Isolierung von Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Ratte Hoden

Zusammenfassung

Primäre Sertoli-Zellen sind für das Studium Hoden-Immun-Privileg, Signaltransduktion während der Entzündung oder Infektion und Nutzung ihrer immun Eigenschaften erforderlich. Hier beschreiben wir ein Enzym-basiertes Protokoll für die Isolierung von hoch gereinigten primären Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Rattenhoden.

Zusammenfassung

Der Hoden, insbesondere der männlichen Gameten, fordert das Immunsystem in einer einzigartigen Art und Weise, weil differenziert Spermien zuerst zum Zeitpunkt der Pubertät erscheinen - mehr als zehn Jahre nach der Gründung der systemischen Immuntoleranz. Spermatogenen Zellen exprimieren eine Reihe von Proteinen, die vom Immunsystem als nicht-selbst gesehen werden. Der Hoden muss dann in der Lage sein, Toleranz auf der einen Seite auf diese Neo-Antigene herzustellen, aber immer noch selbst zu schützen können vor Infektionen und Tumorentwicklung auf der anderen Seite. Daher ist die Hoden eines der wenigen Immun privilegierten Stellen im Körper, die ohne evozieren eine schädliche entzündliche Immunantwort fremde Antigene tolerieren. Sertoli-Zellen spielen eine Schlüsselrolle für die Pflege dieser Immun privilegierten Umgebung der Hoden und auch das Überleben von cotransplanted Zellen in einer fremden Umgebung zu verlängern. Daher Primär sind Sertoli-Zellen ein wichtiges Instrument für die Immunprivileg des Hodens studieren, die nicht E sein kannasily von etablierten Zelllinien oder andere zelluläre Modelle ersetzt. Hier präsentieren wir eine detaillierte und umfassende Protokoll zur Isolierung von Sertoli-Zellen - und peritubulären Zellen, falls gewünscht - von der Ratte Hoden innerhalb eines einzigen Tages.

Einleitung

Hoden produzieren männlichen Gameten und Sexualhormone, also Androgene. Die Orgel ist aus zwei Kammern besteht. In den Zwischenraum repräsentiert, dass etwa 10-12% der gesamten Hoden ^{Band 1,} Steroidbildung findet innerhalb der Leydigzellen. Die röhrenförmige Kammer entspricht etwa 60-80% des Hodenvolumen ^{1 und} enthält Keimzellen und zwei Typen von somatischen Zellen - peritubulären Zellen und Sertoli-Zellen. Der Hoden wird durch Bindegewebssepten in 250-300 Läppchen unterteilt, die jeweils mit 1-3 stark gewundene Hodenkanälchen. Diese Röhren werden durch eine Basalmembran, ein Blatt von Kollagen eingeschlossen und einer umlaufenden Schi....

Protokoll

1. Tierethikerklärung

Hier beschriebenen Experimente wurden für die Pflege und Verwendung von Tieren zu Versuchszwecken nach den Richtlinien des Regierungspräsidiums Gießen, Deutschland, als die Kommune und bestätigen, um den deutschen Code of Practice durchgeführt (Berechtigungs Nr.: GI 20/23 Nr A 31 / 2012).

2. Herstellung von Medien, Enzymlösungen und Tiere

1. Bereiten 1% Jod Alkohol durch Auflösen von 1 g Jod in 100 ml Ethanol.
2. Bereiten 2x 500 ml Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca ^{2+ und Mg 2+} ergänzt jeweils mit 7,5 ml D-Glucose (100 g / l) und 5 ml 100x Penicilli....

Ergebnisse

Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Isolierung von ca. 12 x 10 ⁷ Sertoli-Zellen aus 10 Ratte Hoden. SO 3 x ^{10 6 Zellen} pro Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen plattiert, dass sechs bis sieben Platten mit 6 Vertiefungen für Experimente zur Verfügung stehen 7. Die Trypsin-DNase I-Verdau der wichtigste Schritt bei der Sertoli Zellisolierung ist. Wenn Verdauung an dieser Stelle zu weit voran, erhöht sich das Verhältnis von Keimzellen / Sertoli Zellen pr.......

Diskussion

Die Samenkanälchen werden von einer kreisförmigen Schicht aus peritubulären Zellen und einer basalen Lamina auf der luminalen Seite begrenzt. Die Sertoli-Zellen ruhen auf der Basallamina, bilden die Bluthodenschranke durch die Bildung von Verschlussverbindungen zwischen benachbarten Zellen und bilden den strukturellen Rahmen für die Organisation des Samenepithels. Sertoli-Zellen und benachbarte spermatogene Zellen pflegen während der gesamten Entwicklung der Keimzellen enge Kontakte, die sowohl physischen Kontakt als auc.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aktin (glatte Muskulatur) Antikörper Klon 1A4	Dako	M0851	Monoklonaler Maus-Anti-Human-Antikörper. Verwenden Sie eine Verdünnung von 1:100 für die Immunfluoreszenz.
Albumin-Rinderfraktion V Standardqualität, lyophilisiert	Serva	11930.04	Filter (0,45 µ m) BSA-Lösungen, die für die Immunfluoreszenz verwendet werden.
Corning Zellsiebe 70  &Mikro; m	Corning	431751	Weiße Farbe
Kollagenase A aus Clostridium histolyticum	Roche	10103586001
DAPI Eindeckmittel ProLong Gold Antifade	Life Technologien	P-36931
D-Glukose	Sigma	G8644	100 g/L
Dulbecco & akut; s PBS ohne Ca2+/Mg2+	Gibco	14190-094
DNase I	Roche	10104159001
Elektronenmikroskop	Zeiss	EM 109S
Fluoreszenzmikroskop	Zeiss	Axioplan 2
Hyaluronidase aus Rinderhoden	Sigma	H3506
Inverses Licht	Mikroskop Olympus	CKX41	Routine-Zellkulturmikroskop
Maus IgG / IgM (H+L) polyklonal sekundär Antikörper	Life Technologies	A-10684	Alexa Fluor 488 konjugiertes
Öl Rot O	Sigma	O0625	Hat Sudan III und Sudan IV wegen hellerer Farbe ersetzt.
Paraformaldehyd	Sigma	P6148
Penicillin (5.000 & nbsp; U/ml)/ Streptomycin (5.000 µ g/ml)	Gibco	15070-063	100x Lösung
RPMI-1640	Gibco	21875-034	Enthält 300 mg/L L-Glutamin
Trypsin aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins	Sigma	T5266
Trypanblauer Farbstoff (0,4%)	Gibco	15250-061
Trypsin-Inhibitor aus Sojabohne	Sigma	T6522	Das Sigma-Produkt ist deutlich günstiger als das bisher verwendete BPTI (Aprotinin) von Roche.
Vimentin Antikörper (V9)	Sigma	V6630	Monoklonaler Maus-Anti-Schweine-Vimentin-Antikörper.  Verwenden Sie eine Verdünnung von 1:100 für die Immunfluoreszenz.
Wistar WU Ratten	Charles River		Sollte am Tag des Versuchs 19 Tage alt sein.