Methodenartikel

Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

DOI:

10.3791/53414

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3. Dezember 2015

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1Department of Biology, College of the Holy Cross

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Fähigkeit zu migrieren ist eine Schlüsselfunktion vieler verschiedener Zelltypen, einschließlich mesenchymaler Stromazellen (MSCs). Die Quantifizierung von Veränderungen der Migrationskapazität nach Schäden ist jedoch eine Herausforderung. Dieses Protokoll beschreibt einen leicht anpassbaren Migrationsassay, der strenge Statistiken verwendet, um Veränderungen der MSC-Migrationskapazität nach einer Schädigung zu quantifizieren.

Zusammenfassung

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Die Zellmigration ist für viele physiologische und pathologische Prozesse wie Gewebeentwicklung, -reparatur und -regeneration, Krebsmetastasierung und Entzündungsreaktionen von entscheidender Bedeutung. Angesichts des aktuellen Interesses an der Rolle mesenchymaler Stromazellen bei der Vermittlung der Gewebereparatur sind wir daran interessiert, die Migrationskapazität dieser Zellen zu quantifizieren und zu verstehen, wie sich die Migrationskapazität nach einer Schädigung verändern kann. Die Optimierung eines streng quantitativen Migrationsassays, der sowohl einfach anzupassen als auch kostengünstig durchzuführen ist, ist der Schlüssel zur Beantwortung von Fragen zu Veränderungen der Zellmigration als Reaktion auf verschiedene Stimuli. Aktuelle Methoden zur Quantifizierung der Zellmigration, einschließlich Scratch-Assays, Trans-Well-Migrationsassays (Boyden-Kammern), Mikrosäulen-Arrays und Zellausschlusszonen-Assays, weisen eine Reihe von Einschränkungen in Bezug auf Reproduzierbarkeit, Anpassbarkeit, Quantifizierung und Kosteneffizienz auf. Trotz seiner prominenten Verwendung wird der Scratch-Assay durch Probleme mit der Reproduzierbarkeit im Zusammenhang mit der Schädigung der Zellmikroumgebung, Hindernissen für die Zellmigration, dem Einfluss benachbarter seneszierender Zellen und der Zellproliferation sowie durch das Fehlen einer rigorosen Quantifizierung verwirrt. Der hier beschriebene optimierte Scratch-Assay zeigt robuste Ergebnisse, quantifizierbare und bildbasierte Analysemöglichkeiten, Kosteneffizienz und Anpassungsfähigkeit an andere Anwendungen.

Einleitung

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Zellmigration ist hoch koordinierter und entscheidend für viele physiologische Prozesse, wie beispielsweise der Gewebeentwicklung, Reparatur und Regeneration sowie pathologischen Prozessen wie Krebsmetastasen und Arteriosklerose 1. Ein Verständnis der Zellmigration ist besonders relevant für Emerging Therapien eingesetzt, um beschädigte Gewebe zu reparieren und zu behandeln pathologischen Zuständen, einschließlich Zelltransplantation Technologien und künstliche Gewebe Pfropfen 2. Angesichts der gegenwärtigen Interesse an der Rolle von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) bei der Vermittlung der Reparatur von Gewebe 3, Quantifizierung der....

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Protokoll

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Hinweis: Für diese Studie Lungen mesenchymale Stromazellen (LR-MSCs) vom distalen Lungengewebe isoliert wurden entweder auf der Grundlage ihrer Expression von Zelloberflächenmarker (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1 hoch, EpCAM neg) 14,15, mit Explantation out-Wachstum 16, oder unter Verwendung von enzymatischen Abbau 17. Haft LR-MSCs wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt und kein Glutamin, 15% FBS, 1x Antibiotikum / Antimykotikum, und 2 mM Glutamin (nachstehend vollständige Medien) und bei 37 ° C, 5% CO 2 inkubiert. LR-MSCs wurden 3-4 mal passagiert, um eine Population von Zellen mit relativ homog....

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Ergebnisse

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Die Scratch-Assays hier präsentierten Objekte wurden durchgeführt unter Verwendung von Mäuselunge Wohnsitz mesenchymale Stromazellen (LR-MSCs) und isoliert, wie in den Protokollnotizen verwiesen. Die LR-MSCs wurden in einer Dichte von 500.000 Zellen in einer 60 mm-Gewebekulturschale ausgesät und bis 90% Konfluenz in 48 h gezüchtet. Um Schäden zu generieren, wurde 4% CSE (oben beschrieben) mit den Zellen 24 h nach der ersten Aussaat Periode, aber vor dem Kratzer Assay inkubiert. Für jeden Test wurde die Kratz mit einer 2.......

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Diskussion

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Das hier beschriebene Protokoll bietet eine quantitativ stabile, standardisierte Verfahren durchzuführen und zu analysieren Kratztests. Einfache kratz Tests werden routinemäßig in vielen verschiedenen Bereichen der Studie verwendet werden, um Zellmigration zu untersuchen. Jedoch traditionell die Scratch-Test hat ein standardisiertes Set-up und Quantifizierung Protokoll, das auf Fragen im Zusammenhang mit der Reproduzierbarkeit 7,10 geführt hat gefehlt. Viele der Änderungen und Optimierungen zur Verbesserung d.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Wir danken den anderen Mitgliedern des Labors für ihre technische Unterstützung bei der Entwicklung des CSE-Schadensassays und ihre Unterstützung und Beratung während der Entwicklung dieses Assays. Darüber hinaus danken wir dem Holy Cross Fenwick Scholar Committee für die Unterstützung von Nicholas Cormier und dem Holy Cross College Honors Program für die Unterstützung von Alexander Yeo.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM (hoher Glukosegehalt, ohne Zusatz von Glutamin)Life Technologies31053-036
Fötales Rinderserum, Thermo Scientific HyCloneFisherScientific SH3091002
Antibiotikum/Antimykotikum, Thermo Scientific HyClone Fisher ScientificSV3007901
Glutamin, 200 mM, Thermo Scientific HyCloneFisher ScientificSH3003401
TypLE ZelldissoziationsreagenzLife Technologies12563-01
Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, Thermo Scientific HyClone Fisher ScientificSH3002802
Falcon Standard 60 mm GewebekulturschalenFisher Scientific08-772B
Fisherbrand Steril 200 μ l PipettenspitzenFisher Scientific02-707-502
Inverses Lichtmikroskop mit KameraaufsatzVariable
ImageJ Software http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healing pluginhttp://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Statistische AnalysesoftwareMicrosoft Excel

Referenzen

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  1. Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
  2. Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al.

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Schlagwörter

Mesenchymale StromazellenImageJ Analysemurine Lungen MSCsKonfluenzoptimierungquantitative MigrationMessung der Scratch Fl cheregenerative Lungenbiologie

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