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Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

DOI:

10.3791/53417

⸱

February 25th, 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

In This Article

Summary

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Hier skizzieren wir, wie man die mitochondriale Lokalisation einer (Zellzyklus-)Kinase untersucht und wie man ihre submitochondriale Position sowie potenzielle mitochondriale Substrate/Ziele bestimmt. Die erzwungene Expression von Proteinen in die Mitochondrien stellt ein nützliches Werkzeug dar, um die funktionellen Konsequenzen der mitochondrialen Lokalisierung eines Proteins von Interesse zu untersuchen.

Abstract

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Obwohl Mitochondrien ihre eigene Transkriptionsmaschinerie besitzen, wird nur 1% der mitochondrialen Proteine innerhalb der Organelle synthetisiert. Die nukleär kodierten Proteine werden in die Mitochondrien transportiert, die von ihren Mitochondrien-Targeting-Sequenzen (MTS) geleitet werden. Einem Großteil der mitochondrialen lokalisierten Proteine fehlt jedoch ein identifizierbares MTS. Nichtsdestotrotz stellt die Tatsache, dass MTS Proteine anweisen kann, in die Mitochondrien zu gelangen, ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der mitochondrialen Funktionen von normalerweise nuklearen und/oder zytoplasmatischen Proteinen dar. Wir haben kürzlich den Zellzykluskinase CyclinB1/Cdk1-Komplex in den Mitochondrien identifiziert. Um die mitochondrialen Funktionen dieses Komplexes spezifisch zu untersuchen, waren die mitochondriale Überexpression und der Knock-down dieses Komplexes ohne Beeinträchtigung seiner nukleären oder zytoplasmatischen Funktionen unerlässlich. Durch die Markierung von CyclinB1/Cdk1 mit MTS konnten wir eine mitochondriale Überexpression dieses Komplexes erreichen, um seine mitochondrialen Ziele und Funktionen zu untersuchen. Durch das Tagging von dominant-negativem Cdk1 mit MTS wurde eine Hemmung der Cdk1-Aktivität insbesondere in den Mitochondrien erreicht. Potenzielle mitochondriale Ziele des CyclinB1/Cdk1-Komplexes wurden mit Hilfe eines gelbasierten Proteomik-Ansatzes identifiziert. Im Gegensatz zur herkömmlichen 2D-Gelanalyse verwendeten wir die 2-dimensionale Differenz-Gelelektrophorese (2D-DIGE)-Technologie, gefolgt von einer Phosphoproteinfärbung, um differentiell phosphorylierte Proteine in mitochondrialen Cdk1-exprimierenden Zellen fluoreszierend zu markieren. Die Identifizierung von Phosphoprotein-Spots, die in Wildtyp-Mitochondrien im Vergleich zu dominanten negativen Cdk1-tragenden Mitochondrien verändert waren, zeigte die Identität der mitochondrialen Ziele von Cdk1. Um die Wirkung der mitochondrialen Lokalisation von CyclinB1/Cdk1 auf die Zellzyklusprogression zu bestimmen, wurde schließlich ein Zellproliferationsassay unter Verwendung eines synthetischen Thymidin-Analogons EdU (5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin) verwendet, um die Zellen während des Zellzyklus zu überwachen und ihre DNA zu replizieren. Insgesamt haben wir eine Vielzahl von Ansätzen zur Untersuchung der mitochondrialen Lokalisation und Aktivität einer Zellzykluskinase demonstriert. Dabei handelt es sich um fortschrittliche, aber dennoch leicht verständliche Methoden, die für viele Zellbiologieforscher von Vorteil sein werden.

Introduction

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Bei Säugetieren ist die Zellzyklusprogression in Abhängigkeit von hoch geordneten Ereignisse gesteuert von Cyclinen und Cyclin-abhängigen Kinasen (Cdks) 1. Durch seine zytoplasmatische, nukleare und zentrosomalen Lokalisierung, ist CyclinB1 / Cdk1 2 verschiedene Ereignisse in der Mitose wie Kernhülle Zusammenbruch und Zentrosom Trennung zu synchronisieren können. CyclinB1 / Cdk1 schützt mitotischen Zellen vor Apoptose 3 und fördert mitochondrialen Spaltung, ein entscheidender Schritt für eine gleichmäßige Verteilung der Mitochondrien an die neu 4 gebildeten Tochterzellen.

In proliferierenden Säu....

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Protocol

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1. Isolierung von Mitochondrien aus kultivierten Zellen

  1. Herstellung von Isolationspuffer für Zellen (IBK) Puffer
    1. Bereiten 0,1 M Tris / MOPS (Tris (hydroxymethyl) aminomethan / 3- (N - Morpholino) propansulfonsäure): Man löst 12,1 g Tris in 800 ml destilliertem Wasser, pH - Wert auf 7,4 MOPS Pulver verwenden, fügen Sie destilliertes Wasser auf ein Gesamt Volumen von 1 l und lagern bei 4 ° C.
    2. Bereiten 0,1 M EGTA (Ethylenglykol-bis (2-aminoethylether) tetraessigsäure) / Tris: Man löst 38,1 g EGTA in 800 ml destilliertem Wasser, pH-Einstellung auf 7,4 unter Verwendung von Tris-Pulver, mit destilliertem Wa....

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Results

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Sub-mitochondriale Lokalisation von CyclinB1 und Cdk1

Natriumcarbonat Extraktion wird verwendet, um zu bestimmen, ob ein Protein in der Mitochondrien oder an der Außenfläche angeordnet ist, nämlich der äußeren Membran. Sobald ein Protein im Inneren der Mitochondrien, weitere Bestimmung der Unter mitochondriale Lokalisation gezeigt wird zu lokalisieren kann über mitoplasting kombiniert mit Proteaseverdau gemach.......

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Discussion

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Wie die Proteine ​​für andere subzelluläre Organellen bestimmt, die mitochondriale Zielproteine ​​besitzen Targeting - Signale in ihrer primären oder sekundären Struktur , die sie dem Organell mit Hilfe von aufwendigen Protein translocating und Falzmaschinen 21,22 lenken. Mitochondrien - Targeting - Sequenzen (MTS) aus ausschließlich mitochondrialen resident Proteine ​​wie COX8 erhalten kann , um N-Terminus von jedem Gen - Sequenz hinzugefügt werden , um spezifische Proteine ​​in die Mitochondrien 11,23,.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse CA133402, CA152313 und Department of Energy Office of Science DE-SC0001271 unterstützt. Wir danken dem Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory der University of California mit Mitteln aus dem NCI P30 CA0933730 und den NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 und S10 RR 026825 Zuschüssen und mit technischer Unterstützung von Frau Bridget McLaughlin und Herrn Jonathan Van Dyke für ihre Hilfe bei den Durchflusszytometrie-Experimenten.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
32P ATP PerkinElmerBLU002001MC 
Anti-Maus-SekundärantikörperInvitrogen A-11003Alexa-546 konjugierter
Anti-Kaninchen-SekundärantikörperInvitrogen A11029Alexa-488 konjugiertes
ATPResearch Organics1166AFür In-vitro-Kinase-Assays
Cdk1-AntikörperCell Signaling Technology9112
Cdk1-Kinase-PufferNew England BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitLife TechnologiesC10337Für die Zellzyklusanalyse mit EdU-Markierung
COX IV AntikörperCell Signaling Technology4844SFür die mitochondriale Immunfärbung
Cyclin B1 AntikörperSanta Cruz Biotechsc-752
CyclinB1/Cdk1 EnzymkomplexNew England BiolabsP6020SVermeiden Sie Einfrieren/Auftauen
CyDye DIGE Fluor Labeling KitGE Healthcare Life Sciences25-8009-83
DIGE Gel und DIGE Puffer KitGE Gesundheitswesen Biowissenschaften28-9480-26 AA
DimethylformamidSigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004Für ortsgerichtete Mutagenese
Dpn I EnzymStratagene200519-53Für ortsgerichtete Mutagenese
Dry Strip AbdeckflüssigkeitGE Healthcare Life Sciences17-1335-01Wird als Mineralöl
EDTA verwendetJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Vacufuge KonzentratorFisher Scientific07-748-13Wird als Vakuumzentrifugenkonzentrator
verwendet Fluoromount GSouthern Biotech0100-01Anti-Fade-Einbettlösung
Fortessa DurchflusszytometerBD Biosciences649908Für den Zellzyklus Analyse mit EdU-Markierung
Histon H1Calbiochem382150Für In-vitro-Kinase-Assays
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen
Immobiline DryStrip GeleGE Healthcare Life Sciences18-1016-61IEF (isoelektrische Fokussierung) Streifen
Immobilisiertes GlutathionThermo Scientific15160Glutathion-Agarose-Kügelchen
JodacetamidSigma AldrichI1149IAA
IPGphor 3 Isoelektrische FokussiereinheitGE Healthcare Life Sciences11-0033-64IPGphor Streifenhalter
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranosid RPI Corp156000-5.0IPTG
LeupeptinSigma AldrichL9783Für Zelllysepuffer
Lipofectamine 2000Life Technologies11668027Transfektionsreagenz
LysinSigma AldrichL5501Für CyDye-Markierung
LysozymEMD Chemicals5960
Mitoctracker Rot/GrünInvitrogen M7512/M7514Mitochondriale Fluoreszenzfarbstoffe
MOPSEMD Chemicals6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1GFP-exprimierender Vektor
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1 GE Healthcare Life Sciences28-9545-53GST-exprimierender Vektor
PhenylmethylsulfonylfluoridShelton ScientificIB01090PMSF
Phosphatgepufferte KochsalzlösungLife Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 DialyseschlauchSpectrum Labs132700als poröser Membranschlauch für die Dialyse
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel StainLife TechnologiesP-33300Für die Färbung von Phosphoproteinen auf 2D-Gelen
Proteinase-Inhibitor-CocktailCalbiochem539134Für Zelllysepuffer
QuikChange ortsgerichtetes Mutagenese-KitStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104MiniPrep Plasmid-Isolationskit
RO-3306Alexis Biochemicals270-463-M001Cdk1-Inhibitor
RotenonMP Biomedicals150154Complex I
Inhibitor NatriumcarbonatFisher ScientificS93359
NatriumchloridEMD ChemicalsSX0420-5Für Zelllysepuffer
NatriumorthovanadatMP Biomedicals159664Für Zelllysepuffer
Natriumpyrophosphat DecahydratAlfa Aesar33385Für Zelllysepuffer
Natriumβ-GlycerophosphatAlfa AesarL03425Für Zelllysepuffer
SpectraMax M2e Molecular DevicesM2EMikroplatten-Reader
SaccharoseFisher Scientific57-50-1
Tissue GrinderStößel Kimble Chase885301-0007Für die Isolierung von Mitochondrien
Tissue GrinderTube Kimble Chase885303-0007Für die Isolierung von Mitochondrien
TrichloressigsäurelösungSigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biomedicals103133
Triton-x-100TeknovaT1105
TrypsinCalbiochem650211
Typhoon ImagerGE Healthcare Life Sciences28-9558-09Laser-Gel-Scanner für 2D-DIGE
UbichinonSigma AldrichC7956

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.

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Mitochondrial LocalizationCdk1 KinaseMitochondrial Overexpression2D DIGE AnalysisEdU Labeling AssayFlow CytometrySodium Carbonate ExtractionSubmitochondrial FractionationMitochondrial Targeting SequenceCell Proliferation Assay

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