Dieser Artikel stellt zwei Protokolle vor: eines, um anaerobe Bakterien zu messen, die erfolgreich in den Wirt eindringen und darin überleben können, und das andere, um anaerobe Bakterien zu visualisieren, die mit Wirtszellen interagieren. Diese Studie kann auf jede kultivierbare anaerobe und jeden eukaryotischen Zelltyp angewendet werden.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Anaerobe Bakterien weit zahlenmäßig überlegen Aerobier in vielen menschlichen Nischen wie dem Darm, Mund und Vagina. Darüber hinaus sind anaerobe Infektionen häufig und oft indigener Herkunft. Die Fähigkeit einiger anaerobe Erreger an menschliche Zellen einzudringen gibt ihnen adaptive Maßnahmen zur angeborenen Immunität zu entfliehen sowie Wirtszelle Verhalten zu modulieren. Jedoch sicherzustellen, dass die anaeroben Bakterien sind im experimentellen Untersuchung der Ereignisse kann Herausforderungen mit sich bringen zu Hause sind. Porphyromonas gingivalis, ein Gram-negative anaerobe, ist in der Lage eine Vielzahl von eindringenden eukaryotischen Nicht-Fresszellen. Dieser Artikel beschreibt, wie man erfolgreich Kultur und Beurteilung der Fähigkeit von P. gingivalis die menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) einzudringen. Zwei Protokolle wurden entwickelt: ein, um Bakterien, die erfolgreich eindringen kann und zu überleben, in dem Wirt, und der andere, um Bakterien Interaktion mit Wirtszellen sichtbar zu messen. Diese Techniken erfordern die Verwendung eines anaeRobic Kammer P. liefern gingivalis mit einer anaeroben Umgebung für ein optimales Wachstum.
Das erste Protokoll ist auf der antibiotischen Schutz-Assay, die weitgehend verwendet wird, um die Invasion von Wirtszellen, die durch Bakterien Studie. Jedoch ist die Antibiotikum-Schutzassay beschränkt; nur intrazelluläre Bakterien, die nach Behandlung mit Antibiotika und Host-Zell-Lyse kultivierbar sind, werden gemessen. Um alle Bakterien, die Interaktion mit Wirtszellen, sowohl lebenden und toten beurteilen wir ein Protokoll, das Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet, um Wirt-Pathogen-Interaktion untersuchen entwickelt. Bakterien fluoreszent mit 2 'bezeichnet, 7'-Bis- (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein-acetoxymethylester (BCECF-AM) und verwendet, um eukaryotische Zellen unter anaeroben Bedingungen zu infizieren. Folgende Fixierung mit Paraformaldehyd und Permeabilisierung mit 0,2% Triton X-100, werden Wirtszellen mit TRITC-Phalloidin und DAPI markiert, um den Zellkern und Cytoskelett beschriften sind. Mehrere images zu verschiedenen Schwerpunkten (Z-Stack) getroffen werden für zeitlich-räumliche Visualisierung von Bakterien erhalten. Verfahren in dieser Studie verwendet wird, kann auf jede kultivierbare anaerobe und jegliche eukaryotische Zelltyp angewendet werden.
Einleitung
Anaerobe Bakterien besiedeln fast alle Oberflächen des menschlichen Körpers. Obwohl überwiegend in der Flora des Darm und Urogenitaltrakts, wo Sauerstoffkonzentrationen sind niedrig, es gibt sie auch in hohen Konzentrationen auf der Haut, Mund, Nase und Rachen 1. Anaerobe Bakterien sind eine häufige Ursache von endogenen Infektionen und werden häufig von erkrankten Stellen isoliert. Jedoch aufgrund ihrer Natur anspruchsvolle Anaerobier können schwierig zu isolieren und Kultur. Studien mit anaeroben Bakterien sind unter eingeschränkten Bedingungen durchgeführt werden. Moderne anaeroben Kulturtechniken es den Forschern ermöglichen, um die anaerobe Einstellun....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Die folgenden Protokolle werden Methoden für die Kultivierung und Untersuchung der Invasion durch die anaerobe Arten, P. beschreiben gingivalis; jedoch können diese Protokolle für eine Reihe von anaeroben Pathogene verwendet werden. Obwohl HUVECs verwendet werden, kann dieses Protokoll für andere eukaryontische Zellen sowohl immune und nicht-immune verwendet werden.
1. anaeroben Kammer Betrieb und Wartung
Hinweis: P. gingivalis ist eine anaerobe empfindlich auf ein normales Niveau von Sauerstoff in der Luft auftreten. Eine kontrollierte anaerobe Umgebung ist für die Kultivierung von
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Protokolle oben umrissen wurden bei der Untersuchung Wirt-Pathogen-Interaktion zwischen P. verwendet gingivalis und Endothelzellen. P. gingivalis W83 und P. gingivalis V3150, welches eine Deletion des PG0228 wurden in der Studie verwendet. Das PG0228 vorhergesagt wird, ein Protein, das die Pegel der RNA und Proteinen verändern können, was sich letztlich auf eine Wechselwirkung von P. kodieren gingivalis mit Wirtszellen. Um die Wirkung der PG0228 auf P. unter.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Alle oben genannten Verfahren können verwendet werden, um spezifische Assays, um die Wechselwirkung von anaeroben Bakterien mit eukaryotischen Zellen beurteilen zu entwerfen. Jedoch gibt es einige Überlegungen, die Versuche erfolgreich durchzuführen. Zuerst gibt es die Mikrobenstämme in einer Studie verwendet werden.
Es ist von entscheidender Bedeutung bei dem Vergleich von zwei Stämmen sowohl mit dem Überlebens-Assay sowie durch Mikroskopie-Analyse, daß sie sich in einer ähnlichen Wachstums.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir möchten uns bei Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui und Collin R. Berry bedanken. Diese Arbeit wurde durch NIH-NIDCR-Zuschüsse R01DE016124, R01DE018039 und R01DE023304 an J.P. Lewis unterstützt.
Die Mikroskopie wurde an der VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility durchgeführt und teilweise mit Mitteln aus dem NIH-NINDS Center Core Grant (5P30NS047463) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anaerobe Vinylkammer-Typ B | Coy Laborprodukte | Modell 2000 Inkubator | |
| TSA II Trypticase Soja-Agar mit 5 % Schafsblut | BBL | 221261 | |
| menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen 10-Spender-Pool | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF Medium Komplettset | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponin | Riedel-de Haen | 16109 | |
| Gentamicinsulfat Salz | Sigma-Aldrich | G-1264 | |
| Metronidazol | Sigma-Aldrich | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 mm Runddeckgläser | Elektronenmikroskopie Sciences | 72222-01 | |
| VectaShield Eindeckmedium mit DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
Referenzen
- Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
- Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
- Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
