Optogenetische Functional MRI

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte und Datenanalysen, die für eine erfolgreiche Durchführung der optogenetischen funktionellen Magnetresonanztomographie (ofMRT) erforderlich sind. ofMRT ist eine neuartige Technik, die die Hochfeld-fMRT-Auslesung mit optogenetischer Stimulation kombiniert und so eine zelltypspezifische Kartierung funktioneller neuronaler Schaltkreise und ihrer Dynamik im gesamten lebenden Gehirn ermöglicht.

Abstract

Die Untersuchung der funktionellen Konnektivität präziser neuronaler Schaltkreise über das gesamte intakte Gehirn kann durch optogenetische funktionelle Magnetresonanztomographie (ofMRT) erreicht werden, eine neuartige Technik, die die relativ hohe räumliche Auflösung der Hochfeld-fMRT mit der Präzision der optogenetischen Stimulation kombiniert. Faseroptiken, die es ermöglichen, bestimmte Wellenlängen des Lichts tief in das Gehirn in vivo zu bringen, werden in Regionen von Interesse implantiert, um gezielt gezielte Zelltypen zu stimulieren, die genetisch dazu gebracht wurden, lichtempfindliche Transmembran-Leitfähigkeitskanäle, sogenannte Opsine, zu exprimieren. fMRT wird verwendet, um eine nicht-invasive Methode zur Bestimmung der globalen dynamischen Reaktion des Gehirns auf optogenetische Stimulation spezifischer neuronaler Schaltkreise durch Messung des blutsauerstoffabhängigen (BOLD) Signals bereitzustellen, das eine indirekte Messung der neuronalen Aktivität ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion von faseroptischen Implantaten, die Implantationsoperationen, die Bildgebung mit Photostimulation und die Datenanalyse, die für eine erfolgreiche Durchführung der MRT erforderlich sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die präzise Stimulation und die Fähigkeit zur Überwachung des gesamten Gehirns durch die ofMRT entscheidende Faktoren sind, die ofMRT zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung der Konnektomik des Gehirns sowohl im gesunden als auch im kranken Zustand machen.

Introduction

Optogenetische funktionelle Magnetresonanztomographie (ofMRI) ist eine neue Technik, die die räumliche Auflösung der Hochfeld - fMRI mit der Präzision der optogenetische Stimulation typspezifische Kartierung funktioneller neuronaler Schaltkreise und deren Dynamik in der gesamten kombiniert ^1-11,38, so dass Zell Gehirn. Optogenetik ermöglicht für bestimmte Zelltypen für die Stimulation durch die Einführung der lichtempfindlichen Transmembranleitfähigkeitskanäle, genannt Opsinen ausgerichtet werden. Spezifische Elemente der neuronalen Schaltkreise sind genetisch modifiziert , dass diese Kanäle zum Ausdruck bringen, so dass Millisekunden-Zeitskala Modulation der Aktivität im intakten Gehirn ^15.01. fMRI bietet eine nicht-invasive Methode des Gehirns der globalen Dynamik auf optogenetische Stimulation spezifischer neuronaler Schaltkreise durch Messung der Blut-Sauerstoff-Niveau abhängig (BOLD - Signal) Bestimmung ^16-18, die eine indirekte Messung der neuronalen Aktivität zur Verfügung stellt.

Die Kombination dieser beiden Techniken, optogenetische funktionelle Magnetresonanztomographie (ofMRI) bezeichnet wird, ist vorteilhaft gegenüber anderen Methoden zur Erfassung der Hirnaktivität während der Stimulation wie Elektrophysiologie, weil sie einen Blick auf das gesamte Gehirn bei relativ hoher räumlicher Auflösung zur Verfügung stellen kann. Dies ermöglicht die Erkennung von neuronaler Aktivität in Reaktion auf gezielte Stimulation in großer Entfernung von dem Ort der Stimulation ohne die Notwendigkeit für eine Implantation invasiver Aufzeichnungselektroden ^1-11. ofMRI ist vorteilhaft gegenüber dem traditionellen Verfahren zur Durchführung einer elektrischen Stimulation während fMRI, die unterschiedliche Zelltypen in der Nähe der Elektrode zu rekrutieren und damit den kausalen Einfluss jeder ¹⁹ Einwohner verwechseln. Außerdem werden die Elektroden zur elektrischen Stimulation und der erzeugte Strom Artefakte während der MR - Bildgebung ²⁰ erzeugen kann. Tatsächlich ermöglicht ofMRI die Beobachtung des Einflusses auf die globale Hirnaktivität aus der spezifischen modulatiauf einer breiten Vielfalt von Zelltypen durch die Verwendung von fortschrittlichen genetischen Targeting Techniken wie das Cre-Lox-System in transgenen Tieren oder die Verwendung von Promotoren. Kombinatorische optische Steuerung mit ganzem Gehirn Überwachung ist mit ofMRI durch die Verwendung von sowohl NpHR zu hemmen und ChR2 spezifischen Zelltypen zu erregen. Die optogenetische Toolkits für den Einsatz in ofMRI verbessert sich ebenfalls schnell im Laufe der Zeit mit der Einführung von Opsinen mit erhöhter Lichtempfindlichkeit oder eine verbesserte Kinetik stabilisierter Stufenfunktion Opsinen (SSFOs) oder rotverschoben Opsinen, die die Anforderung für implantierte Faser negieren können Optik, ermöglicht nicht-invasive Stimulation während der Bildgebung ^21. Diese Möglichkeiten sind nicht mit elektrischer Stimulation zur Verfügung.

Jedoch resultierende Signal Artefakte aus Gewebeerwärmung durch Lichtabgabe im Gehirn wurden ²² gemeldet, wo temperaturbedingte Modifikation von Relaxationszeiten hat sich gezeigt , Pseu herzustellentun Aktivierung. Forscher ofMRI Durchführung deshalb sollten sich bewusst dieses Potenzial verwechseln sein. Mit der richtigen Einstellung und Kontrollen kann das Problem angegangen werden. Zusätzlich relativ geringe zeitliche Auflösung der hämodynamischen Antwort in fMRI Messung kann ein limitierender Faktor für bestimmte Anwendungen dieser Technik sein.

Dieses Protokoll beschreibt zunächst den Aufbau der Lichtwellenleiter - Implantate , die Lieferung von spezifischen Wellenlängen von Licht tief in das Gehirn in vivo ermöglichen. Das Protokoll beschreibt dann die Lieferung des Opsin-kodierenden viralen Vektor auf einen präzisen Hirnregion stereotaktischen Chirurgie verwendet wird. Als nächstes wird das Protokoll beschreibt den Prozess der Whole-Brain funktionellen MRT bei gleichzeitiger Lichtstimulation. Schließlich beschreibt das Protokoll grundlegende Datenanalyse der erfassten Daten.

Zu beachten ist, beschrieben die Optogenetik hier erfordern eine chronische Implantat zur Lichtabgabe. Jedoch sind die Lichtwellenleiter-Implantate stabil und bio-kompatible, so dass für Längs Abtastung und Untersuchung von neuronalen Schaltkreise über einen Zeitraum von mehreren Monaten ^23,24.

Zusammengefasst sind die präzise Stimulation und Whole-Brain-Überwachung Fähigkeit von ofMRI entscheidenden Faktoren bei der Herstellung eines leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der connectomics des Gehirns ofMRI. Darüber hinaus kann es neue Einblicke in die Mechanismen der neurologischen Erkrankungen ²⁵ liefern , wenn sie mit verschiedenen Tiermodellen gekoppelt. Tatsächlich hat ofMRI verwendet, um die Netzwerkaktivität verschiedener hippokampalen Subregionen mit Anfällen ⁸ verbunden zu erläutern. Deshalb interessiert Laboratorien Systemebene neurowissenschaftlichen Fragen zu beantworten wird diese Technik von Bedeutung finden.

Protocol

Ethik-Statement: Experimentelle Verfahren hier wurden von der Stanford University Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt.

1. Vorbereiten Patchkabel und Zwinge Implantate

Hinweis: Obwohl Patchkabel und Zwinge Implantate im Handel erhältlich sind, produzieren diese in-house Spezialität Designs ermöglicht und weniger kosten.

1. einen Faserverbindungskabel zum Zuführen von Licht von dem Laser auf das Implantat im Gehirn, spalten zuerst die optische Faser auf die gewünschte Länge herzustellen.
   1. Unter Verwendung eines Faser-Spalter, beenden die optische Faser ein flaches Ende am Anschlusspunkt zu erzeugen. Wenn die Faser mit einem Mantel überzogen ist, abzustreifen die Jacke vorher mit einem faser Abisolierwerkzeug aus.
   2. Abzuspalten das andere Ende der optischen Faser um die gewünschte Länge für das Kabel zu erzeugen, so dass das Kabel von der Lichtquelle an das Tier innerhalb der Bohrung zu erstrecken lang genug ist,der Scanner.
2. Mischen, um eine kleine Menge an Epoxy-Klebstoff in einer 1: 1-Verhältnis auf ein Stück Aluminiumfolie kurz vor dem nächsten Schritt, wie die Epoxy-Kleber für die Verwendung nach dem Mischen 5 min zu viskos wird.
3. Mit einem kleinen Holzstäbchen vorsichtig Epoxid-Kleber auf den Teil der Faser gelten, die innerhalb der konkaven Seite der Keramikring platziert werden und gelten dann einen kleinen Tropfen auf die Oberfläche der flachen Seite des Ringes. Nachdem es in die Zwinge Einsetzen sicherzustellen, daß eine kleine Länge der Faser (<0,5 mm) von der Flachseite der Keramikhülse vorsteht. Lassen Sie den Epoxid-Kleber O / N, um optimale Ergebnisse zu härten.
4. Auf der Seite des LWL-Patchkabel, das mit der Laserlichtquelle verbinden wird, sanft Epoxid-Kleber auf den Teil der Faser, die in der konkaven Seite der Zwinge des FC / PC-Anschluss platziert wird und dann geben Sie eine kleine Anwendung fallen auf die Oberfläche der flachen Seite der Ferrule. Nachdem es in die Zwinge Einsetzen sicherzustellendaß eine kleine Länge der Faser (<0,5 mm) ragt von der flachen Seite des Ringes. Lassen Sie den Epoxid-Kleber O / N, um optimale Ergebnisse zu härten.
5. Polieren Sie das flache Ende der Ferrulen für beide Seiten des Kabels mit einer Polierscheibe mit von Pinzette mit sanften Druck auf die Hülse aufzubringen, während machen Figur-8 Drehungen auf Aluminiumoxid Läppen Blätter (von 3 & mgr; m bis 1 & mgr; m bis 0,3 & mgr; m Körnung ).
6. Untersuchen Sie das flache Ende der Hülse mit einem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des flachen Ende, einschließlich der LWL-Oberfläche selbst, frei von jeglicher Epoxid-Kleber ist; weiter Polieren wenn Epoxid-Kleber auf der Oberfläche bleibt. Stellen Sie sicher, dass die faseroptische Oberfläche nicht gebrochen oder gesäumt wurde.
   ACHTUNG: Stellen Sie sicher, Personal geeignete Klassen Training Lasersicherheit und Laserschutzbrille tragen, bevor Laser-Geräte Handhabung.
7. Schließen Sie das LWL-Patchkabel mit dem Laserlichtquelle durch den FC / PC-Anschluss und richten Sie die fiber Spitze auf den Brennpunkt des Kopplers. Messen Sie die Lichtübertragungsleistung der Faser mit einem Leistungsmesser, um eine angemessene Lichtleistung zu gewährleisten.
   Hinweis: Die folgenden Schritte zur Herstellung von Keramikringen mit Faseroptik für chronische Implantation in das Gehirn sind; Keramikringe sind hohl in der Mitte und tragen Glasfaser Licht, das von einem Patch-Kabel zu einer Region von Interesse (ROI) innerhalb des Gehirns zu liefern.
8. Unter Verwendung eines Faser-Spalter, beenden die optische Faser ein flaches Ende am Anschlusspunkt zu erzeugen. Wenn die Faser mit einem Mantel überzogen ist, abzustreifen die Jacke vorher mit einem faser Abisolierwerkzeug aus.
9. Abzuspalten das andere Ende der optischen Faser um die gewünschte Länge zur Implantation in das Gehirn zu erzeugen. Bestimmen die Länge der Faser einen stereotaktischen Atlas unter Verwendung der ROI innerhalb des Gehirns zu zielen.
   1. Zum Beispiel: dorsalen Hippocampus in rat Ziel, die 3,5 mm unterhalb Bregma ist, sicherzustellen, dass die Länge der Faser vom ferrul abstehendene beträgt 3,5 mm + 0,25 mm, einem Anteil von Schädeldicke und damit für Fehlermarge. Prüfen Sie daher, dass die endgültige Länge der Faser 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (Länge der Zwinge) = 14,25 mm.
10. Mischen, um eine kleine Menge an Epoxy-Klebstoff in einer 1: 1-Verhältnis auf ein Stück Aluminiumfolie kurz vor dem nächsten Schritt (den Epoxykleber zu viskos zur Verwendung 5 min nach dem Mischen).
11. Mit einem kleinen Holzstäbchen vorsichtig Epoxid-Kleber auf den Teil der Faser gelten, die innerhalb der konkaven Seite der Keramikring platziert werden und gelten dann einen kleinen Tropfen auf die Oberfläche der flachen Seite des Ringes. Nachdem es in die Zwinge Einsetzen sicherzustellen, daß eine kleine Länge der Faser (<0,5 mm) von der Flachseite der Keramikhülse vorsteht. Lassen Sie den Epoxid-Kleber O / N, um optimale Ergebnisse zu härten.
12. Polieren Sie das flache Ende der Zwinge eine Polierscheibe mit von Pinzette mit sanften Druck auf die Hülse aufzubringen, während machen Figur-8-Rotations auf Aluminiumoxid Läppen Blätter (3 & mgr; m bis 1 & mgr; m bis 0,3 & mgr; m grit).
13. Untersuchen Sie das flache Ende der Hülse mit einem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des flachen Ende, einschließlich der LWL-Oberfläche selbst, frei von jeglicher Epoxid-Kleber ist; weiter Polieren wenn Epoxid-Kleber auf der Oberfläche bleibt. Stellen Sie sicher, dass die faseroptische Oberfläche nicht gebrochen oder gesäumt wurde.
14. Paar die polierte Zwinge mit einem Glasfaser-Patchkabel mit einer Zwinge Hülse und schließen Sie das Patchkabel an einer Laserlichtquelle. Messen Sie die Lichtübertragungsleistung an der Spitze der Faser mit einem Leistungsmesser, um eine angemessene Effizienz gewährleisten.
15. Ein Protokoll der Leistungsabgabe von der Zwinge Patch erforderlichen Kabel für jede Ferrule Implantat zur Ausgabe der gewünschte Leistungspegel an der Spitze der Faseroptik (2,5 mW in diesem Protokoll). Verwerfen Ferrulen mit einer Dämpfungsrate von über 50% und mit nicht kreisförmigen Ausgabemuster.

2. Stereotaktische Implantation Chirurgie und Virus Injection

1. Stellen Sie sicher, dass alle experimentellen Verfahren die Verwendung von Tieren beinhalten, die von der lokalen IACUC zugelassen sind. Pflegen aseptischen Bedingungen während Überleben Operationen durch aseptische Verfahren folgen, einschließlich der Verwendung von sterilen Handschuhen, sterile Masken, sterile OP-Abdeckungen und sterilisierten chirurgischen Instrumenten.
   VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Chirurgen Persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Schutzbrille tragen vor Beginn des Verfahrens. Befolgen Sie die Anweisungen Standard Biosicherheit, wenn sie mit Adeno-assoziierter Vektor (AAV) arbeitet, kümmert sich um Spritzer zu vermeiden. Entsorgen Sie AAV Abfall in einem Behälter für biologischen.
2. Legen Sie eine Mikroliterspritze mit genügend AAV zur Injektion in das Tier plus extra zu berücksichtigen mögliche Volumenverluste (insgesamt 4 ul pro Tier), halten Sie die Spritze auf dem Eis vor dem Gebrauch. In diesem Protokoll AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP bei einem Titer von 4x10 ¹² vg / ml verwendet. Legen Sie das Tier unter Isoflurane Anästhesie mit einer Induktionskammer, verbunden mit einer Genauigkeit Isofluran Verdampfer Satz mit einem 3 - 4% mit einem Sauerstoffgasquelle.
3. Rasur den Kopf mit einem elektrischen Rasierer und führen Sie eine dreifache chirurgische Peeling auf der Haut mit Betadin und 70% Ethanol spülen.
4. Sobald das Tier in tiefer Narkose (prüfen Zehenreflex und Atemfrequenz) ist, zu immobilisieren den Schädel des Tieres in einem stereotaktischen Apparat mit intra-aural Positionierung Nieten und Zahnstange.
   Hinweis: Die gesamte Prozedur 1 nehmen - 2 Stunden, von Narkoseeinleitung zur Genesung.
5. Stellen Sie die Anästhesie auf ein angemessenes Niveau (1 - 3% Isofluran auf dem Verdampfer) und kontinuierlich zu überwachen die Vitalfunktionen des Tieres, die Anpassung der Anästhesie als notwendig, eine Atemfrequenz von ~ 40 Atemzüge / min zu halten. Verabreichen Augensalbe auf die Augen des Tieres Trockenheit zu verhindern, während sie unter Anästhesie.
6. Machen Sie einen 15 bis 20 mm Mittellinie Kopfhaut Schnitt mit einem Skalpell und einfahren, die Kopfhaut mit chirurgischen hemostats einmit dem Periost ttached. Referenz Lambda und Bregma die Bohrkrone über die Koordinaten für den ROI zu positionieren.
7. Bohren Sie ein kleines Kraniotomie (2 - 3 mm) über den ROI mit einem Zahnbohrer, kümmert sich nicht um das Gehirn zu durchstechen. Langsam Nadel auf die Mikroliterspritze durch die Kraniotomie an den ROI im Gehirn angebracht einfügen.
8. Mit einer Mikropumpensteuerung, injizieren 2 ul der Vektor-Lösung in den ROI. Verwenden, um eine Durchflussrate von 150 nl / min Gewebeschäden zu vermeiden. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist, wartet 10 min, bevor die Spritze langsam mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mm / min zu entfernen.
9. Nach der Injektion trocken die Oberfläche des Schädels. Referenz lambda Bregma und Koordinaten zu bestätigen und dann die Ferrule Implantates an das Zieltiefe einsetzen (zum Beispiel: 3,5 mm unter Bregma für dorsalen Hippocampus) mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 mm / min. Montieren Sie die Zwinge Implantat auf den Schädel mit Zahnzement. Nachdem der Zahnzement verfestigt hat, dichten den Einschnitt mit Nähten (size 5-0 für Ratten) um den Zahnzement Kappe.
10. Nach der Operation, legen Sie das Tier in seinem Käfig einzeln mit der Hälfte des Käfigs auf einer Heizung für Anästhesie Erholung untergebracht. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Stellen Sie das Tier nicht in der Gesellschaft anderer Tiere, bis sie vollständig erholt hat.
11. Für postoperative Behandlung von Schmerzen, verabreichen Buprenorphin subkutan alle 12 Stunden bei einer Dosis von 0,05 mg / kg für 24 Stunden. Verabreichen Antibiotika-Pulver täglich über der Einschnittstelle für 3 Tage.
12. Entfernen der Nähte etwa zwei Wochen nach der Operation Schorfbildung zu verhindern.
13. Warten Sie 4 - 6 Wochen nach der Virusinjektion für eine ausreichende Expression von optogenetische Gene vor Durchführung von Experimenten.

3. optogenetische Functional MRI

ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig, um das permanente Magnetfeld eines Magnetresonanztomographen. Sichere equipmhno, einschließlich der Funktion, Lichtquelle, Ventilator, capnograph und Gastanks, ausreichend weit weg (zumindest jenseits der 5 Gauss Grenze) Generator.

1. Legen Sie das Tier unter Gasnarkose mit einer Induktionskammer, verbunden mit einer Genauigkeit Isofluran Verdampfer Satz bei 5% mit einem Sauerstoffgasquelle.
2. Sobald das Tier in tiefer Narkose (Kontroll toe reflex und Atemfrequenz) ist, intubieren das Tier nach dem Protokoll in Rivard detailliert et al. (2006) die Überwachung der Kohlendioxid ²⁶ durch Kapnografie zu ermöglichen. Hinweis: Intubation ist von entscheidender Bedeutung in der richtigen Ebenen der exspiratorische CO ₂ während der Bildgebung zu halten.
3. Sichern Sie das Tier in den Scanner Wiege.
   Hinweis: In diesem Protokoll wurde die Wiege benutzerdefinierte produziert, aber solche Wiegen sind auch im Handel erhältlich. Die Ratte Wiege Funktionen das Tier innerhalb des Scanners für die Lieferung der Anästhesie zu sichern, erwärmte Luft und zur Einschränkung der Bewegung.
4. Liefern Sie eine Mischung aus Isofluran (Ranging 1,2 bis 1,5%) in etwa 60% Stickstoffoxid und 40% Sauerstoff über einen Schlauch durch die Docking-Station. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres sicher, um Bewegungsartefakte zu vermeiden, festgelegt ist.
5. Geben Sie erwärmte Luft durch den Schlauch in die Docking-Station und fügen Sie ein Rektalthermometers mit Schmierstoff Körpertemperatur zu überwachen. Verabreichen Augensalbe auf die Augen des Tieres Trockenheit zu verhindern, während sie unter Anästhesie.
6. Schließen Sie das LWL-Patchkabel an einer Laserlichtquelle und messen Sie den Ausgang an der Spitze der Zwinge des Patchkabel mit einem Leistungsmesser.
7. Einzustellen, um den entsprechenden Leistungspegel (bestimmt zuvor in Schritt 1.15) die gewünschte Ausgangs (2,5 mW in diesem Protokoll) an der Spitze der Faseroptik innerhalb des Gehirns implantiert zu erzeugen. Da übermäßige Leistung aus dem faseroptischen potentiell Gewebeschäden im Gehirn verursachen kann oder Gewebeerwärmung verursachen, die Signal-Artefakte erzeugen wird, nicht wesentlich erhöht die Leistung des Lasersüber die vorgesehene Ausgabe.
8. Verhindern Lichtleckage von dem Implantat mit einem Konus von schwarzem Isolierband und decken die Augen des Tieres. Paar das Glasfaserkabel an die Zwinge Implantat auf das Tier mit einer Ferrule Hülse.
9. Setzen Sie die Spule über den Kopf des Tieres. Legen Sie die Wiege mit Tier in die Bohrung des Scanners.
   Hinweis: In diesem Protokoll wird die Single-Loop-Sende-Empfangsspule wurde speziell hergestellt und vorge abgestimmt, um die optimale Funkfrequenz von Hirngewebe zu erhalten.
10. Überwachen Sie die Atemfrequenz und Körpertemperatur während des gesamten Prozesses, die Anpassung der Beatmungsgerät und Heizung nach Bedarf auf physiologische Werte in Grenzen halten (sicherzustellen , dass exspiratorische CO ₂ ist 3 bis 4% durch Drehen der Knöpfe auf dem Beatmungsgerät Hubfrequenz und Lautstärke einzustellen , und dass Temperatur ist 37 ° C durch die Pfeile für die Temperatureinstellung klicken).
11. Wählen Sie eine Positionierung Sequenz Bild der Tierkopfposition. Wenn die bregen ist an der Iso-Zentrum nicht, das Tier Kopfposition einstellen und die Positionierung Scan wiederholen, bis das Gehirn an der Iso-Zentrum ist. Wählen Sie eine lineare Shim-Sequenz und klicken Sie auf Last in der Sequenz-Auswahlfenster. Als nächstes klicken Sie auf Inhomogenitäten des Magnetfeldes zu reduzieren beginnen.
    Hinweis: Unterlegbleche ein wichtiger Schritt ist, die direkt um die Integrität der fMRI-Daten beeinflussen.
12. Wählen Sie einen T2-gewichteten Sequenz und klicken Sie auf Last in der Sequenz-Auswahlfenster. Als nächstes klicken Sie auf Start T2-gewichteten hochauflösende koronalen anatomische Bilder vor dem fMRI zu erwerben auf die allgemeine Integrität des Gehirns zu überprüfen und die Lage der optischen Faser Implantat zu bestätigen.
    Hinweis: Diese Bilder können als Anatomie-Overlays für die ofMRI Scan-Serie verwendet werden.
13. Verbinden BNC-Kabel von der Auslöseöffnung des MRI-Scanner an den Funktionsgenerator, so dass die Laserlichtquelle entsprechend einer experimentellen Stimulation Paradigma angetrieben wird.
    Hinweis: In diesem Protokoll wird die Stimulation pAradigm 30 sec von Baseline um 20 Sekunden, gefolgt auf / 40 sec für sechs Minuten ab.
14. Wählen Sie ein Multi-Slice-Gradienten-Echo (GRE) Sequenz aufgerufen und klicken Sie auf Last in der Sequenz-Auswahlfenster. Als nächstes klicken Sie auf Start 35 mm x 35 mm (2D FOV) in der gleichen Ebene mit 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm räumliche Auflösung koronalen Scheiben zu erwerben.
    Hinweis: Die hier verwendete GRE-Sequenz hat eine Wiederholungszeit (TR) und Echozeit (TE) von TR / TE = 750/12 ms und 30 ° Kippwinkel.
15. Am Ende des Scans, entfernen Sie das Tier aus dem Scanner und zu überwachen, bis er aus der Narkose erwacht und kann Brustlage halten.

4. ofMRI Datenanalyse

Hinweis: Die folgenden Schritte durchgeführt werden in MATLAB als in einer Publikation auf hohem Durchsatz ofMRI ²⁷ beschrieben.

1. Nachdem der rohen Abtastdaten an den Computer für die Analyse verwendet übertragen wurde, verwenden Gleitfenster Rekonstruktion des Bildes jedes TR zu aktualisieren, mitein Vier-Verschachtelungs-Spiral-Anzeige, 750 ms TR und 12 ms Echozeit 23 Scheiben pro Scan Serie zu erwerben. Statt herkömmlicher Rekonstruktion , wo neue fMRI Bilder nur rekonstruiert werden , nachdem alle Verschachtelungen für jede Scheibe erworben werden, rekonstruiert das Schiebefenster Rekonstruktionsverfahren Bilder nach dem Erwerb von jeweils interleaf ^27.
2. Verarbeiten Sie die Rohdaten für die zweidimensionale Rasterung Rekonstruktion, Bewegungskorrektur und die Berechnung der Zeitreihe als zuvor ²⁷ beschrieben.
3. Verwenden eines Schwellenkohärenzmethode aktiviert Voxel bestimmen , indem die prozentuale Modulation des BOLD Signal jedes Voxel relativ zu der Basisperiode gesammelt vor der Stimulation der Berechnung wie zuvor beschrieben ^27. Berechnen Kohärenzwerte als die Größe der Fourier bei der Frequenz der wiederholten Stimulationszyklen durch die Summe der Quadrate aller Frequenzkomponenten ⁸ geteilt wandeln.
4. Unter Verwendung der Zeitreihendaten für jedes vOxel, mittlere Bewegungskorrigierten Bilder, die gehören zu aufeinanderfolgenden Abtastungen des gleichen Stimulations Paradigma zuerst. Dann auszurichten , um die durchschnittlichen 4D - Bilder zu einem gemeinsamen Koordinatenrahmen mit einem Sechs - Grad-of-freedom Starrkörpertransformation sowie isotropen Skalierung zum Vergleich innerhalb und zwischen den Tieren , wie zuvor beschrieben ^27.

Results

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen repräsentative Daten , die sich von 20 Hz (15 ms Pulsbreite, 473 nm, 30% Einschaltdauer) optogenetische Stimulation des motorischen Kortex. Ein Stimulations Paradigma von 30 Sekunden von Baseline, gefolgt von 20 s an / 40 sec ab sechs min verwendet wurde. Frühere Studien haben gezeigt , dass dieses Paradigma robust BOLD - Signal von optogenetische Stimulation ^1,8 erzeugt. Abbildung 1 zeigt die aktivierten Voxel sowohl am lokalen Standort der Stimulation (motorischen Kortex) erfasst und im Thalamus, als Folge der weitreichenden synaptischen Verbindungen zwischen diesen Regionen. 2 zeigt , dass zeitliche Informationen aus HRFs entnommen werden, da die Thalamus - Reaktion (untere Anfangssteigung) im Vergleich zum motorischen Kortex Reaktion nach optogenetische Stimulation verzögert.

p_upload / 53346 / 53346fig1.jpg "/>
Abbildung 1. Die Aktivierung Karte von BOLD Signal induziert durch optogenetische Stimulation von CaMKIIa-exprimierenden Zellen in Motor Cortex. Coherence Werte der aktiven Voxel, wie die identifizierten deutlich synchronisiert wiederholte Stimulationen werden überlagert dargestellt auf einem T2-gewichteten koronalen anatomischen Scheibe. Die gesammelten Daten über sechs Minuten, 30 Sekunden Zeit (Anfangs 30 sec Baseline und sechs Stimulationszyklen von 20 s an / 40 sec off mit 473-nm-Licht, 20 Hz, 15 ms Pulsbreite) werden in eine Aktivierungskarte kondensiert. Sequential Scheiben sind 0,5 mm voneinander entfernt und die Lage des faseroptischen Implantat wird durch das Dreieck bezeichnet. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Bewegung des Motivs während der Bildgebung ist eine bedeutende Quelle von Artefakt, das zu Datenkorruption führen kann. Passender Befestigen des Tieres auf der Abbildungsaufnahmevorrichtung können solche Artefakte zu minimieren, wie entsprechende Anästhesiepegel beibehalten wird. Hier verwendeten wir Isofluran aber alternative Anästhetika, wie Medetomidin oder Ketamin und Xylazin, sollten ebenfalls berücksichtigt werden. Jedoch können die Stufen und die Wahl des Anästhetikums viele Parameter beeinflussen im Gehirn, einschließlich der BOLD - Antwort ^28. Isofluran kann Veränderungen bewirken in der neuronalen Erregbarkeit ^29. Andere Anästhetika können auch synaptische Inhibition ³⁰ beeinflussen GABA. Somit ist die Wahl der Anästhesie wichtig bei der Durchführung ofMRI seine Fähigkeit gegeben neuronaler Aktivität beeinflussen. ofMRI in Abwesenheit von Anästhesie ist möglich, aber mit erhöhter Bewegung von dem Tier eine Herausforderung sein, die reduziert werden kann, wenn das Tier habituierten; so wach ofMRI Studien bisher durchgeführt haben einend würde die verwirrende Wirkung der Narkose auf das Gehirn ^9,10 vermeiden. Nachbearbeitungsbewegungskorrekturalgorithmen kann stark verwendet werden, um die Auswirkungen der Bewegung zu mildern. Einige dieser Methoden existieren, einschließlich der inversen Gauss-Newton-Algorithmus in diesem Protokoll verwendet, der die Summe der Quadrate Kostenfunktion des Referenzbildes und der Bildkorrektur unter minimiert. Der Algorithmus ist nützlich , weil es schnelle und robuste Bewegungskorrektur ermöglicht, eine GPU parallele Plattform - Design unter Verwendung von Verarbeitungszeiten ²⁷ zu reduzieren.

Für die Datenrekonstruktion in diesem Protokoll eigens geschriebenen Software in einer MATLAB - Umgebung wurde für zweidimensionale Rasterung Rekonstruktion verwendet, wo Spiralproben im k-Raum rekonstruiert werden in gerasterte Bilder ^31-33. Zeitreihendaten wurden durch die Berechnung der prozentualen Modulation des BOLD Signal jedes Voxel relativ zu der Basisperiode erzeugt vor der Stimulation gesammelt. Voxel, deren Zeitreihen wurden synchronisiert Blöcke von optogenetische Stimulation mit einem Kohärenz-Wert von 0,35 oder mehr wurden als aktivierte Voxel definiert; Diese Kohärenzwert entspricht einer weniger als 10 ^-9 P - Wert ^8. Kohärenz - Werte wurden berechnet als die Größe der Fourier bei der Frequenz der wiederholten Stimulationszyklen durch die Summe der Quadrate aller Frequenzkomponenten ^8,27 geteilt wandeln. Familywise Fehler kann mit der Bonferroni-Korrektur für multiple Vergleiche gesteuert werden. Alternative Methoden der Analyse kann verwendet werden, einschließlich parametrischer statistischer Tests wie die allgemeine lineare Modelle (GLMs). Die Kohärenzverfahren erfordert weniger vorherige Kenntnis der HRF Vergleich zu dem herkömmlichen allgemeinen linearen Modell. Daher ist es vorteilhaft, wenn die Daten unter Verwendung ofMRI erkunden. Allerdings kann die Kohärenzmethode nur für Daten mit Block-Designs oder ausgewählte Event-Related Designs mit einem festen Interstimulus Intervall verwendet werden und nicht in ofMRI Daten mit anderen ereignis rela verwendet werden können,ted-Designs oder gemischte Entwürfe. Anschließend kann dynamische kausalen Modellierung (DCM) verwendet werden Wechselwirkungen zwischen Hirnregionen durch ofMRI identifiziert zu analysieren. DCM ist ein Bayes für die Analyse der funktionellen Konnektivität von Systemantworten auf experimentelle Eingänge während fMRI ³⁴ entwickelte statistische Technik.

Weitere technische Bedenken für ofMRI werden hier diskutiert. Implantate können beschädigt oder fallen werden, um die Entfernung des betroffenen Tieres aus der Studie führte. Re-Implantation Operationen werden nicht auf Grund der zusätzlichen Unsicherheit empfohlen von den gleichen ROI wie in der ursprünglichen Implantationschirurgie Targeting und wegen Fragen des Tierschutzes. Aufgrund der sehr viel Zeit und Ressourcen in jedem Tier Thema investiert, Berücksichtigung der Festigkeit des Materials ist ein wesentliches Anliegen, wenn für den Einsatz in ofMRI Studien eine geeignete Zahnzement wählen. Die Implantationschirurgie ist ein kritischer Faktor für die Lebensdauer des IMPLAN Maximierungt und einem Tier. Beispielsweise sichergestellt, dass der Schädel des Dentalzements vor dem Aufbringen und Anordnen einer ausreichenden Menge an Zement um den Keramikring Implantat trocken ist Stabilität auf potentielle monatelangen Zeitleiste des Tieres während der Studie gewährleisten. Zusätzlich können alternative Käfigausführungen erforscht und mit der lokalen Tierstation behandelt werden, um zu vermeiden, Käfige mit Drahtspitzen das Essen und Wasser zu halten, die oft in den Käfig hineinragen und bieten Möglichkeiten für das Tier, das Implantat zu beschädigen. Wichtig ist, dass die Zahnzement sorgfältig Artefakte zu reduzieren ausgewählt werden, die Bildgebung und alternative Zemente beeinflussen kann durch Auftragen auf ein Phantom und Bildgebung in einem Scanner vor der Verwendung in Tierversuchen getestet werden. Versuch und Irrtum mit verschiedenen Dentalzementen hat gezeigt, daß der Zement in diesem Protokoll verwendet relativ wenige Artefakte gibt. Eine andere technische Herausforderung ofMRI in der Durchführung ist die Genauigkeit der faseroptischen Anordnung an der vorgesehenen ROI, angesichts der extremely kleine Entfernungen , die zwischen den Kernen ³⁵ im Gehirn vorhanden sein können. Nach dem Abschluss können die Implantation Operationen, T2-gewichteten anatomischen Scans verwendet werden, die korrekte Platzierung zu bestimmen, indem auf eine Gehirnatlas überlagert. Die Fähigkeit des Chirurgen und Praxis, diese Operationen durchführen kann die korrekte Platzierung Raten zu verbessern. Die Spezifität und die Expression des Opsin an der beabsichtigten ROI kann dem Opsin zur Visualisierung getaggt durch Perfusion das Tier und Fixieren des Gehirns, unter Verwendung von Immunhistochemie oder die endogene Fluoreszenz eines Reporter-Proteins am Ende der Studie verifiziert werden. Diese Reporterproteine ​​können auch mit anderen Proteinen kolokalisiert werden , um sicherzustellen , dass das Opsin in den gewünschten neuralen Zelltypen ^1,8,15,25 exprimiert wird. Wie bereits erwähnt, können Artefakte entstehen , wenn ²² ofMRI aufgrund von Gewebeerwärmung von Lichtabgabe durchgeführt wird . Die Erwärmung des Gewebes bewirkt Veränderung der Relaxationszeiten, was zu falschen BOLD-Signal. Um sicherzustellen, dass die acvierung aus Licht Stimulation während ofMRI ist nicht auf dieses Artefakts, Opsin-negativen Kontrollen sollten mit Steuer Fluorophor Vektoren (wie beispielsweise AAV-CaMKIIa-EYFP) unterzogen ofMRI injiziert, in denen entweder Kochsalzlösung injizierten Tieren oder Tieren durchgeführt werden. Darüber hinaus sind nur gut ausgebaute LWL-Implantate mit guter Lichtübertragungseffizienz sollte die Notwendigkeit verwendet werden, zu entfernen hohen Laserleistungen zu verwenden. ofMRI Studien haben in die falsche Aktivierung aufgrund Gewebeerwärmung durchgeführt wurde ein Problem ^1,6-8,10,11 nicht gewesen.

In Bezug auf die Wahl des Vektors die erforderlichen optogenetische Gene in Nervenzellen für die Expression, AAV nicht zu verursachen Krankheit beim Menschen bekannt und sind daher eine bequeme Möglichkeit, angesichts der niedrigeren Biosicherheitsstufe einzuführen erforderlich, um diese Mittel zu verwenden (BSL-1). Darüber hinaus führen eine Vielzahl von Vektor-Kerne AAV mit verschiedenen optogenetische Gene auf Lager verpackt und mit mehreren Serotypen. Der Serotyp von AAV muss b gewählt werdenasierend auf der Zellpopulation Ziel soll eine optimale Expression Ebenen ^36,37 gewährleisten. Lentiviren kann auch erfordern jedoch eine höhere Biosicherheitsstufe verwendet werden. Die Zeitdauer für eine ausreichende Expression der optogenetische Gene erforderlich ist variabel in Abhängigkeit von der spezifischen Tiermodell, auf dem insbesondere AAV verwendet und auf die spezifische experimentelle Paradigma verwendet. In diesem Protokoll Sprague Dawley Ratten nach 11 Wochen alt sind, verwendet und optogenetische Studien beginnen vier bis sechs Wochen nach der Virusinjektion. Transgene Mäuse können auch in optogenetische Studien verwendet werden. Es ist notwendig, Modellversuche durchzuführen, die bestimmte Menge an Zeit für eine ausreichende Expression der Opsinen erforderlich zu bestimmen. Die Stimulation Paradigmen können variieren von der verwendeten spezifischen Opsin abhängig. In diesem Protokoll AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP verwendet wird und die Stimulation Paradigma ist 20 s an / 40 sec ab. Bei Verwendung eines SSFO, variiert die Stimulation Paradigma, weil die SSFO nur einen kurzen Lichtimpuls erfordert ac zu seintiviert und dann ein kurzer Lichtimpuls bei einer anderen Wellenlänge beendet werden.

Ein weiterer kritischer Punkt bei der Durchführung von ofMRI mit dem LWL-Patchkabel während optogenetische Stimulation Lichtaustritt aus der Zwinge Implantat-Grenzfläche verhindert eine verwirrende Gehirn Signal mit Ursprung aus visueller Stimulation zu verhindern, auch wenn das Tier betäubt wird. Kegel von schwarzem Isolierband kann verwendet werden, um das Licht von den Ringen zu blockieren und die Augen des Tieres zu decken. Wichtig ist , müssen physiologische Werte einschließlich expiratory CO ₂ und die Körpertemperatur des Subjektes korrekt während der gesamten Dauer des Abbildungs ​​aufrechterhalten werden. 4% und die Körpertemperatur bei 37 ° C - exspiratorische CO ₂ sollte zwischen 3 gehalten werden. Darüber hinaus reduzieren die Shim-Sequenzen so viel Inhomogenität wie möglich im Magnetfeld vor dem Start ofMRI bestimmt scannt stark die Qualität der resultierenden BOLD-Daten. Steuerung dieser Faktorenkritisch ist zuverlässig ofMRI Daten in der Herstellung. In diesem Protokoll DPSS-Laser sind als Lichtquelle für optogenetische Stimulation verwendet. Da Laserlicht kohärent ist, mehr als genug Leistung kann leicht durch das faseroptische geliefert. LED-Lichtquellen zu Glasfaser gekoppelt sind von kommerziellen Anbietern erhältlich, haben aber den Nachteil einer verringerten Leistung der Lichtdurchlässigkeit. Die Laserlichtquelle erfordert Ausrichtung zu jedem speziellen Glasfaser-Patchkabel, aber mit der Praxis kann die Ausrichtung innerhalb von Sekunden bis Minuten erreicht werden.

Zukünftige Anwendungen von ofMRI umfassen die Verwendung der nächsten Generation Opsinen wie rotverschoben Opsinen zu ermöglichen nicht-invasive Stimulation während der Bildgebung. Zusätzlich könnte die Implantation von MRI-kompatiblen EEG oder ähnliche Aufzeichnungselektroden zusammen mit der faseroptischen Implantat zur Erfassung von hoher zeitlicher Auflösung Daten zusätzlich zu den hohen räumlichen Auflösung von MRI-Daten zu ermöglichen. ofMRI mit electrophysiollogische Aufnahme umfangreiche Informationen über die funktionelle Konnektivität des Gehirns bieten könnte. die Kraft der ofMRI Zusammenfassend macht die gesamte Gehirn in Reaktion auf die Stimulation von spezifischen Zellpopulationen zu überwachen, die durch genetische oder anatomischen Identität definiert ofMRI ein wichtiges Werkzeug bei der Untersuchung von neurologischen Erkrankungen und der connectomics des gesunden Gehirns zu verwenden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7 Tesla Scanner	Agilent Technologies	Discovery MR901 System
Sprague Dawley Ratten	Charles River	Crl:SD	11 Wochen alt
Faserspalter	Fujikura	CT-05
Multimode Glasfaser	Thor Labs	AFS105/125Y
Faserabisolierer	Thor Labs	T08S13
Keramik-Split-Sleeve	Precision Fiber Products	SM-CS1140S
Epoxidkleber	Thor Labs	G14250
Applikatoren mit Wattespitze	Stoelting Co.	50975
Multimode-Keramik-Zirkonoxid-Aderendhülsen	Precision Fiber Products	MM-FER2002
FC/PC-Multimode-Steckverbinder	Thor Labs	30128C3
faseroptische Polierscheibe	Precision Fiber Products	M1-80754
Aluminiumoxid-Läppblech, 0,3 & Mikro; m	Thor Labs	LFG03P
Aluminiumoxid-Läppblech, 1 & Mikro; m	Thor Labs	LFG1P
Aluminiumoxid-Läppblech, 3 & Mikro; m	Thor Labs	LFG3P
binokulares biologisches Mikroskop 40X-1.000X	Amscope	B100
Laserschutzbrille	Kentek	KXL-62W01
473 nm DPSS-Laser	Laserglow	LRS-0473
594 nm DPSS-Laser	Laserglow	LRS-0594
Inbusschlüssel-Set			2,0 mm (5/64") zur Ausrichtung der Faserspitze auf den Brennpunkt des Kopplers im
Laserleistungsmesser, Si-Sensor, 400-1.100 nm	Thor Labs	PM121D
Isofluran (Isothesie)	Henry Schein	50033
Isofluran-Verdampfer mit Induktionskammer	VetEquip	901806
NanoFil 100 µ l Spritze	World Precision Instruments	NANOFIL-100
UltraMicroPump mit SYS-Micro4 Controller	World Precision Instruments	UMP3-1
Funktionsgenerator	A.M.P.I.	Master-8
Kleintier Stereotax	David Kopf Instruments	Modell 940
Modell 683 Beatmungsgerät für Kleintiere	Harvard Apparatur	550000
Typ 340 Kapnograph	Harvard Apparat	733809
Zahnbohrer (rotierender Mikromotor-Bausatz)	Foredom Electric Co.	K.1070
Augensalbe (Künstliche Tränen)	Rugby	00536-6550-91
Instrumentensterilisator	CellPoint Scientific	Germinator 500	Glasperlensterilisator
Antibiotikapulver	Pfizer	NEO-PREDEF	Neomycinsulfat, Isoflupredonacetat und Tetracainhydrochlorid
Buprenorphin Schmerzmittel	Hospira	NDC:0409-2012	Liste III geregelte Substanz, 0,3 mg/ml Bestand