumen aus dem Bestand mit einem kleinen Spatel in eine 3 cm Petrischale und 1 ml DMSO (oder je nachdem, was Lösungsmittel der Wirkstoff gelöst in). Hinweis: Diese sollten mehrere hundert Perlen, von denen diejenigen, die richtige Größe zu wählen ist.
3. Dann mit einem P2 Pipette 2 ul eingestellt, um die Kügelchen von etwa 100 & mgr; m Durchmesser zu einem 20 ul Tropfen Lösungsmittel in einem anderen 3 cm Petrischale übertragen.
4. Entfernung des Lösungsmittels mit einem 20 ul-Pipette und einer restlichen Lösungsmittels mit einem 2 & mgr; l-Pipette. Ersetzen mit 20 ul des Arzneimittels angewandt werden.
   HINWEIS: Konsistenz auflösen das Medikament in einer Konzentration von 100 uM in DMSO (oder die überhaupt Lösungsmittel verwendet wird),Aliquot in 20 & mgr; l und bei -80 ° C nach einigen niedermolekularen Inhibitoren sind instabil und es ist am besten wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Gegebenenfalls anschließend die verdünnte Medikament auf die gewünschte Konzentration vor dem Einweichen Perlen. Wirksame Konzentrationen müssen am besten empirisch für jedes Arzneimittel bestimmt.
5. Inkubation für 1 Std. Vor Licht, da viele dieser Moleküle Licht empfindlich sind.
6. Vor der Transplantation Transfer 4-5 Perlen mit einer p2 Pipette 2 ul in 20 ul 2% Phenolrot in Wasser gelöst gesetzt. Führen Sie diesen Schritt mit Hilfe eines Stereo Binokular, um die Perlen zu visualisieren. Entfernen Sie eine einzelne Perle mit feinen Uhrmacher Pinzette oder eine Drahtschleife und spülen in PBS vor der Übertragung auf den Embryo. NOTleave Kügelchen in 2% Phenolrot für mehr als 15 min vor der Verwendung, da dies zu Aktivitätsverlust führen.

3. Vorbereitung Tungsten Nadeln

1. Fein geschnitten Wolframdraht in 3-4 cm Länge. Stecken Sie ein Stück Draht in das Endeein Glas Pasteurpipette und Schmelze in einem Bunsenbrenner in Position zu fixieren. Vorbereitung bis zu 10 Nadeln, um sicherzustellen, dass es Ersatzteile, wenn sie während des Gebrauchs beschädigt werden.
2. Legen Sie das Ende des Drahtes in einer Lötlampe Flamme und halten Sie ihn dort, bis die Wolfram leuchtet weiß und die Spitze ist scharf (ca. 2-3 min). Hinweis: Während der Verwendung kann die Nadel gereinigt werden und in der Lötlampe nach Bedarf neu geschärft.
   HINWEIS: Diese Nadeln können auch verwendet werden, um Schleifen für die Übertragung von Perlen zu machen. Berühren Sie leicht die Nadel auf der Bank, und es wird zu biegen, um eine Schleife zu bilden.

4. Vorbereitung Embryonen für Bead Grafts

1. Eier auszubrüten mit dem stumpfen Ende, bis sie die gewünschte Stufe (3-5 Tage für die meisten Gliedmaßenknospe Manipulationen) zu erreichen. Verwendung stumpfen Pinzette Hahn auf dem stumpfen Ende, um die Schale zu brechen und verwenden Sie dann die Zange, um die Schale zu entfernen und setzen den Embryo. Sicherstellen, dass die Eierschalenmembran wird ebenfalls entfernt.
   HINWEIS: 1-2 ml PBS mit einer Pasteur-Pipette, um mit Unterstützungs hinzugefügt werdenDies, wenn die Membran klebt an den Dotter. Gently Pipette den PBS auf die Oberfläche des Dotters, fassen Sie die Membran mit der Zange, kümmert sich nicht um das Eigelb beschädigen, und ziehen Sie sie vorsichtig aus dem Ei.
2. Entfernen Sie bis zu 5 ml Albumin aus dem Ei mit einer 10-ml-Spritze und einer 19 G-Nadel. Sich nur so weit wie notwendig, um den Embryo nicht Kontakt mit dem Band verwendet wird, um das Ei die Entfernung von größeren Volumina abdichten kann Embryoüberlebensraten zu reduzieren gewährleisten.
3. Zur Visualisierung der Embryo fügen Sie ein 5-6 Tropfen Künstler Tusche 15 ml PBS mit 100 U Penicillin und Streptomycin 0,1 mg / ml. Injizieren 0,5-1 ml direkt nach dem Embryo mit einer 1 ml Spritze und einer 25 G-Nadel.
4. Hinzuzufügen 2-3 ml PBS mit 1% fötalem Kälberserum und 100 U Penicillin und Streptomycin 0,1 mg / ml in das Ei, um den Embryo nicht austrocknen zu gewährleisten. Verwendung geschärft Uhrmacher Pinzette entfernen Sie die Dotterhaut und öffnen Sie das Amnion über die Entwicklung von Extremitätenknospen. Stellen Sie sicher, der Embryo nicht austrocknet und, Falls erforderlich, fügen Sie mehr PBS / FCS.
   HINWEIS: Die Extremitätenknospen deutlich als gepaart Auswüchse an der Flanke des Embryos sichtbar. In diesen Stadien der Embryo wird sich solche auf der rechten Seite ist in der Regel nach oben. Als Ergebnis ist es normalerweise einfacher, Perlen in die rechten Schenkel Transplantat mit den Links- als diejenigen kontralateralen Kontrollen.
5. Verwenden Sie einen geschärften Wolfram-Draht, um einen Einschnitt in die Gliedmaßenknospe, wo der Wulst wird implantiert werden zu machen. Vermeiden Sie das Schneiden den ganzen Weg durch die Gliedmaßenknospe, wo möglich, obwohl in jüngeren Stadien ist dies schwierig.
   HINWEIS: Bei älteren Embryonen (HH-Stufe 22 und höher) ist es möglich, bestimmte Regionen der Extremitätenknospe zum Pfropfen aber in jüngeren Stadien ist dies schwieriger, wenn die Extremitätenknospe selbst klein zu wählen. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass der Extremitätenknospe wird über die gepfropft Perle wachsen so, besonders bei jüngeren Stadien, die Perle in der proximalen Extremitäten bleiben.
6. Pick-up ein Wulst entweder von der Wachstumsfaktor oder Drogen entweder extra fein watchmakers Zange oder eine Schleife aus einer Wolfram Nadel gemacht. Wenn die Raupe hat entweder DMSO oder Phenolrot getränkt gründlich in PBS vor dem Auftragen auf den Embryo. Übertragen Sie die Perle auf den Embryo mit der Zange / Drahtschleife. Dann nutzen Sie die geschärften Wolfram-Draht, um den Wulst in den Einschnitt einzufügen.
7. Fügen Sie 1-2 ml PBS / FCS auf das Ei sicher, dass der Embryo hydratisiert gehalten, aber vermeiden, die Anwendung direkt auf den Embryo selbst, da dies die Embryonen schädigen und die Wulst zu verdrängt werden. Dichten Sie das Ei mit Band und zurück in den Inkubator.

Ergebnisse

HH Stufe 21 MyoD ist nicht in sich entwickelnden Gliedmaßen Myoblasten obwohl Färbung kann myotome der Entwicklungs Somiten (1A) zu sehen ist, ausgedrückt. 1B zeigt in situ Hybridisierung für MyoD 6 h nach einer FGF18 Wulst Transplantats. MyoD in Myoblasten dicht an dem Wulst induzierten während es keinen Ausdruck in der kontralateralen Extremität. Co-Pfropfen eines Wulstes in U0126 getränkt, einen spezifischen Inhibitor von MEK, Blöcke FGF18 Induktion von MyoD (Abbildu...

Diskussion

Die Verwendung von Transplantaten Wulst unmittelbar entwickelnden Geweben in ovo angelegt ist ein mächtiges Werkzeug, um die Rolle von Wachstumsfaktor-Signalweges während der Entwicklung geben beispiellose Kontrolle über die Entwicklungsstufe, bei der sie angewendet werden, und die Dauer der Exposition zu sezieren.

Die Wahl der Wulst für jede Art von Molekülen ist wichtig. Kleinen hydrophoben Molekülen, wie den hier beschriebenen Inhibitoren und Retinsäure, normalerweise gut binden derivatis...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Heparin Acrylkügelchen	Sigma	H5263	Die verwendeten Acryl-Heparinkügelchen wurden abgekündigt. Es ist jedoch ein Ersatzprodukt erhältlich, Heparin-Agarose-Kügelchen, Kat.-Nr. H6508. Diese sind transparent, so dass sie schwieriger zu verarbeiten sind, können aber auf die gleiche Weise mit Phenolrot gefärbt werden wie AG 1-X2 Kügelchen,
AG 1-X2 Kügelchen	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blaue Kügelchen	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	Diese Kügelchen wurden mit einer Reihe von Wachstumsfaktoren verwendet, einschließlich Shh und FGFs, und können verwendet werden, um Heparinkügelchen
zu ersetzen FGF18	Peprotech	100-28	Resuspendieren Sie in PBS mit 0/1 % BSA, bereiten Sie Einweg-Aliquots von 0,5-1 ul vor und lagern Sie sie bei -80 °C. Chargen und Lieferanten können variieren, daher sollten unterschiedliche Konzentrationen getestet werden, um eine wirksame Dosis zu bestimmen.
U0126	Cell Signalling	9903	Auf 20 mM Lagerbestand in DMSO herstellen und in Einmal-Aliquoten bei -80 °C aufbewahren. Vor Licht schützen.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	DMSO resuspendieren und in Einmal-Aliquoten bei -80 °C aufbewahren. Vor Licht schützen.
Schwarze Tusche	Windsor and Newton	5012572003384 (30 ml)	Obwohl Alternativen zu diesem Produkt verfügbar sind, ist Vorsicht geboten, da einige Tinten für Embryonen giftig sind
Wolframdraht, Ø 0,1 mm 99,95	Alfa Aesar	10404
Penicillin / Streptomycin	Sigma	P0781	100X in PBS/Tinte und PBS/FCS verdünnen