Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

Zusammenfassung

Die Kleinhirn externen Körnerschicht ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn. Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Veränderung, die diese Schicht an der Spitze der Proliferation unter Verwendung ex vivo Elektroporation und Kultur zerebelläre Scheiben aus embryonalen Tag 14 Hühnerembryonen zu zielen.

Zusammenfassung

Die Kleinhirn externen Körnerschicht (EGL) ist der Ort der größten Transit Verstärkung im sich entwickelnden Gehirn, und ein hervorragendes Modell für neuronale Proliferation und Differenzierung des Studiums. Darüber hinaus evolutionären Modifikationen ihrer Proliferationsfähigkeit wurden für die dramatische Ausweitung der Kleinhirngröße in den Amnioten verantwortlich, so dass das Kleinhirn ein hervorragendes Modell für Evo-Devo-Studien des Wirbeltiergehirns. Die konstituierenden Zellen der EGL, Kleinhirn-Körnervorläuferzellen, auch einen signifikanten Zellherkunfts stellen für Medulloblastom, die am häufigsten pädiatrischen neuronalen Tumor. Nach dem Transit-Amplifikation, Granulat Vorstufen migrieren radial in die innere Körnerschicht des Kleinhirns, wo sie den größten neuronalen Population im reifen Gehirn von Säugetieren dar. In chick, der Höhepunkt der EGL Proliferation tritt gegen Ende der zweiten Woche der Schwangerschaft. Um genetische Veränderung auf diese Schicht bei Targetder Peak der Proliferation, haben wir ein Verfahren zur genetischen Manipulation durch ex vivo-Elektroporation von Cerebellum Scheiben aus embryonalen Tag 14 Kükenembryos entwickelt. Dieses Verfahren faßt einige wichtige Aspekte der in vivo Granulatneuronenentwicklung und ist nützlich bei der Erzeugung ein gründliches Verständnis der Kleinhirn-Körnerzellproliferation und -differenzierung sein, und damit der Kleinhirn-Entwicklung, Evolution und Krankheit.

Einleitung

Das Kleinhirn sitzt am vorderen Ende der Hinterhirn und ist für die Integration von sensorischen und motorischen Verarbeitung im reifen Gehirn verantwortlich sowie die Regelung höhere kognitive Prozesse ^1. In Säugetieren und Vögeln, eine aufwendige Morphologie besitzt sie und ist stark blättrigen, ein Produkt der umfangreichen Transit Amplifikation von Vorläuferzellen während der Entwicklung, die mehr als die Hälfte der Nervenzellen im erwachsenen Gehirn produziert. Das Kleinhirn ist für Neurobiologen seit Jahrhunderten und in der molekularen Ära ein Thema der Studie hat ebenfalls erhebliche Aufmerksamkeit erhalten. Dies bezieht sich nicht nur auf ihre inhärent interessante Biologie, sondern auch auf die Tatsache, dass es stark in menschlichen Erkrankungen einschließlich Entwicklungs genetische Störungen wie Autismus ^{2 und} am deutlichsten Kleinhirnkrebs, Medulloblastom ^{3, die} die häufigste pädiatrische Gehirn beteiligt ist Tumor. Wichtig ist, dass es ein ausgezeichnetes Modellsystem im which dem Schicksal Allokation und Neurogenese während der Gehirnentwicklung ⁴ studieren. In den letzten Jahren hat es sich auch als Modellsystem für die vergleichende Untersuchung der Entwicklung des Gehirns festgestellt wurde, auf Grund der großen Vielfalt von Formen für die Kleinhirnwirbel phylogeny ^5-10 ersichtlich.

Das Kleinhirn entwickelt sich von der dorsalen Hälfte Rhombomer 1 im Hinterhirn ^{11 und} entwicklungs besteht aus zwei primären Vorläuferpopulationen, die Rautenlippe und der ventrikulären Zone zusammen. Die rhombische Lippe erstreckt sich um den dorsalen Bereich des Neuroepithels des Rautenhirns an der Grenze mit dem Dachblech. Es ist der Geburtsort der glutamatergen erregenden Neuronen des Kleinhirns ^12-14. Die ventrikuläre Zone führt zu den inhibitorischen GABAergen Neuronen des Kleinhirns, allen voran die großen Purkinje Neuronen ^14,15. Später in der Entwicklung (von etwa embryonalen Tag 13,5 in Maus; e6 in chick ^16), glutamatergen PROGENitors tangential wandern von der Rautenlippe und bilden eine Schicht der Pia-Vorläuferzellen: eine sekundäre Vorläuferzone genannt externen Körnerschicht (EGL). Es ist diese Schicht, die den umfangreichen Transit Verstärkung, die auf die große Zahl von Körnerzellen im reifen Gehirns führt erfährt.

Proliferation im EGL seit langem zum Teil pial Platz, in tangentiale Migration vom rhombischen ^Lippe 17 führt in Verbindung gebracht worden, wobei der Schalter auf den Zellzyklus verlassen und die neuronale Differenzierung von Vorläufern mit ihrem Austritt aus dem Außen EGL Schicht in der Mitte zugehörigen EGL ^18. Umfangreiche tangentiale Migration von postmitotischen Körnerzellen im medial-laterale Achse erfolgt in der mittleren und inneren EGL ^19, vor dem abschließenden radialen Wanderung in die innere Körnerschicht des reifen Kleinhirnrinde. Migration von Zellen aus dem rhombischen Lippe über der Kleinfläche abhängt CXCL12 Signalisierung vom pia ^20-22 Und Körnerzellen exprimieren das CXCL12-Rezeptor CXCR4. Ihre tangentiale Migration ist somit erinnert an die des Neokortex tangential Migration hemmenden Intern Bevölkerung ^23-25. Interessanterweise elektronenmikroskopischen Untersuchungen ¹⁷ haben vorgeschlagen, dass die EGL-Zellen mit einer proliferativen Morphologie beizubehalten Pia-Kontakt, die Verknüpfung Zellverhalten mit proliferative Fähigkeit in einer Art und Weise erinnert an die basalen Vorläuferzellen der Säugetier Cortex ^26. Dies wird in der vorgenannten Schichtung der EGL in drei Unterschichten, die durch verschiedene extrazelluläre Umgebungen und wo Körnchen Vorstufen haben verschiedene Genexpressions ¹⁸ definiert sind, reflektiert wird.

Proliferation von Vorläufern im oEGL tritt mit einer Normalverteilung von Klon Größen, so dass zu einem Medianwert von 250-500 g postmitotischen wenn Progenitoren einzeln genetisch am Ende der Embryonalentwicklung der Maus markiert, sie gebenranule Neuronen ^27,28. Proliferation ist abhängig von mitogenen SHH-Signalisierung von der zugrunde liegenden Purkinje Neuronen ^29-32. Die Fähigkeit, auf Shh antworten hat sich gezeigt, völlig abhängig von zellautonomen Expression des Transkriptionsfaktors Atoh1 zu sein, sowohl in vitro als auch in vivo ^{33 34,35.} Ebenso Zellzyklus verlassen und Differenzierung wurde gezeigt, abhängig von der Expression des Downstream-Transkriptionsfaktor NeuroD1 ^36, die wahrscheinlich eine direkte Repressor Atoh1 ³⁷ sein.

Trotz dieser Fortschritte und erheblichen Fortschritt in der Entzifferung der zellbiologischen Grundlagen der Zellzyklus-Ausgang ^38-42, die grundlegende molekulare Mechanismus (n), die die Entscheidung zugrunde liegen, die den Zellzyklus zu verlassen und von einem Stammvater zu einem differenzierenden Neuronen übergehen, und die assoziierten postmitotischen tangentiale Migration im inneren EGL sowie die später Schalterum die radiale Migration, bleiben unvollständig verstanden. Dies ist zu einem großen Teil aufgrund der experimentellen intractability der EGL: es spät entwickelnden und genetisch schwer gezielt da viele der neurogenen Moleküle sind auch entscheidend früher im Leben der Granulat Vorstufen am rhombischen Lippe. Um dieses Problem zu überwinden, wurden zahlreiche Autoren in vivo und ex vivo Elektroporation als eine Methode, um die postnatale Kleinhirn bei Nagern ^43-48 Ziel entwickelt. Hier haben wir Pionierarbeit in der Verwendung von ex vivo Elektroporation in Küken, die EGL, die erhebliche Vorteile in Bezug auf Kosten und Bequemlichkeit stellt studieren. Unsere Methode der Elektroporation und ex vivo Schnittkultur von Chick Kleinhirngewebe verwendet Gewebe aus embryonalen Tag seziert 14 Küken auf dem Höhepunkt der EGL Verbreitung. Diese Methode ermöglicht es genetische Targeting des EGL unabhängig rhombischen Lippe und die Bühne für Genetik der Übergang vom Granulat eingestelltVorläufer zu postmitotischen Granulat Neuronen im Kleinhirn.

Protokoll

Hinweis: Alle Experimente wurden mit entsprechend den Kings College London, Großbritannien und die britische Innenministerium Tierpflege-Richtlinien durchgeführt.

1. Präparation der e14 Cerebellum

1. Braun befruchteten Hühnereiern Inkubation bei 38 ° C zu embryonalen Tag 14.
2. Mit Ei Schere enthaupten Hühnerembryo in ovo, und entfernen Sie den Kopf auf eine Petrischale mit eiskaltem PBS (Abbildung 1A).
3. Verwendung von Standard-Pinzette, machen Einschnitte hinter jedem Auge den ganzen Weg durch das Gewebe, das Entfernen der Augen und Oberkiefer. Einen zweiten Schnitt ganz durch den Rachen Entfernen des Unterkiefers (Abbildung 1B).
4. Verwendung von Standard-Pinzette, entfernen Sie die Haut von der Oberfläche des Schädels durch Abziehen es weg (Abbildung 1c), und entfernen Sie frontalen und parietalen Knochen und enthüllt Gehirn.
5. Aus einer ventralen Seite, entfernen Rachen Knorpel und Hilfs Mesenchym.
6. Aus einer dorsalen, vorsichtigly entfernen Mesenchym dorsal der Hinterhirn dabei nicht pia und separate gesamte Gehirn (1D) beschädigen.
7. Machen Einschnitt den ganzen Weg durch das Gewebe zwischen Mittelhirn und Hinterhirn und Hinterhirn separaten einschließlich Kleinhirn (1E).
8. Durch Einschnitte den ganzen Weg durch das Gewebe an beiden seitlichen Übergängen von Kleinhirn und Flügelplatte des Hinterhirn, entfernen gesamte Kleinhirn, kümmert sich um die Integrität der Pia gesamten Dissektion (1F) zu halten. Entfernen Sie die bildenden Plexus (1G).
9. Bewegen Sie den seziert Kleinhirn in eiskaltes HBSS.

2. Scheibe Kultur von e14 Cerebellum

1. Übertragen die gesamte Kleinhirn in den sterilen Plattform einer Tissue Chopper mit einem Spatel oder ein 3 ml Pasteurpipette mit der Spitze weggeschnitten ist, um die Öffnung zu erweitern. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette.
2. Schneiden gesamte Ganze Kleinhirn in ter benötigt Orientierung bei 300 & mgr; m Dicke mit dem Gewebe Chopper mit einer Schnittgeschwindigkeit eingestellt auf 50% des Maximums. Gewebeintegrität wird am einfachsten im Sagittalschnitt bewahrt; jedoch ist die Orientierung auch ein wichtiger Gesichtspunkt für die Zellanalyse (Purkinjezelle Dendriten sagittal ausgerichtet sind, während die Körnerzell Axone verlaufen quer, senkrecht zur Ebene der Purkinje Zelle Dendriten).
3. Mit einem 3 ml Pasteurpipette, decken Sie die in Scheiben geschnittenen Kleinhirn in eiskaltem HBSS.
4. Übertragen Sie die Scheiben in HBSS auf eine 60 mm Petrischale mit Eis kalte Frisch HBSS mit einem 3 ml Pasteurpipette mit geschnittenen Spitze.
5. Unter einem Binokular mit einem faseroptischen Lichtquelle beleuchtet wird, sicherzustellen, Trennung der einzelnen Scheiben mit Uhrmacher Pinzette. Identifizieren Scheiben elektroporiert werden, auf der Grundlage ihrer Gewebeintegrität und medio-laterale Position.
   Hinweis: Jeder Dissektion vom Embryo bis zur Inkubation in Kulturmedium in Scheiben schneiden dauert etwa 10-20 min je upon-Erlebnis. Zuführen Dissektionen eine zu einem Zeitpunkt, um sicherzustellen, dass cerebella verbringen minimalen Zeitspanne zwischen Dekapitation und ex vivo-Kultur.

3. Elektroporation von Slices

1. Konstruktion eines Elektroporationskammer durch Fixieren der Anode einer Elektroporator auf der Basis einer 60 mm Petrischale mit Isolierband. In etwa 1 ml HBSS, um die Elektrode zu bedecken.
2. Legen Sie eine 0,4 um Kultureinsatz an der Spitze der Elektrode in HBSS bedeckt. Lassen Sie das Kultureinsatzes auf die Elektrode dafür sorgen, gibt es immer zwischen dem Einsatz und der Elektrode kontaktieren ausruhen.
   Hinweis: In dieser Konfiguration wird der Kultureinsatz mit den Scheiben auf die Oberfläche der Lösung liegen, die Aufrechterhaltung der Schaltung, sondern ermöglicht räumliche Ausrichtung der Kathode.
3. Transfer identifizierten Scheiben (bis zu fünf pro Kultureinsatz) auf Kultureinsatz mit 3 ml Pasteurpipette mit dem Schnitt Spitze. Separate und lassen Sie sie in einem sagitt auf Kultureinsatzes absetzenal Ausrichtung.
4. Mit einer Pipette entfernen überschüssiges HBSS, so dass Scheiben sind in der Lösung nicht mehr gebadet.
5. Verwendung einer P10-Pipettenspitze, einer Pipette DNA (bei einer Konzentration von 1 ug / ul) mit 20% Fast Green über die Oberfläche der Zielregion einer Scheibe verdünnt. 20% schnell grün sorgt für viskose DNA-Lösung und verhindert, dass übermäßig breite Streuung der DNA. In etwa 5 & mgr; l DNA / schnell grün Lösung für jede Scheibe (2B).
6. Legen Sie die Kathode über gewünschte Zielgewebe und elektroporieren mit 3 x 10 V, 10 ms Dauer Impulse. Vermeiden Sie direkten Kontakt der Kathode mit dem Gewebe. Stattdessen profitieren Sie von der Oberflächenspannung der Flüssigkeit, um Leitfähigkeit zu halten (platzieren Sie die Kathode so nah an das Gewebe wie möglich, ohne zu berühren das Gewebe).
7. Wiederholen DNA Lieferung und Elektroporation, um mehrere Regionen der EGL auf jedem einzelnen Kleinhirn Scheibe nach Wunsch.
8. Nach Abschluss der Elektroporation, Transfer Kultur insert bis 30 mm Petrischale.
9. Zu jeder Kultur, 1 ml der vorgewärmten Kulturmedium (Basal Medium Eagle, 0,5% (w / v) D - (+) - Glucose, 1% B27 ergänzen, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin) unter dem Kultureinsatz, so dass die Kultureinsatzes in Kontakt mit dem Medium, aber Scheiben sind nicht in sie getaucht.
10. Kulturen, die bei 37 ° C / _6% CO 2 inkubieren bis 3 Tage. Ersetzen Sie den gesamten Kulturmedium alle 24 Stunden mit frischem vorgewärmten Medium.
11. Nach der Kultur, zu beheben Scheiben auf Kultureinsätze für 1 Stunde in 4% Paraformaldehyd (oder O / N bei 4 ° C) in einem frischen 30-mm-Schale ohne Kulturmedien.

4. Imaging von Kleinhirn-Slices

1. Nach der Fixierung, Waschen Scheiben 3 mal 5 min in PBS.
2. Mit einer Rasierklinge, sezieren jede Elektroporation und kultivierten zerebellären Scheibe aus dem Kultureinsatzes durch Schneiden um die Scheibe und das Entfernen der Scheibe und den Bereich der Einsatz es eingehalten wird. MachenVersuchen Sie nicht, Scheibe aus der Kultur Einsatzoberfläche zu entfernen.
3. Berg Scheiben in etwa 1 ml Eindeckmedium enthält DAPI (falls gewünscht) unter einem Deckglas dabei nicht zu Blasen einzuführen und Bild mit Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie.
   Anmerkung: Bildparameter können gemß den Konstrukten elektroporiert variiert werden und liegt im Ermessen des jeweiligen Benutzers.

Ergebnisse

Dieser Abschnitt zeigt Beispiele von Ergebnissen, die unter Verwendung von Scheiben Elektroporation und die Kultur des Kleinhirns aus embryonalen Tag 14 Küken gewonnen werden können. Die Präparation des Kleinhirns ist in Abbildung 1 veranschaulicht und die Elektroporationskammer einzurichten ist in Abbildung 2 dargestellt. Wir zeigen, dass es möglich ist, Kultur Kleinhirnschnitten, die ihre Struktur und Zellmorphologie in vitro ...

Diskussion

Das Protokoll hier berichteten beschreibt ein Verfahren zum Präparieren, Elektroporation und Kultivieren Scheiben embryonalen Tag 14 Kleinhirn von der Küken. Dieses Protokoll ermöglicht Targeting der Elektroporation zur kleinen Brenn Regionen der EGL, einschließlich isolierten Ausrichtung der einzelnen Kleinhirnlappen. Es ermöglicht die genetische Analyse und Bildgebung mit einer hohen Auflösung und Bequemlichkeit, und zu geringen Kosten im Vergleich zu etablierten Techniken in Nagetieren ^43-47. Eine solche A...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
McIlwain Gewebehacker	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Schnitt bei 300 μ m für beste Ergebnisse.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-Glutamin	Sigma	G7513
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333
0,4 μ m Kultureinsatz	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne Elektroporator	Intracel	01-916-02	Verwenden Sie 3 x 10 V, 10 ms Impulse für die Elektroporation.