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Methodenartikel

Mess physiologischen Reaktionen von

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DOI:

10.3791/53392

⸱

29. April 2016

 ,  , 
1Temasek Life Sciences Laboratory, 2Department of Biological Science, National University of Singapore, 3Bioimaging and Biocomputing Facility, Temasek Life Sciences Laboratory, 4Histology and Light Microscopy Core, Gladstone Institutes, 5Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Vorderbeine und der Rüssel von Drosophila enthalten ein reiches Repertoire an geschmacklichen sensorischen Neuronen. Hier stellen wir eine Methode vor, die Calcium-Imaging verwendet, um physiologische Reaktionen von sensorischen Neuronen im Vorderbein und Rüssel lebender Fliegen nach exogener Applikation eines gustatorischen Pheromons zu messen.

Zusammenfassung

Im Gegensatz zu Säugetieren, Insekten wie Drosophila haben mehrere Geschmacksorgane. Die chemosensorische Neuronen an den Beinen, Rüssel, Flügel und ovipositor von Drosophila exprimieren Geschmacks- Rezeptoren 1,2, Ionenkanäle 3-6 und ionotropen Rezeptoren 7 , die bei der Erkennung von flüchtigen und nichtflüchtigen sensorischen Signale beteiligt sind. Diese Neuronen direkt tastants Kontakt wie Lebensmittel, Schadstoffe und Pheromone und daher beeinflussen viele komplexe Verhaltensweisen wie Fütterung, Eiablage und Paarung. Elektrodenaufzeichnungen und Kalzium-Imaging wurden in Insekten zu quantifizieren, die neuronalen Reaktionen hervorgerufen durch diese tastants weit verbreitet. Allerdings erfordert die Elektrospezialausrüstung und um Messungen von einem einzigen Geschmack Sensillum kann technisch schwierig sein, je nach Zelltyp, Größe und Position. Darüber hinaus können einzelne Neuron Auflösung in Drosophila schwierig sein , da Geschmack sensilla hou zu erreichense mehr als eine Art von chemosensorische Neuronen. Die Live-Kalzium-Imaging hier beschriebene Methode erlaubt Antworten einzelner Geschmacks- Neuronen im Live-Fliegen gemessen werden. Dieses Verfahren ist besonders geeignet zum Abbilden neuronaler Antworten auf Lipid Pheromone und andere Liganden-Typen, die eine geringe Löslichkeit in Wasser basierende Lösungsmittel haben.

Einleitung

Tiere verlassen sich auf Geruchs- und Geschmacks Informationen Entscheidungen zu vermitteln, von wesentlicher Bedeutung für das Überleben und die Fortpflanzung. Zu verstehen , wie chemosensory cues werden erkannt und durch das Nervensystem verarbeitet erfordert die Identifizierung des sensorischen Rezeptor (en) und die entsprechenden chemischen Liganden. Drosophila eine erstaunliche Vielzahl von flüchtigen und nicht-flüchtigen Verbindungen erkennen und sind ein ausgezeichnetes Modell , bei dem die physiologische Studie Mechanismen der Chemosensorik. Während die Geruchsorgane flüchtige Moleküle wahrnehmen, werden die Geschmacks- Organe spezialisiert geringe Flüchtigkeit Verbindungen zu erkennen. Hier präsentieren wir eine Methode zur direkten neuronalen Antworten von den Geschmacksorgane von Drosophila melanogaster zu schwerflüchtige lipophile Liganden messen.

Gustatory Organe der Fliege sind die Vorderbeine, Rüssel und Flügel. Verteilt auf der Oberfläche der Geschmacksorgane sind haarähnliche Strukturen als sensilla bekannt, die auf s antwortenugars, Bitters, Salze, Wasser und Pheromone 8. Die sensilla wurden morphologisch in Geschmack Borsten klassifiziert und Geschmack Heringe 9. Es gibt etwa 31 Geschmack Borsten auf dem Labellum, die in den langen (L-Typ) klassifiziert sind, kurz (s-Typ) und Zwischenprodukt (i-Typ) Morphologien. Die 'l' und 's' sensilla Haus 4 sensorischen Neuronen , die physiologisch zu Zucker (der S - Zelle), wenig Salz (das L1 - Zelle), hohe Salz und Bitterstoffe (die L2 - Zelle) und Wasser (die W - Zelle) 10 antworten , 11. Die "i" sensilla Haus 2 sensorischen Neuronen, von denen 12 sowohl zu niedrigen Salz und Zucker, während die anderen reagiert auf hohe Salz reagiert. Es gibt etwa 41 Geschmack sensilla bei Männern und 26 bei Frauen sensilla auf jeder der Vorderbeine verteilt. Für Männer und Frauen gibt es 21 sensilla auf dem midleg, und etwa 22 sensilla auf dem Hinterbein 13. Die geschmackliche Neuronen durch den Geschmack sensilla auf den Beinen eingeschlossen sind auch classified in L1, L2, W und S-Typen.

Ein Standardverfahren zur Messung der elektrischen Aktivität von einzelnen Neuronen verwendet extrazelluläre oder intrazelluläre Elektroden Ionenstrom zu erfassen. Elektrodenmessungen erlauben neuronale Funktion in nicht-Modellorganismen wie Drosophila - Arten, Motten und Bienen , die umfangreiche genetische Werkzeuge für neuronale Kennzeichnung fehlt untersucht werden. Routinemäßig verwendet haben , jedoch während elektrophysiologischen Methoden wurden Aktivität von Drosophila Geschmack sensilla 4,13,14 zu messen, dieser Ansatz zugrunde gelegt stellt einige technische Herausforderungen. Zuerst schmecken Borsten identifiziert werden müssen, basierend auf der Morphologie und der räumlichen Lage. Bei der Identifizierung kann elektrophysiologische Messungen durch die geringe Größe des sensilla behindert werden, begrenzt Zugänglichkeit durch Position und Schwierigkeiten bei der Anwendung von kontrollierten Mengen eines chemischen Stimulus zu einem Geschmack Borste. Auch die Stimulation von sensilla erzeugen kann Signale von mehr als einerneuronale Typ 15. Zweitens Detektion elektrischer Signale kann durch Hintergrundrauschen verwechselt werden, die aus mechanischen Schwingungen und Geräusche von der elektronischen Ausrüstung. Drittens kann die Verwendung eines geschärften Elektrode , die Fliege Vorbereitung beschädigen, wenn sie falsch 14 verwendet. Schließlich erfordert eine Elektro Rig Montage spezialisierten elektronischen Komponenten für Stimulus Lieferung, Signalaufzeichnung und Datenanalyse und kann teuer werden.

In D. melanogaster, hat die Verfügbarkeit von genetisch-codierten Werkzeuge , um die Entwicklung von Bildgebungstechniken erleichtert , dass die Antworten von kleinen Populationen von Neuronen ermöglichen sucht werden. Ein solcher Ansatz ist die Verwendung des CaLexA Reporter 16. Bei diesem Verfahren Gensequenzen den Faktor LexA-VP16-Transkriptions Codierungs- und eine Calcium-empfindliche Protein NFAT miteinander verschmolzen. Calcium Aktivierung der Proteinphosphatase Calcineurin katalysiert die de-Phosphorylierung von NFAT und wiederum, facilitaTES seinen Import in den Zellkern. Im Kern bindet das LexA-Domäne in eine LexAop-DNA-Bindungsmotiv, das die Expression eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) reporter, wodurch nachhaltige Identifizierung von funktionell aktivierten Neuronen lenkt. Der Ansatz wurde erfolgreich zur Messung der Reaktion von spezifischen olfaktorischen Glomeruli im Antennallobus nach der Exposition von lebenden Fliegen Riechstoff 16 verwendet. Vor kurzem wurden die physiologischen Reaktionen von IR52c Geschmacks- Rezeptorneuronen von lebenden Fliegen gemessen mit CaLexA 7. Jedoch für diese Studie war es notwendig, zu altern Fliegen für bis zu 6 Wochen GFP Transkription zu erhöhen. Während Immunfärbung mit einem Anti-GFP-Antikörper verwendet werden kann, die CaLexA Signal zu verstärken, würde diese Methode Gewebefixierung erfordern, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wird zum Abbilden lebenden Zellen.

Genetisch kodierte Calciumindikatorprotein GCaMP auch neuronale Reaktionen in einer Anzahl von zu studieren extensiv verwendet wurde,Spezies 17. Das Protein GCaMP fluoresziert mit geringer Intensität vor neuronale Stimulation. Anwendung eines Stimulus löst ein Aktionspotential in dem Neuron, wodurch der Einstrom von Ca 2+. GCaMP, gebunden an Ca 2+, erfährt eine Konformationsänderung, so dass es mit heller Intensität (Abbildung 1) zu fluoreszieren. Ein vor kurzem Single-Neuron - Kalzium - Imaging - Ansatz entwickelt wurde verwendet für die foreleg Neuronen spezifischen Gr61a Geschmacks- 18 Glukose als Ligand zu identifizieren. In dieser Studie wurden seziert Vorderbeine aus transgenen Drosophila exprimiert GCaMP in Gr61a gustatorischen Neuronen wurden mit einer Schicht aus Agarose vor der Bilderzeugung behandelt. Jedoch kann die Verwendung von sezierten Gewebe verursachen eventuelle Verminderung von GCaMP Expression, wodurch die Messzeit und die Erfassungsempfindlichkeit begrenzen. Zusätzlich kann Agarose begrenzen Empfindlichkeit aufgrund der hohen Hintergrundniveaus der Fluoreszenz und ihre Lichtstreuungseigenschaften.

To einige dieser Nachteile ansprechen, beschreiben wir die Verwendung von GCaMP-vermittelten Calcium Imaging physiologischen Reaktionen von foreleg und Rüssel Geschmacks- Neuronen intakter Tiere aufzunehmen. Wir zeigen die physiologischen Reaktionen von Gr68a und ppk23 Neuronen exprimieren genetisch kodierte GCaMP5G 19 einem Drosophila Lipid Pheromon, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Neuronale Antworten werden durch Quantifizieren der Zunahme der Fluoreszenz des GCaMP5G Signals während Pheromon Stimulation gemessen. In diesem Protokoll Neuronen sind für eine Gesamtdauer von 120 sec abgebildet wird, wobei die Muster der neuronalen Aktivierung in einzelnen Zellen zu differenzieren ausreicht.

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Protokoll

1. Probenvorbereitung

  1. Überqueren Sie die Gal4 3,22 Fahrer zu UAS-GCaMP5G 19 Fliegen (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Lassen Sie das Kreuz bei 25 ° C wachsen.
    Hinweis: Generieren fliegt mit mehreren Kopien der Gal4 oder UAS-GCaMP Transgene helfen kann , die Fluoreszenzsignalintensität zu erhöhen. Eine frühere Version des UAS-GCaMP Transgen (UAS-GCaMP3) zeigten eine sehr schwache Fluoreszenzintensität , wenn sie unter der Kontrolle des Gr68a-Gal4 Treiber zum Ausdruck gebracht.
    1. Sammeln und getrennt nach Geschlecht neu erwachsenen Fliegen geschlüpften und erhöhen bei 25 ° C.
      Hinweis: Die Basisniveau von GCaMP5G florescence in Fliegen optimal ist im Alter zwischen 14 bis 28 Tagen. Isolieren von Fliegen nach Geschlecht schließt die Möglichkeit der sozialen Interaktionen, die die neuronalen Reaktionen beeinflussen können.
  2. Anästhesieren eine Fliege unter einem milden Strom von CO 2.
  3. Bringen Sie die fly zu einem Deckglas, indem man zuerst einen kleinen Tropfen von Nagellack in der Mitte eines 0,17 mm Deckglas platzieren. Sanft legen Sie eine Fliege auf seiner Seite auf dem Tropfen klaren Nagellack und sicherzustellen, dass der gesamte Rückgang der Fliege bedeckt ist.
  4. Führen Sie die Schritte 1.5 und 1.6 unter einem Sezieren Stereo, bei 8-facher Vergrößerung verwendet.
  5. Verwenden Sie einen nassen Pinsel, die einen foreleg der Fliege zu verlängern. Sichern die foreleg in Position durch zwei dünne Streifen des Bandes über die erste und fünfte tarsal Segmente (2A) platzieren. Dies wird tarsal Segmente T2-T4 für die Bildgebung (2B) aus.
  6. Um das Bild zu Neuronen auf den Rüssel, legen Sie einen dünnen Streifen Klebeband über die Tribüne des Rüssels die labellum (2C, D) zu belichten.
  7. Zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere um die Fliege mit einem PAP Stiftlösung fließt über die Deckfläche zu verhindern. Machen Sie Messungen innerhalb von 30 Minuten der Montage.

2. Herstellung von StimulusLösung

  1. Verdünnte lipophilen Liganden (wie CH503, in dieser Studie verwendet wurden ) in einer PBST - Lösung: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 0,1% Triton X-100 (v / v ); pH 7,4.
    1. Machen Sie eine 1 mg / ml Stammlösung des Liganden mit PBST. Bereiten Sie alle nachfolgenden Verdünnungen der Stammlösung mit PBST.
      Hinweis: Je nach der Löslichkeit des Liganden von Interesse können unterschiedliche Lösungsmittel erforderlich sein, um den Liganden aufzulösen. Die Löslichkeit von CH503 in verschiedenen Lösungsmitteln ist in Tabelle 1. Im Gegensatz zu anderen Lösungsmitteln beschrieben PBST keine Zunahme der Fluoreszenz erzeugen.

3. Die Stimulation von Gustatory Neurons und Image Acquisition

  1. Mit einem 10 ul-Pipette legen 10 ul PBST auf die Fußwurzel Segmente.
    Hinweis: Dieser Schritt feuchtet das Bein und verhindert, dass die Fußwurzel Segmente driften.
  2. Verwenden Sie ein optisches System, das eine Kamera von su hatffizient Geschwindigkeit und Empfindlichkeit auf eine gute Fluoreszenzsignal mit hoher Zeitauflösung zu erreichen.
    Hinweis: Für diese Studie haben wir eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop und eine sCMOS Kamera verwendet wird (siehe Materialliste).
  3. Wählen Sie die spezifischen tarsal Segment und Neuronen abgebildet werden. Erwerben drei Vorstimulation konfokalen Z-Stacks.
    1. Idealerweise Einstellungen Verwendung Erwerb, die schnell genug maximale Zeitauflösung zu ermöglichen, während noch die gesamte Zellvolumen zu erfassen. Beispiel Erwerb Einstellungen sind: 200 ms Belichtung, Binning 2 x 2 und 6 x 0,5 um 2 optische Schnitte, erfasst alle 2 Sek.
      Anmerkung: Immobilisierte Beine abgebildet wurden erfolgreich für bis zu 10 min, bei 30 sec Intervallen ohne erkennbare Bleichen des GCaMP Signals. Für längere Aufnahmezeiten zu gewährleisten, dass die Beine sehr fest an ihrem Platz auf dem Deckglas gehalten werden.
    2. Optimierung der Laserleistung für höchste Signal-zu-Rausch erreichbare mit minimaler Photobleaching während der gesamten imaGing Regime. Für die Experimente hier beschriebenen verwenden, um eine 491 nm Diodenlaser (100 mW) bei 30% Durchlässigkeit für die Bildgebung sowohl Gr68a und ppk23 gustatorischen Neuronen an den Beinen und Rüssels. Verwenden Sie 2 x 2-Binning für kürzere Belichtungszeiten zu ermöglichen, während noch eine ausreichende räumliche Auflösung zu erreichen.
      Hinweis: Die Laserleistungseinstellungen wurden optimiert Detektion von Fluoreszenzänderung von einem 1,2- bis 4,5-fache Steigerung bis hin zu ermöglichen.
  4. Pipette 10 ul der Lösung auf die Stimulus tarsal Segmente. Für Kontrollexperimente, fügen Sie eine weitere 10 ul PBST. Unmittelbar 117 Poststimulations Bilder erwerben.
    Anmerkung: Die Anzahl der Poststimulations Bilder erfasst wird basierend auf der Menge an Zeit, in der die maximale Änderung der Fluoreszenz erreicht war (ca. 2 min).
    1. Kritischste Schritt: Während bei der Vorbereitung Pipettieren Lösung, nicht die Fliege mit der Pipettenspitze zu berühren, da dies der foreleg wird dazu führen, dass aus der Position zu bewegen.
      Hinweis: Alternativ verwendenenthält Reiz der Nähe des tarsal Segment ein Mikromanipulator, um genau eine Glaskapillare Position abgebildet werden. gesteuerte Mengen von Stimulus liefern eine intrazelluläre Mikroinjektion Spender nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird.

4. Bildverarbeitung und Analyse: Die Quantifizierung der Reaktion

  1. Öffnen Sie eine Reihe von konfokalen Z-Stapel mit Fidschi ( http://fiji.sc/Fiji ) 23 oder ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) 24 Bildanalyse und Verarbeitungssoftware.
  2. Machen Sie eine Summe-Intensitätsprojektion aller sechs Z-Scheiben für jede der 120 Zeitpunkten.
    1. Wählen Sie den "Stack" Option unter "Bild". Außerdem wählen Sie die Option "Z Projektion" und "1" als Start Scheibe und "4" als Anschlagscheibe ein. Für Projektionstyp, wählen Sie R20; Summe Scheiben "aus dem Pull-Down-Menü, und wählen Sie" Alle Zeitrahmen ".
  3. Definieren Sie die Region of Interest (ROI) durch die freihändige Auswahlwerkzeug mit einer Grenze um einen Zellkörper oder neuronalen Projektion zu zeichnen. Klicken Sie auf "Analyze" Label und wählen Sie die "ROI-Manager" Option unter "Tools".
  4. Quantifizieren der Fluoreszenz des ROI durch die "Set-Messungen" Option wählen, unter der "Analyse" Menü und die Kontrollkästchen für die integrierte Dichte, Fläche, mittleren und maximalen Grauwert und Label. Dann wählen Sie die "Mehr" Option unter dem ROI-Manager-Menü und weiter die "Multi Maßnahme" Option auswählen.
    Anmerkung: Dies wird ein Popup-Feld mit Werten für jeden der ausgewählten Parameter zu erzeugen.
  5. Überprüfen Sie die maximale Grauwerte , um sicherzustellen , daß keines der Pixel Sättigung erreicht haben (beispielsweise 65.535 für einen 16-Bit - Kamera).
    HINWEIS: Für die Versuche in t gezeigtsein Papier, wurden Antworten entweder aus Zellkörpern oder neuronale Projektionen gemessen, je nachdem, wo der maximale Anstieg der & Delta; F / F beobachtet wurde.
  6. Berechnen Sie die maximale relative Fluoreszenzänderung (& Dgr; F / F) zum Zeitpunkt t ist wie folgt:
    figure-protocol-1
    1. Subtrahieren Hintergrundfluoreszenz von jedem F (Zelle) Wert. In den Hintergrundfluoreszenz, Messen der integrierten Dichte einer ROI gleicher Größe und Form von einem Bereich des Vorderbeins (oder Rüssel) frei von nachweisbaren Neuronen zu quantifizieren.
    2. Die post-Stimulation Fluoreszenz, F (Zelle) t, messen Sie die integrierte Dichte des ROI des Zellkörpers oder Prozess zum Zeitpunkt "t" nach der Stimulation zu quantifizieren.
    3. Die Vorstimulation Fluoreszenz, F (Zelle) , t = 0, zu analysieren pre-Stimulus Bilder des Zellkörpers oder Verfahren in der gleichen Weise zu quantifizieren , wiedie Post-Stimulationssignal. Verwenden Sie die mittlere integrierte Dichte von 3 Bildern F (Zelle) t = 0 zu bestimmen.

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Ergebnisse

Die GCaMP Calciumindikator wurde genetisch mit Gr68a-Gal4 oder ppk23-Gal4 Treiber zum Ausdruck gebracht. Distinct Populationen von foreleg Neuronen und nicht-neuronalen Stützzellen werden von jedem Fahrer (3A-C) bezeichnet. Ligand-spezifische Antworten auf die lipophilen Pheromon CH503 wurden in Gr68a-Gal4 und ppk23-Gal4 - exprimierenden Zellen GCaMP (3D) beobachtet. Die relative Veränderung der Fluoreszenzintensität des GCaMP5G Signal (& Dgr;...

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Diskussion

Wir beschreiben hier eine Methode , um Live - Kalzium - Imaging von Drosophila peripheren Neuronen in 2 verschiedenen Sinnesorgane durchführen. Die Ca 2+ -evoked GCaMP fluoreszierende Reaktionen in Gr68a-Neuronen durch den Pheromon - Liganden induziert CH503 waren dosisabhängig und quantitativ. Es war auch möglich, verschiedene neuronale Antwortmuster wie phasic und Tonikum Antworten zu erkennen.

Neurons zeigt phasischen Reaktionen wird angenommen, dass eine schnelle Anpa...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Singapore National Research Foundation (Grant NRF-RF2010-06 an J.Y.Y.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Gr68a-Gal4Geschenk von H. Amrein (Texas A& M Health Science Center, TX, USA) und J. Carlson (Yale University, CT, USA)
ppk23-Gal4Geschenk von K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)
UAS-GCaMP5 42037Bloomington Drosophila  Lager Center
0,17 mm Deckglas (Gold-Seal Deckglas)Elektronenmikroskopie Dienstleistungen63790-10
Nagellack, "Hard as Nails Clear" Sally Hansen
PAP KugelschreiberSigma-Aldbsp;
Pinselfeiner Spitze
Tape Schottische Marke
Triton X-100Sigma-Aldbsp;13021
Ethanol, LaborqualitätMerck10094
Hexan, HPLC-QualitätSigma-Aldrich H303SK-4
DMSOSigma-Aldbsp;
PBST-Rezeptbeschrieben im Protokollabschnitt
CH503Synthese, beschrieben in Mori et al., 2010
sCMOS Kamera (ORCA Flash4.0)Hamamatsu C11578-22U
Mikroskop (Ti-Eclipse)NikonNi-E
Spinning Disk ScankopfYokogawaCSU-X1-A1
Aquistion Software (MetaMorph Premier)Molecular Devices40002
Fiji SoftwareOpen Sourcehttp://fiji.sc/Fiji
Z377821 mit 472301,

Referenzen

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