Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Zusammenfassung

Die bakterielle Anheftung an Wirtszellen ist ein wichtiger Schritt während der Besiedlung und Infektion des Wirts. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von polymergekoppelten rekombinanten Adhäsinen als biomimetische Materialien, die es ermöglichen, den Beitrag einzelner Adhäsine zu diesen Prozessen unabhängig von anderen bakteriellen Faktoren zu analysieren.

Zusammenfassung

Die bakterielle Anheftung an Wirtszellen ist eines der frühesten Ereignisse während der bakteriellen Besiedlung von Wirtsgeweben und somit ein Schlüsselschritt während der Infektion. Die biochemische und funktionelle Charakterisierung von Adhäsinen, die diese anfänglichen Bakterien-Wirt-Interaktionen vermitteln, wird oft durch das Vorhandensein anderer bakterieller Faktoren wie Zellwandbestandteile oder sezernierter Moleküle beeinträchtigt, die die Analyse beeinträchtigen. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Verwendung von biomimetischen Materialien, bestehend aus reinen rekombinanten Adhäsinen, die chemisch an kommerziell erhältliche, funktionalisierte Polystyrolkügelchen gekoppelt sind und erfolgreich eingesetzt wurden, um die biochemischen und funktionellen Wechselwirkungen zwischen einzelnen bakteriellen Adhäsinen und Wirtszellrezeptoren zu entschlüsseln. Protokolle für verschiedene Kopplungschemien, die eine gerichtete Immobilisierung von rekombinanten Adhäsinen auf Polymergerüsten ermöglichen, und zur Bewertung der Kopplungseffizienz der resultierenden "bakteriomimetischen" Materialien werden ebenfalls diskutiert. Wir beschreiben weiterhin, wie diese Materialien als Werkzeug zur Hemmung der pathogenvermittelten Zytotoxizität eingesetzt werden können, und diskutieren den Umfang, die Grenzen und weitere Anwendungen dieses Ansatzes bei der Untersuchung von Bakterien-Wirt-Interaktionen.

Einleitung

Die Entschlüsselung der Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Adhäsinen und Wirtsoberflächenrezeptoren an der Wirt-Pathogen-Grenzfläche ist ein wesentlicher Schritt zum Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen, die die bakterielle Adhäsion antreiben. Letztendlich wird uns dies helfen, Strategien zu identifizieren, um in diese Prozesse während einer Infektion einzugreifen. Bei der Durchführung solcher Studien stehen wir oft vor einem Dilemma: Die biochemische und biophysikalische Analyse der molekularen Mechanismen der Adhäsinbindung erfordert deren Trennung von anderen Zellwandbestandteilen, was die Adhäsionsereignisse beeinträchtigen kann. Auf der anderen Seite vereinfacht die Verwendung rekombinanter löslicher Proteine das Adhäsionsereignis übermäßig, indem die Proteinverankerung in der bakteriellen Zellwand und die Multivalenz der Bindung, die durch die Darstellung der bakteriellen Oberfläche erreicht wird, außer Acht gelassen werden. Ebenso hat das Aufeinandertreffen und Binden an einzelne Adhäsinmoleküle aus Sicht der Wirtszelle nicht immer die gleichen Auswirkungen in Bezug auf die Organisation der Plasmamembran, die Membranfluidität und die Rezeptorclusterbildung¹, was es letztendlich schwierig macht, den Einfluss der Adhäsion auf die zelluläre Signalübertragung des Wirts und das Ergebnis von Bakterien-Wirt-Interaktionen zu bewerten.

Kürzlich wurde eine Methode entwickelt, bei der rekombinante gereinigte Adhäsine oder Adhäsinfragmente gerichts- und kovalent an Polymerpartikel gekoppelt werden, die in ihrer Größe wie Bakterien ähnlich groß sind, wodurch die Oberflächendarstellung von Bakterien nachgeahmt wird. Dieser Ansatz wurde bei einer Reihe verschiedener Adhäsine angewendet, von gramnegativen multivalenten Adhäsionsmolekülen (MAMs)^{2, 3} bis hin zu grampositiven Adhäsinen wie Staphylococcus aureus, Fibronektin-bindendem Protein (FnBPA)^{4, 5} und Streptococcus pyogenes F1, ^{6, 7}. Diese Methode ermöglichte die Dissektion von Adhäsinfragmenten, die für die Bindung an Wirtszellen wichtig sind, die Identifizierung von Rezeptoren auf der Wirtsoberfläche und die Bestimmung ihres Verhaltens auf der Oberfläche der Wirtszelle, wobei sowohl die Bindungsaffinität als auch die Avidität berücksichtigt wurden ^{1, 8}. Darüber hinaus wurde dieser Ansatz verwendet, um die Wirksamkeit von immobilisierten Adhäsinen und Derivaten als Inhibitoren von Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen ^{8, 9}. Es wurde gezeigt, dass oberflächengekoppelte Derivate des Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 verwendet werden können, um eine Reihe von bakteriellen Infektionen in vitro abzuschwächen, einschließlich solcher, die durch multiresistente Erreger wie Acinetobacter baumannii und Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) verursacht werden ^{7, 9}.

Hierin beschreiben wir verschiedene Chemikalien, die verwendet werden können, um Adhäsine an kommerziell erhältlichen funktionalisierten Polystyrolpartikeln zu immobilisieren. Aufgrund der breiten Palette an verfügbaren Oberflächenfunktionalitäten, Markierungen und Partikelgrößen sind diese ein nützliches Gerüst für die Herstellung bakteriomimetischer Materialien zur Untersuchung von Adhäsin-Wirt-Interaktionen. Des Weiteren beschreiben wir Methoden zur initialen Charakterisierung der Kupplungsreaktion und zur Berechnung wichtiger Eigenschaften der resultierenden Materialien. Schließlich wird die Verwendung von Bead-gekoppelten Adhäsinen als kompetitive Inhibitoren von in vitro bakteriellen Infektionen als Beispiel für ihre Anwendung sowie der zukünftige Umfang und die Grenzen dieses Ansatzes diskutiert.

Protokoll

1. Chemische Kopplung von Proteinen an Perlpolymerisates

1. Thiol-Amin-Richtungskopplungs
   Hinweis: Dieses Protokoll ist für Kopplung von Cystein enthaltenden Proteinen zu Amin-funktionalisierten Polymerkügelchen mit Sulfosuccinimidyl-4- (p maleimidophenyl) butyrat (Sulfo-SMPB) als Vernetzungsmittel (1).
   
   Abbildung 1. Vernetzungsstrategie für gerichtete Thiol-Amin-Kupplung von Proteinen an Polymerkügelchen verwendet. Aminmodifizierten Polystyrol-Kügelchen sind mit Sulfo-SMPB aktiviert. Die Maleimid reagiert mit freien Cysteine ​​zu koppeln, Proteine, um Perlen gerichtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
   1. Herstellung der Reagenzien:
      1. Vorbereitung PBS (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) und Autoklaven.
      Bereiten Sie eine 100x Lager (0,5 M oder 287 mg / ml in PBS) von TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphin) unmittelbar vor der Verwendung.
   2. Bereiten Sie eine 5x Lager (10 mM bzw. 4,58 mg / ml in _dH 2 O) von Sulfo-SMPB unmittelbar vor der Verwendung.
   3. Bereiten Sie eine 10-faches (500 mM oder 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) von Cystein unmittelbar vor der Verwendung.
2. Bead-Aktivierung:
   1. Mischen die Perlensuspension durch sanftes Invertieren und Übertragen der erforderlichen Menge an Perlensuspension (beispielsweise 12 ml) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS, pH 7,0.
   2. Gently Pipette auf und ab, um die Perlen und Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge (2 min bei 16.000 × g) waschen.
   3. Den Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie vorsichtig entfernen. Resuspendieren der Wulst Pellet in 1 ml frischem sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschschritt. Resuspendieren Wulst Pellet in 0,8 ml PBS.
   4. Fügen Sie 200 ml frisch hergestellte 10 mM Sulfo-SMPB, um eine endgültige concent gebenration von 2 mm.
   5. Inkubieren der Perlen-Suspension für 1 h bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad.
3. Protein-Reduktion:
   1. Während der Inkubationszeit der Aktivierungsschritt vorzubereiten, die das Protein die folgenden Kupplungsschritt so kann sie sofort an die aktivierten Beads zugesetzt werden.
      Anmerkung: Obwohl diese Reduktionsschritt nicht immer für GST (Glutathion-S-Transferase) Fusionsproteine ​​erforderlich ist, wird empfohlen, eine hohe Kopplungseffizienz zu gewährleisten.
      1. Überprüfen der Proteinkonzentration und stellen sie auf die Endkonzentration für die Kupplungsreaktion erforderlich. Anmerkung: 6 mM Protein in PBS, und ein Volumen von 1 ml werden in der Regel verwendet.
      2. In TCEP Lager, um eine Endkonzentration von 5 mM zu ergeben. Inkubieren der Lösung für 30 min bei RT.
         Anmerkung: Das Reaktionsgemisch kann direkt für die folgende Kupplungsreaktion verwendet werden.
      3. Behalten eine kleine Menge (einige ml) der Proteinlösung für die Bestimmung der pro Proteinkonzentration und Berechnung des Kopplungseffizienz (siehe Abschnitt 2).
4. Protein-Kupplungsschritt:
   1. Pellet die aktivierten Beads durch Zentrifugation (2 min, 16.000 xg in einer Mikrozentrifuge) und wasche das Pellet einmal in 1 ml frischer steriler PBS.
   2. Das Pellet in die vorbereitete Proteinlösung (zum Beispiel 1 ml), um das gewünschte Proteinkonzentration zu ergeben.
      Achtung: Die Proteinkonzentration während der Kupplungsschritt wird auf die durchschnittliche Kupplungseffizienz (siehe Abschnitt 2 zur Bestimmung der Kopplungseffizienz) und der gewünschten Kupplungsdichte (wie in 1.1.4.3 berechnet) abhängen. Der Wirkungsgrad etwa 85%, und die gewünschte Endkonzentration 5 mM im 10x Perlensuspension, so Proteinkonzentration während der Kupplungsstufe sollte ungefähr 6 mm betragen.
   3. Berechnung der Kupplungsdichte unter Verwendung der folgenden Formel:
      jpg "/> wobei
      ρ _c Kupplungsdichte [Anzahl der Protein-Moleküle / nm ^2],
      Protein konzentrierter Proteinkonzentration [mg / ml]
      Protein _M w Proteinmolekulargewicht [da],
      Wulst konz Perlenkonzentration [Anzahl der Perlen / L],
      d Perlendurchmesser [nm ^2]
      Avogadro-Zahl
   4. Verwenden Sie die Kupplungsdichte, um die durchschnittliche Ligand Abstand berechnen:
      
   5. Inkubieren der protein Bead-Suspension 2 h bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad.
      Hinweis: EinigeProteine ​​können nicht stabil sein bei RT. In diesen Fällen kann die Reaktion bei 4 ° CO / N ausgeführt werden.
   6. Deaktivieren verbleibenden aktivierten Gruppen auf den Perlen durch Zugabe von Cystein-Lager bis zu einer Endkonzentration von 50 mM und Inkubation der Suspension für 30 min bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad. Pellet die Beads durch Zentrifugation (2 min, 16.000 xg in einer Mikrozentrifuge).
   7. Halten Sie den Überstand zur Bestimmung der Proteinkonzentration und Berechnung des Kopplungseffizienz (siehe Abschnitt 2).
   8. Zweimaliges Waschen der Bead-Pellet mit 1 ml PBS und resuspendieren in 1 ml frischem PBS, um das Endprodukt zu ergeben.
      Hinweis: Das obige Protokoll wird in der Regel geben, 1 ml gekoppelten Protein, in einer Endkonzentration von 5 mM Protein, das als 10x Lager für nachfolgende Experimente (siehe Abschnitt 3) verwendet werden kann.
   9. Um in Abschnitt 3 des Protokolls gehen, arbeiten mit 100 ml / ml Bead Lager, oder in einer Endkonzentration von 500 nM Protein. Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt für diese procedure ist 2 × ¹⁰ 12 Perlen / ml sein, was zu einer durchschnittlichen Kupplungsdichte von 3 × ¹⁰ -4 Proteine ​​/ nm ^{2 oder} einem mittleren Abstand von 57 nm auf einem Kügelchen von 2 mm Durchmesser.

Thiol-Carboxy Richtungskopplungs
Hinweis: Dieses Protokoll ist für die Kopplung Cystein enthaltenden Proteinen an carboxylfunktionalisierten Polystyrolperlen. Die Carboxylgruppe zunächst mit 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) / N-Hydroxysuccinimid (NHS), modifizierte Amin und anschließend vernetzt mit Sulfo-SMPB (Figur 2) aktiviert wird.

Abbildung 2. Vernetzungsstrategie für gerichtete Thiol-carboxyl Kopplung von Proteinen an Polymerkügelchen verwendet. Carboxylierte Polystyrolkügelchen werden zunächst mit EDC aktiviert und mit NHS modifiziert, um eine semistabile NHS-Ester zu bilden. Nachfolgende Amin-Kopplung ethylenediAmin führt zu einer freien Amingruppe, die sich mit Sulfo-SMPB reagiert. Maleimid aktivierte Kügelchen können dann mit freien Cysteinen reagieren paar Proteine, um Perlen gerichtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Herstellung der Reagenzien:
   1. Vorbereitung PBS (100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) und Autoklaven.
   2. Bereiten Sie eine 100x Lager (0,5 M oder 287 mg / ml in PBS,) von TCEP unmittelbar vor der Verwendung.
   3. Bereiten Sie eine 10-faches (20 mM oder 4 mg / ml in PBS) EDC (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) unmittelbar vor der Verwendung.
   4. Bereiten Sie eine 10-faches (50 mM, oder 6 mg / ml in PBS) des NHS (N-Hydroxysuccinimid) unmittelbar vor der Verwendung.
   5. Bereiten Sie eine 5x Lager (10 mM bzw. 4,58 mg / ml in _dH 2 O) von Sulfo-SMPB unmittelbar vor der Verwendung.
   6. Bereiten Sie eine 10-faches (500 mM oder 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) von Cystein sofort bevor Gebrauch.
2. Bead-Aktivierung:
   1. Mischungsperlensuspension durch sanftes Invertieren und Übertragen der erforderlichen Menge an Perlensuspension (beispielsweise 12 ml) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS, pH 7,0.
   2. Gently Pipette auf und ab, um die Perlen und Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge (2 min bei 16.000 × g) waschen.
   3. Den Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie vorsichtig entfernen.
   4. Resuspendieren der Wulst Pellet in 1 ml frischem sterilem PBS und wiederholen Sie den Waschschritt.
   5. Resuspendieren Wulst Pellet in 0,8 ml PBS.
   6. 100 ml 10-fach EDC Lager (2 mM Endkonzentration) und sofort 100 ml 10x NHS-Stammlösung (5 mM Endkonzentration) auf die Partikelsuspension.
   7. Inkubieren der Perlen-Suspension für 30 min bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad.
   8. Einmal zu waschen Kügelchen in 1 ml PBS und resuspendieren in 0,8 ml frischem sterilem PBS.
   9. In 200 ml Ethylendiamin und incUbate die Perlensuspension 1 Stunde bei 25 ° C auf einem rotierenden Rad.
   10. Einmal zu waschen Perlen mit 1 ml PBS und Resuspendieren der Kügelchen in 0,8 ml frischem PBS.
   11. Gehen Sie aus dem Abschnitt 1.1.2.4 (Wulst Aktivierung mit Sulfo-SMPB) wie in Abschnitt 1.1.2 beschrieben und folgen Sie den Rest des in Abschnitt 1.1 (Thiol-Amin-Richtungskopplungs) beschriebenen Protokoll. Führen Proteinpräparat und Protein-Kopplungsschritte in einer Weise identisch zu denen in Abschnitt 1.1 beschrieben.
       Hinweis: Die typische Kopplungseffizienz unter Verwendung dieses Protokolls ist etwas niedriger im Vergleich zum Abschnitt 1.1, also die anfängliche Proteinkonzentration entsprechend anpassen, um die gleiche Kopplungsdichte zu erreichen (ca. 75%.).

2. Bestimmung der Kopplungseffizienz

Hinweis: Um festzustellen, Proteinkonzentration, verwenden Sie Bradford-Reagenz ^{10 und} kolorimetrische Assays wie folgt:

1. Vorsichtig umdrehen Bradford-Reagenz bis e Nsure Homogenität des Reagens.
2. Unter Verwendung einer 10 mg / ml BSA-Stammlösung, prepare protein Normen für Konzentrationen von 0,1 bis 1,5 mg / ml BSA in Puffer.
3. Man 250 ml Bradford Reagenz in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen. Vorbereitung genug Vertiefungen für alle Proben, Proteinstandards und negative Kontrollen (nur Puffer).
4. 5 ml der Proteinprobe (Proteinstandards oder Puffer für die Negativkontrolle), um das Reagenz in der 96-Well-Platte.
5. Inkubieren der Platte auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur für 10 min.
6. Messung der Extinktion bei 595 nm mit einem Plattenlesegerät.
7. Generieren Sie eine Standardkurve der BSA-Konzentration gegen die A595 nm und nutzen diese, um Proteinkonzentrationen in der Aus- und Überstandsproben zu bestimmen.
8. Wird die Konzentration des gekoppelten Proteins wie folgt:
   
9. Berechnung der Kopplungseffizienz als:
   00eq4.jpg "/>

3. Verwendung von Bead-gekoppelter Adhäsine in Konkurrenztests

1. Vorbereitung:
   1. Samen 1 ml pro Vertiefung von HeLa-Zellen bei einer Konzentration von 150.000 Zellen / ml in eine Platte mit 24 Vertiefungen einen Tag vor der Kompetitionsassay, sodass die Zellen etwa 80% Konfluenz vor dem Beginn des Experiments zu erreichen.
   2. Richten Sie jeden experimentellen Zustand in dreifacher Ausfertigung. Fügen Brunnen für die negativen Kontrollen (keine Bakterien während der Konkurrenz-Assays hinzugefügt), positive Kontrollen (Kontrollkügelchen, um die Fusion-Tag nur während Kompetitionsassays hinzugefügt gekoppelt) und Lyse Kontrollen (Zytotoxizität Experimente).
   3. Impfen eine 5 ml marine LB (MLB) Kultur mit einer frischen Kolonie V. parahaemolyticus und wachsen O / N bei 30 ° C, zu zittern.
   4. Bereiten Sie ausreichend Kügelchen gekoppelt MAM, wie in Kapitel 1 (Kupplung) beschrieben. Lassen Sie für 100 ml 10x Korn Stock pro Vertiefung.
2. Competition Assay:
   1. Am Tag der competitIonen-Experiment messen die OD ₆₀₀ der Bakterienkultur.
   2. Bereiten Infektion Medien durch Bakterienkulturen in farblose DMEM ohne Zusätze verdünnt, auf 37 ° C vorgewärmt, mit 10% v / v Perlensuspension (entweder Adhäsin-gekoppelten Kügelchen oder Kontrollkügelchen), zu einer MOI von 10. Bereiten Sie 1 ml geben / gut, und 10-20% Überschussvolumen pro Probe. Anmerkung: Bei den oben genannten Bedingungen (24-Well-Platte, V. parahaemolyticus, MOI 10), das notwendige Volumen des O / N-Kultur zu je Vertiefung (ml / ml) ist als 3 / OD _{600 der} Kultur Höhe berechnet. Zum Beispiel wird 1 ml Infektionsmedium enthält typischerweise 100 ml Partikelsuspension, ein paar ml Bakterienkultur und bis zu 1 ml mit farblosen, nicht ergänzten DMEM hergestellt werden.
   3. Entfernen alte Medium aus den Vertiefungen und waschen kultivierten HeLa-Zellen durch Zugabe von 1 ml sterilem PBS vorgewärmt auf 37 ° C zu jeder Vertiefung.
   4. Entfernen PBS und 1 ml Infektionsmedium pro Vertiefung. Auch die Kontrollen eingestellt, durch Zugabe von Lösungen containing Steuer Perlen und Bakterien (positive Kontrolle) oder Adhäsin Perlen und keine Bakterien (negative Kontrollen) oder DMEM, das 0,1% Triton X-100 (Lyse-Steuerung, nur für Zytotoxizität Messungen erforderlich).
   5. Inkubieren der Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C für die gewünschte Zeitdauer (zB 4 Stunden auf Cytotoxizität Messungen oder 1 Stunde auf Haftung Messungen).
      Anmerkung: sind bakterielle Adhäsion und Zytotoxizität auf Wirtszellen können als Auslesungen für die Wirksamkeit der Hemmung verwendet werden. Wenn die Zeitpunkte der Zytotoxizität und Haftungsmessungen übereinstimmen, können beide Tests durchgeführt unter Verwendung von Proben aus der gleichen gut, da Zytotoxizität wird mit dem Kulturüberstand und Befestigungs Assays verwenden Proben aus der restlichen Zellschicht abgeleitet wird, bestimmt.
3. Zytotoxizität Messungen:
   1. Zu angegebenen Zeitpunkten (zB 4 Stunden nach der Infektion), entfernen Sie dreimal 200 ml von jedem 24-Loch und Transfer zumeine 96-Well-Platte.
   2. Spin 96-Well-Platten bei 1500 × g, 5 min und Transfer 100 ml aus jeder Vertiefung in ein frisches 96-Well-Platte. 100 ml der bei der Infektionsexperimente Frisch Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen in dreifacher Ausführung verwendeten Medien (diese werden als Rohlinge verwendet werden).
   3. Durchführung der Laktat-Dehydrogenase (LDH) Freisetzungstest unter Verwendung eines LDH Zytotoxizität Nachweiskits und nach den Anweisungen des Herstellers.
      1. Kurz gesagt, die Berechnung der Menge an Reagenz in Schritten von 25 benötigt (zB wenn 62 Proben gemessen werden sollen, machen genug Reagenz-Mix für 75 etc.).
      2. Zum Beispiel für 100 Proben, mischen 11,25 ml Reagenz A mit 250 ul Reagenz B. umkehren, nicht vortexen Schaumbildung zu vermeiden.
      3. Setzen Sie die Mischung in einem Behälter in der Lage sein, mit einer Mehrkanal-Pipette pipettiert werden. 100 l Reagenzienmix zu jeder Probe.
      4. Inkubieren Platte bei RT und die Extinktion bei 490 nm auf einem Plattenleser bei 10, 20, 30 min.
      Analysieren des Datensatzes, für die die Absorption der Lyse Kontrollprobe hoch ist, aber immer noch innerhalb des linearen Bereichs des Plattenlesers (typischerweise 2-3 Extinktionseinheiten).
   4. Express-Ergebnisse als% Zytotoxizität, nach der folgenden Formel für die Umrechnung:
      

Die Messung der bakteriellen Adhäsion:

1. Bei den angegebenen Zeitpunkten (beispielsweise 1 Stunde nach der Infektion), das Medium entfernt, der Zellschicht.
2. Die Zellschicht gründlich mit steriler, vorgewärmten PBS (mindestens 3-4 Wäschen von jeweils 1 ml PBS), um alle nicht-anhaftenden Zellen zu entfernen.
3. Lyse von Wirtszellen durch Zugabe von 1 ml einer sterilen 1% v / v Triton X-100-Lösung in PBS pro Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 5 min.
4. Pipettieren Sie jede Probe nach oben und unten mehrere Male, bevor die Übertragung der Inhalt der Vertiefungen bis 1,5-ml-Röhrchen zu trennen. Bereiten Sie das 10-fache serielle Verdünnungen von Probenin sterile PBS (zB verwenden 100 ml Probe und 900 ml PBS).
5. Platte 100 ml von jeder Probe auf MLB Agar und verteilt unter Verwendung einer Zelle Treuer. Optimieren Sie die je nach Bakterienstämme und Zeitpunkt bis zum Teller Verdünnung. Hinweis: Für die beschriebenen Versuchsaufbau, geben 10 ^{5 oder 10 6} fachen Verdünnungen eine geeignete Anzahl von KBE.
6. Platten bei 37 ° CO / N und aufzuzählen Bakterien durch Koloniezählung.

Ergebnisse

Die V. parahaemolyticus Adhäsin MAM7 enthält sieben Tandemsäugetierzell Eintrag (MCE) Domänen in Anerkennung der Host-Oberflächenrezeptoren beteiligt. Wir verwendeten Polystyrolkügelchen, um rekombinantes gekoppelt, gereinigten Fragmente umfasst entweder alle sieben Tandem MCE-Domains (MAM7) oder nur die erste MCE Domain (MAM1), um die Fähigkeit dieser Materialien, mit V. Wettbewerb testen parahaemolyticus für Wirtszellenbindung und die resultierende Wirksamkeit dieser Materialien als Haftinhibitoren. HeLa-Zellen wurden mit V. infiziert parahaemolyticus Stamm POR1 und Zytotoxizität von in vitro-Infektion wurde nach 4 h (Figur 3) untersucht. Behandlung von HeLa-Zellen mit 0,1% Triton X-100 (positive Lyse Kontrolle) führte zu einer vollständigen Zellyse angezeigt infizierte Zellen sehr geringe Zytotoxizität. In vitro-Infektion von unbehandelten Zellen mit POR1 führte zu sehr hohen Niveaus der Zelllyse, und das wurde von MAM7-co gehemmtupled Perlen aber nicht MAM1 gekoppelte oder GST-gekoppelten Kontrollkügelchen (Abbildung 3).

Abbildung 3. Charakterisierung von Vibrio parahaemolyticus induzierte Zytotoxizität in Epithelzellen während der Konkurrenz-Assays. Die Zellen wurden mit V. behandelt parahaemolyticus (Vp), angedeutet mit (+) oder keine Bakterien (-) in Gegenwart von verschiedenen konkurrierenden Einheiten (Komp.), wie angegeben. Dazu gehörten entweder keine comp. (-), MAM7 Perlen (MAM7), MAM1 Perlen (MAM1) oder GST Kontrollkügelchen (GST). Als Kontrollen wurden Zellen, die entweder mit Triton X-100 (Triton-Lyse-Kontrolle) behandelt bzw. links nicht infizierten (uninf). LDH-Freisetzung nach 4 h wurde wie in Kapitel 3 beschrieben, gemessen und die Ergebnisse zu Triton Kontrollen (100%) und Rohlinge (0%), wie oben beschrieben normalisiert. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM von Dreifachversuche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Aufzählung V. parahaemolyticus entweder unbehandelten HeLa-Zellen oder Zellen mit MAM7-, MAM1- oder GST Steuer Perlen, inkubiert befestigt gezeigt, dass MAM7-Perlen, aber nicht MAM1- oder GST-Kontrollkügelchen outcompete V. parahaemolyticus zur Befestigung Zelloberflächenrezeptoren (Figur 4) zu hosten.

Abbildung 4. Charakterisierung von bakteriellen Befestigung während der Konkurrenzexperimente. HeLa-Zellen wurden mit V. infiziert parahaemolyticus POR2 (Vp +), in Abwesenheit (-) oder in Gegenwart von konkurrierenden Einheiten wie folgt: MAM7 Kügelchen (MAM7) MAM1 Kügelchen (MAM1) oder GST Kontrollkügelchen (GST) (vgl.). Bakterielle Adhäsion wurde nach 1 Stunde gemessen, im Abschnitt 3. Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM von Dreifachversuche. Mittel (vlnr in CFU / ml) sind 2,3010 ^6, 1,5310 ^{5, 6} 2,0510, 2,1210 ^6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Adhäsine Fluorophor markierten Kügelchen gekoppelt resultieren in der Erzeugung von Materialien, die bakterielle Adhäsion imitieren an Wirtszellen und sind leistungsstarke Werkzeuge für die zelluläre Bildgebung (Abbildung 5). Verwendung MAM7 gekoppelten fluoreszierenden blauen Perlen, dadurch wir den Prozess der MAM7-vermittelte Bindung an Epithelzellen. Befestigung MAM7 an Wirtszellen in Folge Aktin Umlagerungen und die Bildung von Stressfasern, die Co-visualisiert mit Rhodamin-Phalloidin auf F-Actin (5B) Fleck waren.

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Abbildung 5. Herstellung und die Verwendung von Fluorophor zur Bildgebung markiert biomimetische Perlen. (A) Die Aussetzung der fluoreszierenden blauen biomimetische Perlen (rechts Rohr, 10x Lager) und Puffersteuerung (links Rohr). (B) Befestigung MAM7-gekoppelten Kügelchen, um Hela Zellen führt zu Aktin Umlagerungen und Stressfaserbildung. Befestigung von fluoreszierenden blauen Perlen und daraus resultierende Aktin-Stressfasern (rot, mit Rhodamin-Phalloidin gefärbt) wurden durch Mikroskopie abgebildet. Bar, 10 & mgr; m. Bilder im Feld B wurden von Lim et al. ¹ angepasst und unter der Creative Commons Attribution Lizenz reproduziert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Hier beschreiben wir zwei Protokolle, die zum Koppeln thiolhaltigen Proteine ​​verwendet werden können, um Amin- oder Carboxylat-modifizierten Polystyrolperlen sind. Wegen der Leichtigkeit der Verfahrensweise, Thiol-Amin-Kopplung bevorzugt, aber abhängig von dem gewünschten Wulst Spezifikation (Durchmesser, Fluoreszenzeigenschaften) kann die Verwendung von Amin-funktionalisierten Kügelchen nicht möglich sein, und wir haben deshalb enthalten ein Protokoll, das den Carbonsäureester umwandeln - in eine Amin-Einheit für den Forscher die größtmögliche Flexibilität bei der Wahl des Gerüsts zu geben. Obwohl beide Thiol-Amin und Thiol-carboxyl Kupplungs Arbeit für jeden Cystein Protein Richtkoppler enthält (dh die Immobilisierung des Proteins pro seinem N-Terminus, imitiert surface display) erfordert eine Protein ohne Cysteinreste, wird diese als eine GST-Fusion hergestellt Protein oder dass enthält ein Nebenstelle eingeführt einzigen terminalen Cysteinrest Mutagenese. Wenn mehrere reaktive Cysteine ​​enthalten sindinnerhalb des Proteins, wird dieser zufällige Immobilisierung der Proteinfunktion beeinträchtigen könnten führen. Viele bakterielle Adhäsine weiß Cysteine ​​enthalten, nicht natürlich. Für andere kann diese durch ortsgerichtete Mutagenese entfernt werden, obwohl dies umfangreiche Untersuchungen erfordert, um sicherzustellen, nativen Struktur und Funktion in der Mutante erhalten. GST-Fusionsproteine ​​können gereinigte GST-Tag an Kügelchen gekoppelt sind, wie eine geeignete Negativkontrolle verwendet werden. Verwendung entkoppelt Kügelchen als Kontrolle sollte vermieden werden, da diese oft eine höhere Neigung zu verklumpen oder sich an Zellen nicht-spezifisch. Eine vereinfachte Version der Protokoll 1.2., Nur mit EDC kann zu koppeln Proteinen an Carboxylgruppen funktionalisierten Polymerkügelchen verwendet werden, jedoch ist in diesem Fall Kopplung erfolgt über primäre Amine in dem Protein und garantiert deshalb nicht Richtungskopplung.

TCEP als Reduktionsmittel darf nicht mit anderen kommerziell erhältlichen und üblichen Reduktionsmitteln, wie zum Beispiel dithiothr ersetzt werdeneitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol (BME), da die in ihnen enthaltenen Thiole mit Protein-Kopplung in der Thiol-Maleimid Kopplungsschritt konkurrieren. PBS kann mit anderen Puffer ersetzt werden, aber mit den folgenden Überlegungen: Puffer möglicherweise nicht primäre Amine enthalten (so Tris-Puffer enthält, sind nicht geeignet). Verwendung von Puffern, die sehr gering (<10 mm) Salzkonzentrationen führt zu Verklumpung Auffädeln und sollten ebenfalls vermieden werden. Proteinreinheit ist auch ein wichtiger Faktor, der bei diesem Verfahren entstehen, sowie die Daten von hoher Qualität zu erreichen, sollte reine Proteine ​​verwendet werden. Wir routinemßig zu reinigen Proteine ​​in mehreren Schritten, darunter mindestens eine Affinitätsreinigung und Gelfiltrationsschritt, aber in einigen Fällen Ionenaustauschchromatographie in einem dritten Schritt erfolgt. Als Folge ist die Reinheit von Proteinen für die Kopplung verwendet wird, ist üblicherweise 90% oder höher, wie durch SDS-PAGE beurteilt.

Es wird empfohlen, Protein-Konzentrationen sowohl in der anfänglichen Reaktionsmischung sowie th bestimmene Stand nach Beendigung der Reaktion. Dies wird helfen, die scheinbare Konzentration der Kügelchen gekoppelten Proteins und damit Kopplungsdichte zu bestimmen. Bestimmung der beiden Werte ermöglicht auch die Berechnung der Kopplungseffizienz. Dies kann berücksichtigt werden, wenn die Vorbereitung der Ausgangsproteinlösung in nachfolgenden Reaktionen, um die gewünschte Endkonzentration zu erzielen, und Kupplungsdichte berücksichtigt werden. Bradford-Reagenz ist insbesondere zur Bestimmung der Proteinkonzentration geeignet vor und nach der Kupplungsreaktion, da keine der Substanzen in der Reaktions stört die Farbstoffkomplexbildung bei den verwendeten Konzentrationen. Niedrigeren Proteinkonzentrationen, die verwendet werden sollen, kann dieses Verfahren müssen durch eine empfindlichere Nachweismethode ersetzt jedoch Aufmerksamkeit ist auf die Tatsache hat es mit den in der Kopplungsreaktion enthaltenen Substanzen kompatibel sind gezahlt. Es wird auch empfohlen, um frisch zubereiteten Reagenzien zu verwenden und zu handhaben pulverförmigen Reagenzien mit Sorgfalt (zB Shopin einem verschlossenen Behälter und mit Siliciumdioxidperlen, um die Reagenzien Feuchtigkeit zeichnen), da die Qualität der Reagenzien wird die Kopplungseffizienz beeinflussen zu vermeiden. Wenn die Kopplungseffizienz geringer als erwartet ist, umfassen mögliche Abhilfen Erhöhung der anfänglichen Wulst und Proteinkonzentrationen. Falls höhere Konzentrationen verwendet werden, muss die Konzentration von Kopplungsreagenzien proportional erhöht, um eine ausreichende molaren Überschuss sicherzustellen. Ändern von Korn / Protein-Konzentrationen in der Regel eine bessere Schritt hin zu Optimierung, anstatt die Reaktionszeiten. Da die Protokolle für die Wulst Kopplung sind langwierig, wir gemeinhin bereiten eine große Charge des Materials. Aliquots der Suspension in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -20 ° C mehrere Monate gelagert werden. Aufgetauten Aliquots sollten nicht eingefroren werden und bei 4 ° C gelagert und innerhalb von 1-2 Tagen verwendet werden. Dies wird jedoch mit der Art und Stabilität der so sollte auf eine kleine Charge zunächst getestet werden verwendeten Proteins variieren.

Bead-gekoppelter Adhäsine kann für viele Anwendungen verwendet werden, wie unten diskutiert. Dieses Protokoll beschrieben einen Test, der üblicherweise verwendet wird, um die Hemmung der bakteriellen Bindung und Pathogen-vermittelten Zytotoxizität auf Wirtszellen zu messen. Der Test wird üblicherweise durchgeführt, um die Kapazität der Kügelchen gekoppelt MAMs kompetitiv inhibiert Infektion von HeLa-Epithelzellen mit dem Meeresfoodborne pathogen Vibrio parahaemolyticus zu messen, entweder mit einer Abnahme der bakteriellen Bindung an die Wirtszellen oder reduzierte Zytotoxizität als Auslese . In beiden Fällen, die Vorbereitung und kompetitive Assays nach dem gleichen Protokoll. Je nach dem Auslesen verschiedener Stämme von V. parahaemolyticus verwendet werden: die zytotoxische Stamm POR1 zur Zytotoxizität Messungen verwendet, während die nicht-zytotoxischen Stamm POR2 zum Messen der bakteriellen Adhäsion verwendet, da Zelltod und Zellablösung beeinträchtigt das Verfahren zur Quantifizierung hefteten Bakterien.

Zunächst compebewerb Experimente wurden als schrittweise Protokoll, bei dem Wirtszellen wurden zunächst mit Perlen vor der Zugabe von Bakterien präinkubiert eingestellt. Für V. parahaemolyticus und dem Wulst bestimmungsgemäßer Verwendung (2 & mgr; m-Perlen zu MAM7 gekoppelt) können beide Perlen und Bakterien zur gleichen Zeit, ohne die Änderungen in der resultierenden Zytotoxizität hinzugefügt werden. Das heißt, in diesem Versuchsaufbau, Perlen outcompete Bakterien Wirtszelle verbindlich. In Abhängigkeit von der Bakterienart und Wulstgeometrie verwendet wird, kann es gute Gründe für die Aufrechterhaltung der Wulst Adhäsion und bakterielle Infektion als zwei getrennte Stufen. Beispielsweise um Zellen mit nicht-beweglichen Bakterien zu infizieren, werden die Platten üblicherweise nach der Zugabe der Infektion Medium zentrifugiert. Jedoch sollte Zentrifugation von Platten enthaltenden Suspensionen Wulst vermieden werden, da dies zu einer sehr ungleichmäßigen Verteilung der Perlen auf die Zellschicht. Wenn kleinere Partikelgrößen verwendet werden, werden Kügelchen länger dauern, bis auf der Zelloberfläche zu regeln, in welchem ​​Fall suffizient Zeit sollte für Korn Anbringung vor der Infektion zugelassen. Wenn bakterielle Adhäsion wird als ein Auslesen verwendet wird, sollten die Proben zu den Zeitpunkten genommen werden, wo Wirtszellen nicht wesentlich von der infizierenden Stamm beschädigt, wie Zellablösung und Lyse kann die Quantifizierung der angehefteten Bakterien beeinträchtigen.

Statt Aufzählen bakterielle Adhäsion durch Verdünnungsausstrichtest können Proben alternativ zur Abbildung (Abbildung 5) verarbeitet werden. In diesem Fall sollte der Gewebekultur von Zellen auf Glasdeckgläschen ausgesät werden, anstatt direkt in die Vertiefungen. Zusätzlich können fluoreszierende Kügelchen und Bakterien ein Fluoreszenzprotein exprimieren, verwendet werden, zusammen mit einer Infektion spezifischen Wirtszellmarker. Zum Beispiel werden Kompetitionsexperimente üblicherweise unter Verwendung von fluoreszierenden roten Rhodamin-Phalloidin, die Wirtszellen "Aktin-Zytoskelett zu färben und zu bewerten morphologische Veränderungen, die sich aus der Infektion zusammen mit fluoreszierenden blauen Perlen und fluoreszierende abgebildetgrün (GFP-exprimierenden oder SYTO18 gefärbt) Bakterien.

Eine Reihe von Kügelchen gekoppelt Adhäsine, einschließlich Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD und Vibrio parahaemolyticus MAM wurden als biomimetische Materialien verwendet worden, um die Haftung, Adhäsionsinhibierung und den Beitrag der Adhäsion zu untersuchen Pathogen-vermittelten Zytotoxizität ^{1, 7, 8.} Einer der Vorteile der Verwendung dieses Ansatzes ist die einfache Visualisierung der Befestigungs Ereignisse, da die Polymerperlen als Gerüste verwendet werden, sind in einer breiten Palette von Farben (beispielsweise blau, fluoreszierend rot, blau, grün, orange). Somit direkte Markierung von Proteinen, die mit der Funktion beeinträchtigen können, vermieden werden. Weiterhin werden die Oberflächenkupplungs ahmt das mehrwertige Anzeige Adhäsine auf der bakteriellen Oberfläche reflektiert damit eine physiologisch relevante Konformation im Vergleich zu löslichen Proteinen.

Im Vergleich zu Studien mit intakten Bakterien oder bacterial-Mutanten, umgeht der Wulst Ansatz Probleme mit Bakterienwachstum verbunden. B. Langzeit (zB O / N) Studien über die bakterielle Adhäsion an Zellen mit intakten Bakterien beherbergen werden oft durch bakterielle Begleitwachstumserscheinungen gefährdet - Ansäuern des Wachstumsmediums und Nährstoffraubbau negativ auf Wirtszellen und bakteriellen Replikations letztendlich Kompromisse Abbildungsqualität.

In jüngerer Zeit ist die Verwendung von Kügelchen gekoppelt Adhäsine wurde erweitert, um ihre Verwendung als Mittel zur Affinitätsreinigungen von Wirtszellfaktoren in Signalprozesse nachgeschalteten bakteriellen Befestigung beteiligt sind. V. parahaemolyticus MAM7, über die Bindung an Phosphatidsäuren in der Membran der Wirtszelle, löst RhoA Aktivierung und Aktin Umlagerungen ^{1, 3.} MAM-gekoppelten Kügelchen verwendet werden, um zu reinigen und zu identifizieren Proteine ​​in den Signalisierungs Plattformen als Folge MAM-Wirtszelle zusammengebaut beteiligten Bindung. Seit Perlendurch einen kurzen Zentrifugationsschritt vom Überstand abgetrennt werden und das Protein von Interesse kovalent gekoppelt ist, ist dies ein gutes Verfahren, um eine Trennung von verunreinigenden Proteinen zu erreichen und zu bereichern relevanten Protein-Komplexe, die für Downstream-Anwendungen wie Proteomik oder Western verwendet werden können, Blotting.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien
Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)	Sigma	646547	Gefahr; ätzend können als Lösung oder frisch zubereitet gekauft werden
Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrat (Sulfo-SMPB)	Fisher		PN22317 Gefahr; giftig
L-Cystein	Sigma	30089	Gefahr; giftig
Latexkügelchen, aminmodifiziertes Polystyrol, fluoreszierend blau - wässrige Suspension, 2,0  μ m mittlere Partikelgröße	Sigma	L0280	schädlich; ist eine Reihe alternativer Partikelgrößen und -farben erhältlich
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)Thermo	scientific	22980
N-hydroxysuccinimid (NHS)	Thermo scientific	24500
Carboxylat-modifizierte Polystyrolkügelchen	Sigma	CLB9	schädlich; eine Reihe alternativer Partikelgrößen und -farben verfügbar
Ethylendiamin	Sigma	E26266	Gefahr; entzündlich, ätzend, giftig, sensibilisierend
Rinderserumalbumin (BSA)	Promega	W3841
Bradford-Reagenz	Sigma	B6916	Gefahr; ätzend und giftig
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium - hoher Glukosegehalt - Mit 4.500 mg/L Glukose und Natriumbicarbonat, ohne  L-Glutamin, Natriumpyruvat und Phenolrot, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkulturen	Sigma	D1145	für Infektionsexperimente
DMEM	Sigma	D6429	für die Konservierung von kultivierten Wirtszellen
Fötales Rinderserum, hitzeinaktiviertes	Sigma	F9665	Supplement für Gewebekulturmedium
Penicillin-Streptomycin - Lösung stabilisiert, mit 10.000 Einheiten Penicillin und 10  mg Streptomycin/ml, steril filtriert, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen	Sigma	F9665	Ergänzung für Gewebekulturmedium
PBS	Sigma	D8537
LDH Zytotoxizitätsnachweiskit	Takara	MK401
Reagenzreservoire aus
	Greiner	66160
96-Well-Platten	Greiner	655182
Equipment Hämozytometer
Mikrozentrifugen-Plattenleser
,
Gewebekulturanlagen
Mehrkanal-Pipette