Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

Zusammenfassung

Die Fähigkeit zu migrieren ist eine Schlüsselfunktion vieler verschiedener Zelltypen, einschließlich mesenchymaler Stromazellen (MSCs). Die Quantifizierung von Veränderungen der Migrationskapazität nach Schäden ist jedoch eine Herausforderung. Dieses Protokoll beschreibt einen leicht anpassbaren Migrationsassay, der strenge Statistiken verwendet, um Veränderungen der MSC-Migrationskapazität nach einer Schädigung zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Die Zellmigration ist für viele physiologische und pathologische Prozesse wie Gewebeentwicklung, -reparatur und -regeneration, Krebsmetastasierung und Entzündungsreaktionen von entscheidender Bedeutung. Angesichts des aktuellen Interesses an der Rolle mesenchymaler Stromazellen bei der Vermittlung der Gewebereparatur sind wir daran interessiert, die Migrationskapazität dieser Zellen zu quantifizieren und zu verstehen, wie sich die Migrationskapazität nach einer Schädigung verändern kann. Die Optimierung eines streng quantitativen Migrationsassays, der sowohl einfach anzupassen als auch kostengünstig durchzuführen ist, ist der Schlüssel zur Beantwortung von Fragen zu Veränderungen der Zellmigration als Reaktion auf verschiedene Stimuli. Aktuelle Methoden zur Quantifizierung der Zellmigration, einschließlich Scratch-Assays, Trans-Well-Migrationsassays (Boyden-Kammern), Mikrosäulen-Arrays und Zellausschlusszonen-Assays, weisen eine Reihe von Einschränkungen in Bezug auf Reproduzierbarkeit, Anpassbarkeit, Quantifizierung und Kosteneffizienz auf. Trotz seiner prominenten Verwendung wird der Scratch-Assay durch Probleme mit der Reproduzierbarkeit im Zusammenhang mit der Schädigung der Zellmikroumgebung, Hindernissen für die Zellmigration, dem Einfluss benachbarter seneszierender Zellen und der Zellproliferation sowie durch das Fehlen einer rigorosen Quantifizierung verwirrt. Der hier beschriebene optimierte Scratch-Assay zeigt robuste Ergebnisse, quantifizierbare und bildbasierte Analysemöglichkeiten, Kosteneffizienz und Anpassungsfähigkeit an andere Anwendungen.

Einleitung

Zellmigration ist hoch koordinierter und entscheidend für viele physiologische Prozesse, wie beispielsweise der Gewebeentwicklung, Reparatur und Regeneration sowie pathologischen Prozessen wie Krebsmetastasen und Arteriosklerose ^1. Ein Verständnis der Zellmigration ist besonders relevant für Emerging Therapien eingesetzt, um beschädigte Gewebe zu reparieren und zu behandeln pathologischen Zuständen, einschließlich Zelltransplantation Technologien und künstliche Gewebe Pfropfen ^2. Angesichts der gegenwärtigen Interesse an der Rolle von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) bei der Vermittlung der Reparatur von Gewebe ^3, Quantifizierung der Migrationsfähigkeit dieser Zellen unter Verwendung eines Assays, die streng quantifizierbare, anpassungsfähig und kosteneffektiv ist von Interesse ist. Wichtig ist, dass ein solcher Test, relativ geringfügige Änderungen in der zellulären Migrationsfähigkeit nach Beschädigung ausreichend empfindlich sein. Aktuelle Methoden zur Quantifizierung der Zellmigration, einschließlich Grund auf Assays, trans-und Migrationsassays (Boyden chBernsteine), micropillar Arrays und Zellsperrzone Assays besitzen eine Reihe von Einschränkungen in der Reproduzierbarkeit, Anpassbarkeit, Quantifizierung und ^{Kosten-Nutzen-1,4,5.} Die hier beschriebene optimierte Kratz Test zeigt robuste Ergebnisse, quantifizierbar und bildbasierten Analysemöglichkeiten, Wirtschaftlichkeit und Anpassungsfähigkeit an andere Anwendungen.

Scratch-Assays sind in mehreren Kapazitäten verwendet worden, um die Zellmigration und Proliferation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ⁵ zu beurteilen. Der Test beinhaltet Aussäen der bezeichneten Zellen, wächst sie in oder in der Nähe Zusammenfluss abgeschlossen ist, und ein Verkratzen der resultierenden Monoschicht mit einer sterilen Nadel oder Pipettenspitze ^6. Analyse wird am häufigsten durch Vergleichen der Breite des Kratzers über mehrere Zeitpunkte an zufällig ausgewählten Stellen ^7-9 durchgeführt. Trotz seiner prominenten Gebrauch wird der Kratztest durch Probleme mit der Reproduzierbarkeit und Quantifizierung verwechselt. VariabilitätGeneration des Scratch nicht verändert nur die Mikroumgebung der Zellen, sondern kann auch die Zellmigration zu verhindern, indem die Plattenoberfläche und die zugrunde liegenden extrazellulären Matrix ⁵ zu beschädigen. Assays werden häufig mehr als 7 bis 12 h durchgeführt, jedoch für die Zelllinien Anzeige langsamer Migration und längere Testzeiten wird die Proliferation eine verwirrende Variable ^7,10. Schließlich kann seneszenten Zellen durch den Ritzvorgang erzeugten Faktoren, die mit der extrazellulären Signalisierung benötigt, um die Lücke in der Monoschicht ¹ schließen stören zugeben. Optimierung des Kratztest erfordert die Schaffung eines konsistenten Lücke, die nicht mit Oberflächeneigenschaften nicht beeinträchtigt, die Minimierung Assay Zeitlänge und verhindert unerwünschten Zelltod während der Manipulation. Der Anschlag basierenden Assay ist eine Optimierung der Zellausschlusszone Assay. Dieses Assay wendet einen Anschlag in der Mitte der Vertiefung, die das Zellwachstum schließt platziert, aber erlaubt den Zellen, um den zentralen Sperrzone plattiert werden.Um die Migration zu bewerten, wird der Anschlag entfernt und der sich ergebende Sperrzone stellt eine Oberfläche zur Migration auftritt. Allerdings ist dieser Test schwierig gestalten oder anzupassen ¹⁰ und für einige Anwendungen kann diese Technik auch zu kostspielig.

Im Gegensatz zu Kratzassays und deren Derivaten, trans-well Migrationsassays (oder Boyden-Kammer-Assays) beurteilt Migration durch Quantifizieren der Anzahl von Zellen, die von einer Kammer zu bewegen, durch eine mikroporöse Filtermembran, in eine Kammer, die chemotaktische Mittel ^{8,11, 12.} Diese Technik hat einen Nutzen für adhärente Zellen, wie MSCs begrenzt, da nach der Migration durch die poröse Membran, Zellen haften an der Membranseite auf die chemotaktische Mittel ausgesetzt wird, und kann schwer genau zu quantifizieren. Während der Test ist in der Lage, einige dreidimensionale Migrationsmuster zu untersuchen, die eingeschränkten Zelltypen, für die sie in der Lage, genau zu quantifizieren Zellmigrationsgrenzwert seine Nützlichkeit ist ¹⁰. Eine weitere Alternative zur Kratzassays verwendet einen Mikrosäulenarray, das zelluläre Motilität durch einen dreidimensionalen Raum misst unter Verwendung der Fähigkeit der Zellen, sich zu verformen und die Migration in das Array als Surrogat. Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomeren über einen präzisen Form gehärtet und mit Ozon behandelt und Fibronektin erzeugt ein homogenes und nicht-abbaubare Mikroumgebung. Mikrosäulenabstand kann bei Bedarf auch um die Fähigkeit der Zellen, um das Array ⁴ geben abzuschätzen variiert werden. Die Form wird durch tiefe reaktive Ionen-Ätzung von Siliziumwafern geschaffen, um eine negative Version des hohen Aspektverhältnisses ^Array 13 zu schaffen. Während der Assay wird durch seine Anpassbarkeit verstärkt, um die Fähigkeit dreidimensionalen Migration, und die Analyse durch die direkte Visualisierung von wandernden Zellen zu modellieren, die Schwierigkeit bei der Schaffung von Mikrosäulenanordnungen wirtschaftlich behindert ihre weitverbreitete Verwendung.

Die in diesem Protokoll beschriebenen optimierte Kratz Assay stellt ein effizientes, cost günstiges Verfahren zum Erzeugen konsistenter Kratzer, die durch frei verfügbaren Software analysiert werden können. Statt einfacher Breite Messungen über die Kratz vor und nach der Zellmigration hergestellt, ermöglicht die Software dem Anwender insgesamt kratz Bereiche vor und nach der Migration zu ermitteln. Dieser Fortschritt schränkt das Problem zu versuchen, festzustellen, wo die Kratz die Breitenmessungen sollten getroffen werden, und ob die Breite des Kratz einheitlich entlang ihrer Gesamtlänge. Außerdem ist eine sorgfältige Optimierung der Zellzahlen, die Zellkonfluenz und der Art und dem Grad der Beschädigung an den Zellen zugefügt, um eine weitere Optimierung der Assay erörtert.

Protokoll

Hinweis: Für diese Studie Lungen mesenchymale Stromazellen (LR-MSCs) vom distalen Lungengewebe isoliert wurden entweder auf der Grundlage ihrer Expression von Zelloberflächenmarker (CD45 ^neg, CD31 ^neg, Sca-1 ^hoch, EpCAM ^{neg) 14,15,} mit Explantation out-Wachstum ^16, oder unter Verwendung von enzymatischen Abbau ^17. Haft LR-MSCs wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt und kein Glutamin, 15% FBS, 1x Antibiotikum / Antimykotikum, und 2 mM Glutamin (nachstehend vollständige Medien) und bei 37 ° C, 5% _CO 2 inkubiert. LR-MSCs wurden 3-4 mal passagiert, um eine Population von Zellen mit relativ homogenen Wachstumseigenschaften für den Migrationstest sicherzustellen.

1. Vorbereiten einer konfluenten Monolayer

1. Um MSCs von Standard-100 mm Kulturschalen zu lösen, waschen Sie die Zellen mit 10 ml 37 ° C vorgewärmten PBS, saugen Sie den PBS und fügen Sie 4 ml Trypsin (0,25%). Inkubieren 3-5 min in einem 37 ° C Inkubator. Saugen Sie das cells in eine konische Röhre fügen gleichen Volumen von komplettem Medium und Zentrifugation bei 300 g für 5 Minuten, um die Zellen zu pelletieren gelassen.
   Hinweis: Längere Inkubation in Trypsin kann die Zelloberflächenrezeptoren verändern und möglicherweise beeinflussen Migration.
2. Saugen Sie Medien und resuspendieren Zellen in frischem Vollmedium. Zählen von Zellen, ohne toten Zellen mit Trypanblau-Ausschluss und Platte 500.000 mesenchymalen Stromazellen in 4 ml komplettem Medium auf einer 60 mm Zellkulturschale.
   Anmerkung: Abhängig von der Quelle der Zellen, können die Tests erforderlich sein, um die optimale Anzahl der benötigten Zellen zu bestimmen.
3. Inkubieren Zellen bis Platten sind 90% konfluent für eine optimale Zellhaftung und Proliferation, in der Regel 48 bis 72 Stunden für MSCs.
   Hinweis: 100% Zusammenfluss ist nicht zu empfehlen, da viele verankerungsabhängigen Zellen Erfahrung Kontakthemmung, die ihre Migrationsfähigkeit verändern können. Platten mit weniger als 80% Konfluenz in unbrauchbare Fotos führen, da der Bildanalyse-Software wird Spalt interpretierens zwischen den Zellen als Teil des Umfangs des Kratzers (siehe Figur 1D).
4. Nachdem die Zellen 90% Konfluenz erreicht, schädigen die Zellen gegebenenfalls für die Anwendung. Um Zellschäden nach Einwirkung von löslichen Zigarettenrauch Extrakt (CSE) zu bewerten, zu erzeugen, 100% CSE durch Ziehen der Rauch von 1 University of Kentucky Forschungs Zigarette (3R4F) über 25 ml Komplettmedium in einer Saugflasche mehr als 2 min ^18.
5. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h in 4 ml 1-4% CSE in komplettem Medium verdünnt. Nach der Inkubation, waschen Sie die Zellen zweimal mit 4 ml warmem sterilem PBS, bevor Sie mit 4 ml frisches Vollmedium.
   Hinweis: schädlichen Zellen mit hohen Konzentrationen von Zigarettenrauch-Extrakt (> 5%) kann Fluss wesentlich zu verringern.

2. Erstellen der Scratch

1. In einer sterilen Umgebung, nehmen Sie den Deckel von der 60-mm-Platte von beschädigten MSCs und legte eine gerade Kante (zum Beispiel eine sterilisierte Kunststofflineal) across der obere Rand der Platte. , Ohne dass die Medien, eine sterile 200 ul Pipettenspitze von der sterilen Lineal geführt, um 03.59 Uhr parallel Kratzer über die Platte ca. 5 mm voneinander entfernten und 50 mm Länge zu machen.
   Hinweis: Eine gerade Kante der Betrag der Dreh Anpassungen an der Platte benötigt wird, wenn es auf dem Mikroskoptisch minimiert. Es ist zwingend notwendig, dass die Kratzer vollständig vertikal (oder horizontal) auf dem Bildschirm angezeigt. Erzeugen mehrerer Kratzer auf einer 60 mm Platte nicht die Mikroumgebung in einer Weise, die die Zellmigration (Daten nicht dargestellt) beeinflusst zu verändern, kann jedoch eine Überlegung für andere Zelltypen sein. Die Verwendung kleinerer Vertiefungen wird nicht empfohlen, da die Variabilität der wachsenden Zellen dicht an der Kante des Bohrlochs wird ausgeprägter und kann einheitlich Erzeugung von Kratzern zu beeinflussen.
2. Saugen Sie die Medien und vorsichtig waschen die Platten mit 2 ml vorgewärmten komplette Medien um Zellen aus dem Zentrum von dem Kratzer anhaftet und zu Zelle zu entfernens, die durch das Kratzen gelockert wurden. Ersetzen durch 4 ml frisches Vollmedium.
3. Mit einem sterilen Permanentmarker kennzeichnen jeden Kratzer 1-4 auf der Unterseite der Platte an der Stelle, die nicht mit der Abbildung der Kratzer stören.
   Anmerkung: Es ist wichtig, dass die Bilder von dem gleichen Grund auf, verglichen vor und nach der Migration, da kann eine Variation in der Kratzbreite sein.

3. Unter Erste Bilder des Scratch

Anmerkung: Falls die Scratch Test beruht auf mehreren Platten durchgeführt, ist es empfehlenswert, dass die ersten Bilder aller Kratzer auf einer einzigen Platte ergriffen werden, bevor Kratzer auf der nächsten Platte hergestellt.

1. Verwenden eines invertierten Phasenkontrastmikroskops mit einer Kamera, die Bilder für die Analyse benötigt generieren.
2. Positionieren Sie die Kulturplatte auf dem Mikroskop, und verwenden Sie die Low-Power-Objektiv (10x) zu lokalisieren kratz # 1. Wenn sich Kondensation auf dem Deckel des Kulturplatte behindert eine klare image der Zellen, mit einem beheizten Bühnen auf 37 ° C.
3. Keeping the scratch vollständig horizontalen und in der Mitte des Sichtfeldes, erhalten so viele Bilder wie nötig, um 90% der Länge der Kratzer zu umfassen. Erhalten von Bildern von verschiedenen Abschnitten der Kratzer mit keiner Überlappung zwischen den Bildern.
   Anmerkung: Die Lichtbrechung an den Rändern des Kulturschale überbelichtet die Bilder, so dass sie nicht analysiert werden. Daher keine Bilder nehmen Sie aus dem ersten und letzten 5% der Länge der Kratzer ist.
4. Bilder von jedem Kratzer Speichern in einem separaten Ordner.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4 für Kratzer 2, 3, und 4.
6. Return-Platten in den Inkubator unmittelbar nach der anfänglichen Bildgebung. Lassen Zellen wandern für 4-7 Std.
   Hinweis: 7 h ist optimal, wenn die Beurteilung MSCs mit CSE beschädigt. Inkubation von Zellen, die für mehr als 7 Stunden wird nicht empfohlen, weil die Zellproliferation als verwirrende Variable für die Zellmigration handeln (siehe Optional Anmerkung 8.2 unten).

4. Analysieren Initial Scratch Bilder

1. Laden Sie ImageJ und die Wundheilung Werkzeug-Plugin installieren (siehe die Tabelle der Materialien / Ausrüstung).
2. Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ, klicken Sie dann auf "Process" und "Konturen finden", um die Zellen rund um den Grund auf für die Wundheilung Tool, um die Kratzfläche (2B) berechnen zu markieren. Klicken Sie dann auf "Bild", "Anpassen", "Color Threshold" und im Dropdown-Menü mit "Threshold Color" den Wert ändern "B & W".
3. Im Menü "Farbschwelle", stellen die beiden Helligkeitsschwelle bewegen, bis die optimale Kontrast zwischen dem Kratzer und Zellfront erreicht wird. Um sich für die größte Reichweite bei dem Versuch, Kontrast im Bild zu erstellen, bewegen Sie den unteren Schieberegler ganz nach rechts (komplett schwarzes Bild), und stellen Sie dann den oberen Schieberegler, um maximalen Kontrast erzeugen kann.
4. Langsam stellen Sie den oberen brightness Schieberegler von links nach rechts, bis das Bild sauber zeigt die Kontur des Kratz (2C). Sobald die Kanten der Kratz identifiziert worden sind, klicken Sie auf "Weitere Optionen" in der ImageJ-Toolbar, wählen "MRI_Wound_Healing_Tool" im Dropdown-Menü, und drücken Sie die Taste "M" (das wird in der ImageJ Symbolleiste angezeigt werden), um den Entwurfsbereich markieren und gibt die berechnete Fläche in einem Ergebnisse Pop-Out-Fenster (2D).
5. Kopieren Sie alle Nummern aus dem Ergebnisfenster (2E) in einer Excel-Tabelle. Achten Sie darauf, Daten einzelner Kratzer zu trennen.

5. Unter Schlussbilder des Scratch

1. Nachdem die Zellen migriert (4-7 h), wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4. Bild die Platten in der gleichen Reihenfolge, wie sie zerkratzt wurden, so dass die Zellen auf jeder Platte haben gleich viel Zeit für die Migration hatte.
   Anmerkung: Die Zellen können zu mehreren Zeitpunkten abgebildet werden, abhängig von ihrer Sensivität sowohl Temperatur und pH-Änderungen. Alternativ können Live Cell Imaging verwendet, um die Zellen zu folgen in Echtzeit, wie sie zu migrieren.

6. Analysieren von Final Scratch Bilder

1. Wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,5 für Final Scratch Bilder.

7. Berechnung des Scratch Bereich zur Migrations Quantifizieren

1. Berechnen Sie den Mittelwert vor der Migration Bereich durch Mittelung der Anfangsbereich Werte der jeweiligen Kratzer.
2. Berechnen die Gesamtmenge der Migration durch Subtrahieren der endgültigen Migrationsbereich für jedes Bild, die in Schritt 6 berechnet aus dem Durchschnitt vor der Migration Bereich (Schritt 7.1). Erstellen Sie eine Liste von Werten für jeden Kratzer, die die Veränderung der Migration.
3. Bündeln die Daten aus mehreren Kratzer innerhalb des gleichen Testgruppe (dh alle Platten und alle Kratzer auf Zellen auf 0% CSE ausgesetzt ist). Verwenden Sie eine Varianzanalyse-Test, um die Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen zu analysieren.
4. Wenn die Zellen langsam migrierenund eine längere Inkubationszeit nach dem Kratzen (größer als 10-12 Stunden), führen eine BrDU oder EdU Inkorporationstest ¹⁹ zu bestimmen, ob Zellen zuvor irgendeine Proliferation während des Zeitraums, in dem der Migrationstest auftritt. Wählen Sie einen Migrationstest Zeit zu erheblichen Zellproliferation zu vermeiden.

8. Optional

1. Zu beurteilen, ob eine signifikante Zellalterung infolge des Kratzverfahren auftritt, führen Sie einen Seneszenz-assoziierte & beta; -Galactosidase-Assay auf einer Testplatte zu vorbestimmten Zeiten nach dem Kratzen ^19.

Ergebnisse

Die Scratch-Assays hier präsentierten Objekte wurden durchgeführt unter Verwendung von Mäuselunge Wohnsitz mesenchymale Stromazellen (LR-MSCs) und isoliert, wie in den Protokollnotizen verwiesen. Die LR-MSCs wurden in einer Dichte von 500.000 Zellen in einer 60 mm-Gewebekulturschale ausgesät und bis 90% Konfluenz in 48 h gezüchtet. Um Schäden zu generieren, wurde 4% CSE (oben beschrieben) mit den Zellen 24 h nach der ersten Aussaat Periode, aber vor dem Kratzer Assay inkubiert. Für jeden Test wurde die Kratz mit einer 2...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine quantitativ stabile, standardisierte Verfahren durchzuführen und zu analysieren Kratztests. Einfache kratz Tests werden routinemäßig in vielen verschiedenen Bereichen der Studie verwendet werden, um Zellmigration zu untersuchen. Jedoch traditionell die Scratch-Test hat ein standardisiertes Set-up und Quantifizierung Protokoll, das auf Fragen im Zusammenhang mit der Reproduzierbarkeit ^7,10 geführt hat gefehlt. Viele der Änderungen und Optimierungen zur Verbesserung d...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM (hoher Glukosegehalt, ohne Zusatz von Glutamin)	Life Technologies	31053-036
Fötales Rinderserum, Thermo Scientific HyClone	Fisher	Scientific SH3091002
Antibiotikum/Antimykotikum, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SV3007901
Glutamin, 200 mM, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3003401
TypLE Zelldissoziationsreagenz	Life Technologies	12563-01
Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, Thermo Scientific HyClone	Fisher Scientific	SH3002802
Falcon Standard 60 mm Gewebekulturschalen	Fisher Scientific	08-772B
Fisherbrand Steril 200 μ l Pipettenspitzen	Fisher Scientific	02-707-502
Inverses Lichtmikroskop mit Kameraaufsatz	Variable
ImageJ Software	http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healing plugin	http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Statistische Analysesoftware	Microsoft Excel