Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

Zusammenfassung

Gaumenmandeln sind eine reichhaltige Quelle für B- und T-Lymphozyten. Hier bieten wir ein einfaches, effizientes und schnelles Protokoll zur Isolierung von B- und T-Lymphozyten aus menschlichen Gaumenmandeln. Die beschriebene Methode wurde speziell für Studien zur viralen Ätiologie der Mandelentzündung, der sogenannten Mandelentzündung, angepasst.

Zusammenfassung

Mandeln sind ein Teil des Immunsystems und bilden die erste Verteidigungslinie gegen eingeatmete Krankheitserreger. In der Regel bezieht sich der Begriff "Mandeln" auf die Gaumenmandeln, die sich an den Seitenwänden des Mundbereichs des Rachens befinden. Operativ entfernte Gaumenmandeln stellen eine leicht zugängliche Quelle für B- und T-Lymphozyten dar, um das Zusammenspiel zwischen fremden Krankheitserregern und dem Immunsystem des Wirts zu untersuchen. Dieses Videoprotokoll beschreibt die Dissektion und Aufbereitung von chirurgisch entfernten humanen Gaumenmandeln, gefolgt von der Isolierung der einzelnen B- und T-Zellpopulationen aus derselben Gewebeprobe. Wir stellen eine Methode vor, die tonsilläre B- und T-Lymphozyten mithilfe eines Antikörper-abhängigen Affinitätsprotokolls effizient trennt. Darüber hinaus verwenden wir die Methode, um zu zeigen, dass humane Adenoviren spezifisch die tonsilläre T-Zellfraktion infizieren. Das etablierte Protokoll ist allgemein anwendbar, um tonsillare B- und T-Zellpopulationen effizient und schnell zu isolieren und die Rolle verschiedener Arten von Krankheitserregern bei der tonsillären Immunantwort zu untersuchen.

Einleitung

Mandeln sind Ansammlungen von unvollständig verkapseltem lymphatischem Gewebe, das unter dem Epithel im oberen aero-digestive Trakt liegt und mit ihm in Kontakt steht. In der Regel bezieht sich der Begriff "Mandeln" auf die Gaumenmandeln, die sich an den Seitenwänden des Mundbereichs des Rachens befinden. Die paarigen Gaumenmandeln bilden zusammen mit der Nasen-Rachen-Mandel (Adenoid), den paarigen Eileitermandeln und den Zungenmandeln den sogenannten "Waldeyer-Ring". Letzteres ist für den Erstkontakt zwischen eingeatmeten oder verschluckten Krankheitserregern und dem lymphatischen Gewebe des aerodigestive Trakts verantwortlich^1,2. In der Tat haben zahlreiche Berichte gezeigt, dass sowohl bakterielle als auch virale Antigene in den Gewebeproben der Gaumenmandeln nachgewiesen werden können^2-6.

Die Gaumenmandeln bestehen aus dichtem lymphatischem Gewebe, das von einem geschichteten Plattenepithel, nicht keratilisierendem Epithel bedeckt ist. Die Mandeln haben zahlreiche Krypten, epitheliale Einstülpungen, die das Parenchym durchdringen und die Oberfläche vergrößern. Histologisch enthalten die Gaumenmandeln zahlreiche lymphoide Follikel mit Keimzentren, die die Orte für die B-Zell-Reifung und -Differenzierung sind (B-Zell-Bereiche). Ebenso umfassen die Gaumenmandeln T-Zellen, die sich hauptsächlich in den extrafollikulären Regionen (T-Zell-Bereichen) befinden. Neben den B- und T-Zellen können auch verschiedene follikuläre dendritische Zellen in den Gaumenmandeln nachgewiesen werden^1,2.

Aufgrund ihrer anatomischen Lage sind die Gaumenmandeln durch chirurgische Eingriffe leicht zugänglich. So wird beispielsweise die chirurgische Entfernung von Mandeln, die sogenannte Tonsillektomie, weltweit routinemäßig durchgeführt⁷. Bei Kindern mit Mandelhyperplasie wird manchmal eine teilweise chirurgische Entfernung der Mandeln (Tonsillotomie) angewendet, die bei den Patienten weniger postoperative Schmerzen verursacht. Unter Berücksichtigung der Akkumulation verschiedener Erreger in den Mandeln bieten operativ entnommene Mandeln eine einzigartige Möglichkeit, den Einfluss viraler und bakterieller Erreger auf die Funktionen der tonsillären Lymphozyten zu untersuchen^2,8. Darüber hinaus kann untersucht werden, ob einige Krankheitserreger es vorziehen, sich in bestimmten Zellsubpopulationen aufzuhalten⁹. Da die Mandeln eine reichhaltige Quelle für B-Lymphozyten sind, können isolierte tonsilläre B-Lymphozyten effizient verwendet werden, um die Aktivität verschiedener B-Zell-Subpopulationen zu untersuchen¹⁰. Da die Gaumenmandeln jedoch eine Mischung von Zelltypen enthalten, ist eine effiziente Methode zur Trennung der verschiedenen Zellsubpopulationen erforderlich.

Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur effizienten und schnellen Isolierung von tonsillären B- und T-Zellpopulationen aus menschlichen Gaumenmandeln unter Verwendung einer magnetisch aktivierten Zelltrennungstechnik (Abbildung 1). Die hier beschriebene Methode ist nützlich für Wissenschaftler, die die Rolle verschiedener Infektionserreger in menschlichen lymphatischen Organen wie den Gaumenmandeln beurteilen wollen.

Protokoll

Das Protokoll beschreibt die Isolierung von lymphatischen Zellen, die aus menschlichen Patienten, Material und erfordert deshalb eine ethische Genehmigung. Die Arbeit in der vorliegenden Studie durchgeführt wurde von der Uppsala Ethical Review Board (DNR. 2013/387) gewährt.

1. Isolierung von mononukleären Zellen (MNC) aus humanen Gaumenmandeln

ACHTUNG: Alle ungeschirmten Material menschlichen Ursprungs wie Blut, Gewebe oder Körperflüssigkeiten sind als potenziell infiziertem Material betrachtet werden. Daher sollte empfohlen Biosicherheit Praktiken zur Handhabung der menschlichen Geweben folgen.

Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, müssen alle Lösungen und Zellkulturgeräte steril sein. Alle Puffer und Lösungen sollten vorgekühlt werden und auf Eis gehalten. Tonsillen und Geweben isolierten Zellen sollten aufbewahrt und auf Eis behandelt werden.

1. Erhalten frischen Mandeln von Patienten, die eine Tonsillektomie oder Tonsillotomie (Abbildung 2). Tauchen Sie ein in das Gewebe clumps in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit eiskalter steriler Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) gefüllt mit 5% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mM Glutamin, 0,05 mg / ml Gentamicin und 1% Antibiotika-Antimykotische Mix (Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B).
2. Halten Sie die Rohre mit den untergetauchten Tonsillen Gewebeproben zu jeder Zeit auf Eis. Versuchen Sie, die Mandeln so schnell wie möglich zu bearbeiten, und nicht später als 3 Stunden nach der operativen Entfernung.
3. Legen Sie die Mandeln auf einem 60 mm Kunststoff-Zellkulturplatte auf Eis und halten Sie die mit HBSS angefeuchteten Tuch. Entfernen Sie sichtbaren Blutgerinnseln, Fett- und Bindegewebe mit einer sauberen Pinzette aus der Tonsillen Oberfläche.
4. Verwenden Sie eine neue 60 mm-Zellkulturplatte, die 5 ml HBSS. Schneiden Sie das Mandelgewebe Klumpen in 3-10 mm Fragmente mit einer sterilen Schere und / oder einem Skalpell.
5. Bereiten Sie eine neue 60 mm-Zellkulturplatte mit 10 ml HBSS und legen Sie eine 100 & mgr; Kunststoff Zellsieb in der HBSS-Lösung.
6. Übertragen Sie die dissreflektierte Tonsillen-Fragmente in die Zelle Sieb mit einer sterilen Zange. Mit dem Kolbenende einer Plastikspritze, reibungslos den Gewebefragmenten zu quetschen durch die Zelle Sieb. Stellen Sie sicher, dass die Tonsillen Fragmente werden völlig in der HBSS eingetaucht.
7. Entsorgen Sie die Zellsieb mit den Geweberesten und übertragen Sie die erhaltene Zellsuspension aus dem 60 mm-Zellkulturplatte in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis, während Sie fortfahren mit den Schritten 1.8 und 1.9.
8. Im Fall von großen Tonsillen, die größer als 2 cm groß (Figur 2), quetschen die Tonsillen-Fragmente in zwei Zellsiebe, um ein Verstopfen des Siebs in das Sieb zu vermeiden.
9. Besorgen Sie sich die endgültigen Volumen von 35 ml der Zellsuspension.
   Anmerkung: In diesem Schritt ist es möglich, die Zellsuspension zur Kryokonservierung (siehe Abschnitt 2) herzustellen.
10. 10 ml der Dichtegradientenlösung wie Ficoll in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen. Vorsichtig überlagern die Zell suspensIon (Schritt 1.9) auf der Oberseite der Dichtegradient-Lösung. Sollte das Mischen der Zellsuspension und der Dichtegradient-Lösung.
    Anmerkung: Der Dichtegradient Lösung auf RT erwärmen.
11. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension in einem Ausschwingrotor bei 700 × g für 20 min bei RT. Den Bremsfunktion an der Zentrifuge so schnell Bremsen kann die Steigung stören nicht zu aktivieren. Verwenden Sie außerdem die niedrigste Beschleunigungsfunktion an der Zentrifuge zur Verfügung.
    Anmerkung: Nach diesem Zentrifugationsschritt beobachten MNCs als flockigen weißen Schicht an der Grenzfläche, und die roten Blutkörperchen (Erythrozyten), Fibroblasten und Zelltrümmer als Sediment am Boden des Röhrchens.
12. Sorgfältig sammeln MNCs Schicht unter Verwendung eines 10 ml-Pipette. Legen Sie die Zellsuspension in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen.
13. 25 ml eiskaltem PBS zu der Zellsuspension und drehe das Röhrchen bei 300 xg für 5 min in einem Ausschwingrotor bei 4 ° C.
14. Entfernen Sie den Überstand mit einer 25 ml Pipetteund Zellpellet Waschstufe zwei weitere Male wiederholen. Schließlich Zellpellet in 15 ml PBS.
    Hinweis: Nach dem letzten Waschschritt ist es möglich, die Zellsuspension (siehe Abschnitt 2) Kryokonservierung.
15. Übernehmen 10 ul der Zellsuspension in Hämocytometer Zell Zählkammer und zählen die Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop. Abgeben der geeigneten Menge der Zellen (beispielsweise 2-3 x 10 ^{7) in einem} 15 ml-Zentrifugenröhrchen für eine nachfolgende magnetische Perle Trennung. Bewahren Sie dieses aliquoten auf Eis, bis der Schritt 3.2.

2. Kryokonservierung von Tonsilläre Cells

1. Bereiten Gefriermedium (90% FBS und 10% DMSO) und bewahren Sie es auf Eis. Für langfristige Lagerung halten die gefrierenden Medien bei -20 ° C.
2. Bestimmung der Gesamtzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers Zelle Zählkammer (Schritt 1.15). Berechnung der erforderlichen Menge an Gefriermedium nach dem gewünschten gefrorenen Zelldichte (beispielsweise 10 ^{7 Zellen}s / ml Gefriermedium).
3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 xg für 5 min. Den Überstand umfüllen, ohne das Zellpellet zu stören und Zellpellet in eiskaltem Einfriermedium (aus Schritt 2.1).
4. Verzichtet werden 1 ml Aliquots der Zellsuspension in sterilen Ampullen zur langfristigen Lagerung in flüssigem Stickstoff ausgelegt. Frieren Sie die Fläschchen in einem Isopropanol Kammer und lagern Sie sie bei -80 ° CO / N. Für die Langzeitarchivierung übertragen Sie die Vials in einen flüssigen Stickstoff enthaltenden Speicherbehälter oder ein 140 ° C Zell Gefrierschrank.
5. Um Durchstechflaschen mit eingefrorenen Zellen auftauen, erwärmen sie sich schnell in einem 37 ° C Wasserbad. Unmittelbar nach dem Auftauen, Dispergieren der Zellsuspension in 10 ml vorgewärmtem HBSS (mit Ergänzungen, Schritt 1.1) in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Drehe das Röhrchen bei 300 xg für 5 min, zu entfernen HBSS und Zellpellet bei der gewünschten Zelldichte in HBSS (mit Ergänzungen, Schritt 1.1).
   Hinweis: Die Funktionsfähigkeit des MNU after Auftauen von Bedeutung ist, da das Vorhandensein von toten Zellen, die die endgültige Ausbeute an gereinigtem B und T-Lymphozyten zu verringern.
   Hinweis: Nach unserer Erfahrung die Lebensfähigkeit der Zellen weniger als 80% wird die Zellisolationseffizienz zu reduzieren.

3. Positive Selektion von T-Lymphozyten-Population aus Tonsilläre MNCs

Hinweis 1: Dieses Protokoll wird auf positive Selektion von menschlichen ^CD3 + T-Lymphozyten von Tonsillen MNCs mit magnetischen Kügelchen an den CD3-Antikörper gekoppelt basiert. Es ist möglich, diesen Abschnitt aus frischen (Abschnitt 1) ​​oder den gefrorenen (Abschnitt 2) MNU starten.

Anmerkung 2: Beginnen Sie mit 3 x 10 ⁷ MNCs. Nehmen Sie dieses Zellzahl nicht überschreiten, da die Trennsäulen können verstopfen, und dies wird die Isolationseffizienz zu reduzieren. Verwenden größere Spalten, wenn mehr Zellen behandelt werden. Die in diesem Protokoll verwendeten Mengen sind experimentell für die Anzahl der Zellen, wir optimiertin unserem Versuchsaufbau ed.

1. Vorbereitung der Trennpuffer [PBS (pH 7,2), 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA]. Filtern Sie die Trennungspuffer durch ein 0,45 um-Filter und bei 4 ° C.
2. Spin der MNC-Suspension (Schritt 1.14) bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Resuspendieren der resultierenden Zellpellets in 240 & mgr; l (80 & mgr; l pro ¹⁰ 7 Zellen) eiskaltem Trennpuffer. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles 2 ml-Tube.
3. Mit 20 ul magnetischen CD3-Antikörper zu der Zelllösung. Die Röhrchen für 1 h bei 4 ° C inkubieren unter kontinuierlichem leichtem Mischen mit Zellen in Suspension zu halten.
4. Übertragen Sie alle der Zellsuspension in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml eiskaltem Trennpuffer, um die Zellen zu waschen.
5. Zentrifugieren der Röhre bei 300 g 10 min bei 4 ° C in einem Ausschwingrotor.
6. In der Zwischenzeit die Magnetscheider und Spalte. Befestigen Sie den Magnetscheider in den Stand und legen Sie die Spalte in der separator. Indem 500 ul eiskaltem Trennpuffer Die Säule. Die Durchströmung zu verwerfen.
7. Legen Sie ein neues 15 ml Sammelröhrchen unter der Spalte. Halten Sie das Sammelröhrchen auf Eis.
8. Überstand verwerfen (Schritt 3.5) mit einer Pipette und sanft Zellpellet in 500 ul Trennpuffer. Übernehmen Sie die Zellsuspension auf der Oberseite des vorgewaschen Spalte und lassen Sie es durchlaufen.
   Hinweis: Zellklumpen können die Spalte verstopfen und damit die Durchflussrate zu reduzieren. Um dieses Problem zu vermeiden, legen Sie einen 40 & mgr; Kunststoff Zellsieb am oberen Ende der Säule. Vorbei an den Zellen durch diese Masche wird in hohem Grade verbessern die Effizienz dieser Methode.
9. 4-mal mit 1,5 ml Trennpuffer (500 & mgr; l für 10 ^{& sup7; Zellen)} Waschen der Säule. Warten Sie auf den Spalten Reservoir leer sein (keine Flüssigkeit in der Spalte eingehalten werden), bevor die nächste Waschschritt.
   Anmerkung: Beziehen Sie die CD3 unmarkierten Zellen, wie B-Lymphozyten-Fraktion betrachtet, wie sie sind,in den Sammelröhrchen eluiert.
10. Entfernen Sie die Säule aus dem Abscheider und Ort in eine neue 15 ml Sammelröhrchen. Pipette 2 ml Trennpuffer auf die Säule. Unter Verwendung der mit der Säule zugeführt Stößel eluieren die positiv ausgewählten T-Lymphozyten, die als die T-Lymphozyten-Anteil gelten.
11. Bestimmen die Anzahl der gereinigten Zellen (Schritt 1.15), falls erforderlich. Zellsuspensionen sind nun bereit für nachgeschaltete Experimente.

4. Durchflusszytometrie Analyse von isolierten Tonsilläre B- und T-Lymphozyten

ACHTUNG: Paraformaldehydlösung ist reizend und vermutetes Karzinogen. Geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille / Gesichtsschutz tragen.

Anmerkung 1: Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur direkten Färbung der isolierten B-und T-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Der Hauptzweck dieses Schrittes ist es, die Reinheit des isolierten Zellpopulationen af ​​beurteilenter CD3-Antikörper magnetische Trennung. Zu diesem Zweck gegründet B- und T-Zell-Marker, fluorophorkonjugierten monoklonale Antikörper CD20-FITC und CD2-APC, verwendet. Auch die Einbeziehung der Isotypkontrolle Antikörper ist sehr zu empfehlen, um die nicht-spezifische "Hintergrund" Bindung der CD2 und CD20-Antikörper (siehe Schritt 4.8) zu unterscheiden.

Anmerkung 2: Es ist möglich, die gereinigten Zellfraktionen in eine 1% Paraformaldehyd (PFA) Lösung im Dunkeln bei 4 ° C bis zum Zeitpunkt der Färbung zu halten (beispielsweise am nächsten Tag.). Auch die gleiche Vorgehensweise gilt, wenn es eine Zeitlücke zwischen Anfärbung und FACS-Analyse. Erinnern, dass in beiden Fällen Zellen sollten richtig mit PBSA (PBS enthaltend 0,2% BSA), vor der Färbung oder FACS-Analyse gewaschen werden.

1. Nehmen 6 x ¹⁰ 6 Zellen der MNCs aus Schritt 1.15 (vor dem Aufbringen auf die Säule), B-Lymphozyten-Fraktion aus Schritt 3.9 und T-Lymphozyten-Fraktion von Schritt 3.10.
2. Drehen Sie das HandySuspensionen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C unter Verwendung eines ausschwenkbaren Rotors.
3. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie das Zellpellet einmal mit 1 ml eiskaltem PBSA. Dreh die Zellsuspensionen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette resuspendieren und die Zellen in 600 & mgr; l eiskaltem PBSA Puffer.
4. Zugabe von 100 ul der Zellsuspension auf den Boden eines FACS-Röhrchen.
5. Geben Sie 100 ul PBS, das 10% hitzeinaktiviertem Humanserum in jedes Röhrchen, gut mischen und Inkubation für ca. 1 min bei RT oder 20 Minuten auf Eis.
   Hinweis: B-Lymphozyten tragen Fc-Rezeptoren. Um die Fc-Rezeptoren blockieren die gereinigten Zellfraktionen werden mit 10% hitzeinaktiviertem Humanserum inkubiert. Das Humanserum wird Wärme durch Inkubation bei 56 ° C für 1 Stunde inaktiviert. Teilen Sie die Hitze inaktiviert Serum in kleinen Portionen und bei -20 ° C eingefroren.
6. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C in einem swing-out-Rotor.
7. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie das Zellpellet mit 1 ml PBSA. Wiederholen der Zentrifugation (300 · g für 5 min bei 4 ° C).
8. 100 l PBSA in jedes Röhrchen auf Eis. Die geeignete Menge von fluorophorkonjugierten monoklonalen Antikörper gemäß den Empfehlungen des Herstellers (beispielsweise 20 & mgr; l Anti-CD20-und / oder 5 & mgr; l anti-CD2-Antikörper in 100 ul PBSA). Hinweis: Vergessen Sie nicht, genügend Kontrollröhrchen für die FACS-Analyse zuweisen. In diesem Protokoll sind die folgenden Kontrollen eingeschlossen: 1) Zellen, die mit Anti-CD2 und Anti-CD20-Antikörper einzeln gefärbten, 2) Zellen, die mit Anti-CD2 und Anti-CD20 Isotypkontrolle Antikörper einzeln und, 3) Zellen, die ohne Zugabe gefärbten von Antikörpern.
9. Vortexen Sie das Röhrchen und Inkubation für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln.
10. Mit PBSA waschen 2 mal. 2 ml 1% PFA-Lösung zu den Proben. Lassen Sie die Zellen bleiben in der PFA-Lösung bei 476; C im Dunkeln bis zur Zeit des FACS-Analyse.
11. Unmittelbar bevor Sie die Proben in der FACS-Maschine, Waschen Sie die Zellen 2 mal mit PBSA (300 xg für 5 Minuten bei 4 ° C). Resuspendieren Proben in 1 ml PBS und Halten bei 4 ° C (oder auf Eis), vor Licht geschützt, vor der Trennung auf dem Durchflußzytometer.
12. Haben die FACS-Sortierung nach dem Protokoll vom Durchflusszytometer Hersteller.

5. PCR-Nachweis von Adenovirus DNA in getrennter Tonsilläre B und T-Lymphozyten

Anmerkung 1: Die Adenovirus-Hexon-Gen-Primer AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') und AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') ^11. Diese Primer erzeugen ein Amplikon von 139 bp. Der Host 18S rRNA-Gen kann mit Primern tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') und TP207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3') detektiert werden. Der Erwartete Fragmentlänge von 300 bp.

Anmerkung 2: Jeder PCRLauf umfasst eine negative Kontrolle (destilliertes _H 2 O) und einer aus menschlichen B-Zelllinie (BJAB) erhaltenen positiven DNA-Steuerung mit menschlichen Adenovirus Typ 5 ¹² infiziert.

1. Extrahieren DNA (mindestens 1 x ¹⁰ 6 Zellen, Stufe 3.11) unter Verwendung von Silica-Membran anhand Säulenreinigungsverfahren. Auszug RNA mit Phenol und Guanidinisothiocyanat ^Lösung 13.
2. Werden 100 ng DNA von B- und T-Lymphozyten zu einer Reaktionsmischung, enthaltend 1x HF-Puffer, 0,2 mM Desoxynukleotidtriphosphat-Mix (dNTP), 0,25 & mgr; M von jedem Primer und 1 U der High-Fidelity-DNA-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 20 ul.
3. Zuführen PCR-Amplifikation unter folgenden Zyklusbedingungen: 30 sec Denaturierung bei 98 ° C, gefolgt von 30 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 67 ° C (Hexon) bzw. 58 ° C (18S rRNA) für 30 sec und 72 ° C für 30 sek. Die PCR-Reaktion wurde mit einem letzten Verlängerungsschritt von 7 min bei 72 ° C beendet.
4. Trennen Sie die resultierende PCR Amplification Produkte auf einem 1,5% Agarose-Gel in 1x TBE-Puffer und visualisieren die erwarteten Banden durch Färbung mit Nukleinsäurefärbung.

Ergebnisse

Eine effiziente Trennung von Tonsillen MNCs zu hochgradig gereinigten Subpopulationen von B und T-Lymphozyten. Dies wurde durch FACS-Analyse unter Verwendung von anti-CD20 und anti-CD2-Antikörper an B und T-Lymphozyten-Populationen, bzw. (3A) zu detektieren bestätigt. Im Gegensatz dazu eine ineffiziente Abscheidung von MNCs Ergebnisse in Zellfraktionen, die eine Mischung von Zellen von sowohl B als auch T-Lymphozyten-Subpopulationen (3B) sind.

Die isolierte ...

Diskussion

Einer der wichtigsten Faktoren, die die Ergebnisse dieses Protokolls ist die Verwendung von frischen tonsillar Material wie das Ausgangsmaterial. Daher sollten die Tonsillenproben innerhalb von 3 h nach der Operation verarbeitet werden. Mandeln können von Erwachsenen und Kindern erhalten werden. Rachen Materials von den Kindern der Regel kleiner ist durch die teilweise operative Entfernung der Mandeln (Tonsillotomie). Daher ist die Anzahl der MNCs aus Tonsillotomie Proben (1 x 10 ⁷ -1 x 10 ⁸⁾ erhal...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS)	Gibco	14175-053	Enthält 5% fötales Rinderserum (FBS), 10 mM Glutamin,    0,05 mg/ml Gentamicin und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum-Mischung
Gefriermedium			90 % FBS und 10 % DMSO
MACS-Puffer			PBS (pH 7,2), 0,5 % BSA und 2 mM EDTA
PBSA			PBS mit 0,2 % BSA
PFA			PBS mit 1 % Paraformaldehyd (PFA). Frisch machen. PFA steht im Verdacht, krebserregend zu sein. Tragen Sie Handschuhe und eine Schutzbrille.
Antibiotikum-Antimykotikum-Mischung	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Präparieren von Foreceps	Fisher Scientific	1381241
Gerade Irisschere	Fisher Scientific	12912055
Einweg-Skalpelle	Swann-Morton	REF 0501
100 μ m Kunststoff-Zellsieb	Corning Life Sciences	352360
40 μ M Kunststoff-Zellsiebe	Corning Life Sciences	352340
2 ml Kunststoffspritze	BD Biosciences
15 ml konische Zentrifugenröhrchen	SARSTEDT	62554502
50 ml konische Zentrifugenröhrchen	SARSTEDT	62547254
Langsamlaufende Zentrifuge mit Festwinkel- oder Ausschwingrotor	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll– Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll Lösung
Fötales Kälberserum	Biologische Industrie	040071A
Dimethylsulfoxid (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML
MACS MS Säulen	Miltenyi Biotec	130-042-201
MACS humane CD3-Mikrobeads	Miltenyi Biotec	130-092-881
MACS-Separator (Octo MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
Rinderserumalbumin (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 konjugiert mit Allophycocyanin ( CD2-APC)	BD Biowissenschaften
CD20, konjugiert mit Fluorescein-Isothiocyanat (CD20-FITC)	BD Biowissenschaften
Humanserum	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	Thermo Scientific	F-530L
FACS-Röhrchen	BD Falcon	352003
Kryoröhrchen	SARSTEDT	72379
BD LSRII Durchflusszytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1 Software	BD Biosciences
Nukleospin Blut	Macherey-Nagel	740951.50	DNA-Isolationskit
TRIzol  Reagenz	Life Technologies	15596	RNA-Isolationsreagenz
Hämozytometer	The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	0610030	Zellzähler
GelRed	Biotium	41003	Nukleinsäure-Gel-Färbung