Method Article

Verbesserte Generierung induzierter Kardiomyozyten Mit einem Polycistronische Construct Ausdruck optimale Verhältnis von Gata4, Mef2c und Tbx5

DOI:

10.3791/53426

⸱

November 13th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Erzeugung von iCMs unter Verwendung der Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Tbx5 und Mef2c in einem polycistronischen Konstrukt. Dieses Protokoll liefert eine relativ homogene Population von reprogrammierten Zellen mit verbesserter Effizienz und Qualität und ist wertvoll für zukünftige Studien zur iCM-Reprogrammierung.

Abstract

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Direkte Umwandlung von kardialen Fibroblasten (CFS) in Kardiomyozyten induziert (ICMS) birgt ein großes Potential für die regenerative Medizin, indem sie alternative Strategien für die Behandlung von Herzkrankheiten. Diese Umwandlung wurde durch erzwungene Expression von definierten Faktoren wie Gata4 (G), Mef2c (M) und Tbx5 (T) erreicht ist. Traditionell ICMS werden von einem Cocktail von Viren, die diese individuellen Faktoren generiert. Reprogrammierung Effizienz ist jedoch relativ gering und die meisten der in vitro G, M, T-transduzierten Fibroblasten nicht zu voll umprogrammiert, so dass es schwierig ist, die Umprogrammierung Mechanismen zu studieren. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Stöchiometrie der G, M, T ist entscheidend für die effiziente iCM Neuprogrammierung. Eine optimale Stöchiometrie von G, M, T mit relativ hohen und niedrigen Pegeln M von G und T durch unseren polycistronischen MGT-Vektor (im Folgenden als MGT bezeichnet) deutlich erhöht Umprogrammierung Effizienz erzielt und eine verbesserte Qualität iCM in vitro. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung der Methode, nach der ICMS mit MGT Konstrukt von kardialen Fibroblasten zu generieren. Isolierung von kardialen Fibroblasten, Generation von Virus zur Neuprogrammierung und Bewertung der Umprogrammierung sind ebenfalls enthalten, um eine Plattform für die effiziente und reproduzierbare Erzeugung von ICMS bereitzustellen.

Introduction

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Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind mit 17,3 Millionen Todesfällen pro Jahr nach wie vor die häufigste Todesursache weltweit1. Der Verlust von Kardiomyozyten infolge eines Myokardinfarkts (MI) oder einer fortschreitenden Herzinsuffizienz ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität2. Aufgrund der eingeschränkten Regenerationsfähigkeit leiden erwachsene Säugetierherzen in der Regel an einer Beeinträchtigung der Pumpfunktion und Herzinsuffizienz nach Verletzungen3-6. Daher ist die effiziente (Re-)Generierung von Kardiomyozyten in vivo und in vitro zur Behandlung von Herzerkrankungen und zur Krankheitsmodellierung ein kritisches Thema, das angegangen werden muss.

Die jüngste Entwicklung der direkten Reprogrammierung, die Zellen direkt von einem differenzierten Phänotyp in einen anderen umprogrammiert, ohne den pluripotenten Zustand zu durchlaufen, bietet einen vielversprechenden alternativen Ansatz für die regenerative Medizin. Das Säugetierherz enthält reichlich kardiale Fibroblasten (CFs), die etwa die Hälfte der Zellen im Herzen ausmachen und sich bei Verletzungen massiv vermehren7-9. Somit könnte der riesige Pool an CFs als endogene Quelle für neue CMs für die regenerative Therapie dienen, wenn sie direkt in funktionelle CMs umprogrammiert werden könnten. Es wurde gezeigt, dass eine Kombination von Transkriptionsfaktoren wie Gata4 (G), Mef2c (M) und Tbx5 (T) mit oder ohne microRNAs oder kleine Moleküle Fibroblasten in die iCMs10-26 umprogrammieren kann. Wichtig ist, dass diese Umwandlung auch in vivo induziert werden kann und zu einer Verbesserung der Herzfunktion und einer Verringerung der Narbengröße bei einem infarzierten Herzen führt16,27-29. Diese Studien deuten darauf hin, dass eine direkte kardiale Reprogrammierung ein potenzieller Weg zur Heilung eines verletzten Herzens sein kann. Die geringe Effizienz der iCM-Reprogrammierung ist jedoch zu einer großen Hürde für weitere mechanistische Studien geworden. Darüber hinaus ist die Reproduzierbarkeit der kardialen Reprogrammierung ein weiteres umstrittenes Thema dieser Technologie11,30,31.

Vor kurzem haben wir einen vollständigen Satz von polycistronischen Konstrukten generiert, die G,M,T in allen möglichen Spleißordnungen mit identischen 2A-Sequenzen in einer einzigen mRNA kodieren. Diese polycistronischen Konstrukte führten zu unterschiedlichen Expressionsniveaus von G-, M- und T-Proteinen, was zu einer signifikant unterschiedlichen Reprogrammierungseffizienz führte25. Das effizienteste Konstrukt namens MGT, das eine relativ hohe Mef2c- und eine niedrige Gata4- und Tbx5-Expression aufwies, verbesserte die Effizienz der Reprogrammierung signifikant und produzierte große Mengen an iCMs mit CM-Marker-Expression, robuster Kalziumoszillation und spontanem Schlagen25. Darüber hinaus vermied unsere Studie durch die Verwendung des polycistronischen MGT-Konstrukts die Verwendung mehrerer Vektoren und erzeugte Zellen mit einem homogenen Expressionsverhältnis von G,M,T, wodurch eine verbesserte Plattform für die kardiale Reprogrammierungsforschung geschaffen wurde. Um die experimentelle Reproduzierbarkeit zu erhöhen, beschreiben wir hier im Detail, wie Fibroblasten isoliert, Retrovirus-tragende MGT-Kassetten hergestellt, iCMs erzeugt und die Reprogrammierungseffizienz bewertet werden.

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Protocol

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Die hier vorgestellte Protokoll verwendet neugeborenen Mäusen. Tierpflege und Experimente werden in Übereinstimmung mit den von der Abteilung für Labortiermedizin (DLAM) an der University of North Carolina, Chapel Hill festgelegten Richtlinien durchgeführt.

1. Herstellung von Puffern und Medien

  1. Bereiten Fibroblasten (FB) Medium: Nachtrag 500 ml IMDM Medium mit 100 ml fötalem Rinderserum (FBS) und 6 ml Penicillin / Streptomycin.
  2. Bereiten iCM Medium: Nachtrag 400 ml DMEM-Medium mit 100 ml M199 Medien und 50 ml FBS.
  3. Bereiten B27 Medium: Nachtrag 490 ml RPMI1640 Medium mit 10 ml B27 Medien.
  4. Bereiten Plat-E Kulturmedium: Nachtrag 500 ml DMEM-Medium mit 50 ml FBS, 5 ml Penicillin / Streptomycin und 5 ml Nicht-essentiellen Aminosäuren.
  5. Bereiten Plat-E Transfektionsmedium: Nachtrag 500 ml DMEM-Medium mit 50 ml FBS und 5 ml Nicht-essentiellen Aminosäuren.
  6. Prepare Gelatine beschichtete Platte mit 24 Vertiefungen: 0,5 ml 0,1% Gelatinelösung zu einer gut 24-Well-Platte, bei 37 ° C für mindestens 10 min und saugen rechts vor dem Gebrauch.
  7. Vorbereitung FACS Markierungspuffer: Beilage 500 ml DPBS mit 10 ml FBS, 2 ml EDTA (0.5 M), um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Die Lösung durch ein 0,22 um Filter und bei 4 ° C.
  8. Vorbereitung MACS Sortierpuffer: Beilage 500 ml DPBS mit 2,5 g BSA und 2 ml EDTA (0.5 M), um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Die Lösung durch ein 0,22 um Filter und bei 4 ° C.
  9. Vorbereitung 2x HBS-Puffer für die Transfektion: Zusätzliche 500 ml HEPES-Puffer (50 mM) mit 280 mM NaCl (8,1816 g), 10 mM KCl (0,37275 g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM Glucose (1,08096 g ). In etwa 650 & mgr; l 10 N NaOH auf pH-Wert auf 7,05 bis 7,12 anpassen. Man filtriert durch ein 0,22 um Porenfilter und bei 4 ° C.
  10. Bereiten 2,5 M CaCl 2 -Lösung zur Transfektion: Fügen 18,376 g CaCl 2 bis 50 ml ddH 2 O. Man filtriert durch ein 0,22 um Porenfilter und bei 4 ° C.
  11. Bereitet ICC (Immunzytochemie) Fixierungspuffer: 5 ml Paraformaldehyd (PFA, 32%) zu 35 ml DPBS, um eine Endkonzentration von 4% erreicht werden.
  12. Bereitet ICC Permeabilisierung Puffer: 0,1 ml Triton 100 ml DPBS, um eine Endkonzentration von 0,1% zu erreichen.
  13. Bereitet ICC Blockierungspuffer: 5 g Rinderserumalbumin (BSA) und 100 ml DPBS auf eine Endkonzentration von 5% zu erreichen.
  14. Bereitet ICC Färbepuffer: 1 g BSA auf 100 ml DPBS auf eine Endkonzentration von 1% zu erreichen.

2. Erzeugung von Neonatal Maus kardialen Fibroblasten

  1. Generieren kardialen Fibroblasten aus Explantatkultur Verfahren
    1. Sauber neonatalen & alpha; MHC-GFP transgenen Maus (P1 bis P2) mit 75% Ethanol. Schneiden Sie den Kopf mit einer sterilen Schere. Dann machen Sie einen horizontalen Schnitt von unter einem Achselhöhle zu den anderen. Verwenden Sie eine sterilestumpf und gebogenen Pinzette zu sezieren das Herz heraus und legen Sie sie in einem Brunnen der 24 Well-Platte mit eiskaltem PBS-Puffer.
      1. Alternativ Squeeze-out der Herzen nach dem horizontalen Schnitt.
    2. Überprüfen GFP-Expression in Herz von Fluoreszenzmikroskop. Da der GFP-Expression durch & alpha; MHC-Promotor, der ein herzspezifischen Promotor angetrieben wird, sollte der Kern aus transgenen Maus in grün 15, während der negative Herz dim jeden Fluoreszenz.
    3. Nehmen Sie 3-4 GFP positive Herzen in eine 60 mm-Center auch Kulturschale und zerkleinern sie in kleine Stücke von weniger als 1 mm 3 in der Größe von sterilen Schere und Pinzette.
    4. Zeigen 3-4 Hackfleisch Herzen in einer 10 cm Schüssel mit 2 ml FB Medien. Lassen Sie sich die Gewebe niederzulassen für 3 Stunden.
    5. Langsam 8 ml vorgewärmten FB Medien zu den Schalen mit Herzgewebe. Das Gewebe nicht stören für drei Tage.
    6. Ersetzen Sie die Medien alle drei Tage.
    7. Am Tag 7 aspiraß das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit DPBS. 3 ml 0,05% Trypsin zu jeder Platte und Digest bei 37 ° C für 5 min.
    8. 5 ml FB Medien Trypsin quenchen. Leicht lösen die Zellen mit einem Zellschaber. Pipettieren Sie die Medien auf und ab, um weiter mechanisch das Gewebe zu distanzieren.
    9. Sammeln Zellen und filtriert über 40 um Zellsiebe, um eine Kontamination von Herzgewebefragmente zu vermeiden und zu pelletieren dann die Zellen durch Zentrifugieren bei 200 xg für 5 min.
    10. Wash Zellen einmal mit MACS-Puffer und Zellen sind bereit für die Sortierung.
  2. Generieren kardialen Fibroblasten aus Enzymverdau Verfahren
    1. Ernte-GFP positive Herzen als 2.1.1. Übertragen Sie alle Herzen in einen 10 cm-Schale mit 10 ml eiskaltem DPBS.
    2. Squeeze Ventrikel mit einer sterilen Pinzette, um Blut zu entfernen und einmal gründlich mit eiskaltem DPBS.
    3. Schneiden Sie die Herzen frei von anderen Geweben und fettfrei sein.
    4. Cut jedes Herz in etwa 4 Stücke, die noch lose verbunden sind.
    5. Wenn weniger als 20 Herzen, zu übertragen, die Herzen in ein 15 ml konischen Rohr mit 8 ml warmes 0,05% Trypsin-EDTA, und bei 37 ° C für 15 min.
      1. Wenn es 20-30 Herzen, zu übertragen, die Herzen in ein 50 ml konisches Röhrchen mit 10 ml warmem 0,05% Trypsin-EDTA, und bei 37 ° C für 15 min.
    6. Entsorgen Sie die Trypsin und 5 ml (für weniger als 20 Herzen) oder 10 ml (20-30 Herzen) warme Typ II Kollagenase (0,5 mg / ml) in HBSS.
    7. Vortex die Röhre auf Vortexer für 1 min bei einer Geschwindigkeit Niveau um 4 bis 6 (wenn die Flüssigkeit nicht aufstehen, um den Deckel, so wird die Geschwindigkeit ist in Ordnung).
    8. Das Röhrchen bei 37 ° C Wasserbad für 3-5 min.
    9. Das Röhrchen vortexen für 1 min.
    10. Sediment für 1 min durch die Schwerkraft, bis die Gewebestücke niederzulassen, sammeln die Flüssigkeit in ein neues Röhrchen mit 5 ml kaltem FB Medium.
    11. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6-2.2.10 3-5 mal.
    12. Kombinieren Sie all die Sammlungen durch Filtrieren durch 40 & mgr; m Zellsiebzur Einzelzellsuspension zu machen.
    13. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C.
    14. Die Zellen in 10 ml MACS-Puffer und Zentrifugieren bei 200 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
    15. Optional: Wenn es eine Menge von Blutzellen, resuspendieren Zellen mit 1 ml RBC-Lyse-Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 und 0,1 mM EDTA), auf Eis halten für 1 min, dann mit 10 ml MACS verdünnen Puffer und Zentrifugieren bei 200 xg für 5 min. Ein weiteres Mal mit MACS-Puffer waschen.
  3. Isolierung von Thy1.2 + Fibroblasten durch MACS (magnetic cell separation)
    1. Bestimmen Sie Anzahl lebensfähiger Zellen durch Trypanblau-Färbung.
      1. Nehmen Sie 10 ul Zellen aus 10 ml Zellsuspension in Schritt 2.2.14. Mischen Sie es mit 10 & mgr; l 0,4% Trypanblau-Lösung.
      2. Das Gemisch in einem Hämocytometer. Lassen Sie es für 3-5 Minuten stehen gelassen und dann umgehend prüft unter dem Mikroskop. Die toten Zellen sind in blau und lebensfähigen Zellen gefärbt sind ungefärbt.
      3. Graf alle lebensfähigen Zellen in vier 1 mm Eckquadrate der Zählkammer. Bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen: die durchschnittliche Zahl pro Quadrat x 2 (Verdünnungsfaktor) x 10 4 x 10 (Gesamtvolumen der Zellsuspension).
    2. Weniger als 1 x 10 7 Zellen Die Zellen werden mit 10 ul Thy1.2 Mikrokügelchen in 90 & mgr; l MACS-Puffer gekühlt. Fügen Sie mehr Perlen proportional, wenn es mehr als 1 × 10 7 Zellen. Gut mischen und inkubieren im Kühlschrank (2-8 ° C) für 30 Minuten.
    3. 10 ml MACS-Puffer und Spin-Proben bei 200 × g für 5 min; sofort abwaschen mit 10 ml MACS-Puffer und Zentrifuge wieder.
    4. Bringt Volumen auf 2 ml in MACS-Puffer.
    5. Up ein MACS Separator in Haube eingestellt. Legen Sie eine LS-Säule in den Separator. Eine 3 ml MACS zu dem Säulenpuffer, um sie äquilibrieren.
    6. Übergeben Sie die Zellsuspension durch die äquilibriert LS Spalte.
    7. 3 x waschen mit 2 ml MACS-Puffer jedes Mal.
    8. Nehmen Sie die Spalte LS off ter Separator und eluieren 3 mal mit 2 ml MACS in eine neue 50-ml-Tube zu puffern.
    9. Spin bei 200 × g für 5 min.
    10. Die Zellen in 10 ml FB Medien, zählen Sie die Zellen und Samen in Platten an geeigneten Dichte. Fibroblasten aus Explantatkultur Verfahren erzeugt wird, kann die Aussaat Zellen Dichte um 2-3 × 10 4 Zellen / Vertiefung Platte mit 24 Vertiefungen sein. Fibroblasten aus Enzymverdau Verfahren erzeugt wird, könnte die Zellen Dichte um 4-5 × 10 4 Zellen / Vertiefung Platte mit 24 Vertiefungen sein.

3. Erzeugung von Retrovirus für iCM Reprogrammierung

Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte in einem BSL2 Biologische Sicherheitswerkbank unter sterilen Bedingungen. Die ordnungsgemäße Entsorgung von transfizierten Zellen, Pipettenspitzen und Röhren wird empfohlen, um das Risiko von Umwelt- und Gesundheitsgefahren zu vermeiden.

  1. Aufrechtzuerhalten PLAT-E-Zellen in PLAT-E-Medium mit 1 & mgr; g / ml Puromycin und 10 ug / ml b ergänztlasticidin bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  2. Am Tag 2, ersetzen Sie das Medium durch Plat-E Kulturmedium fehlt Puromycin und Blasticidin.
  3. Am Tag 0, aufgeteilt PLAT-E-Zellen, in 10-cm-Schalen am Tag vor der Transfektion auf etwa 4-5 x 10 6 Zellen pro Platte. Zellen sollten 80-90% konfluent waren am Tag der Transfektion werden ~.
  4. An Tag 1, ändern Nährmedien in Transfektionsmedium auf Zellen innerhalb 1 h vor der Transfektion. Transfektionsverfahren ist wie folgt:
    1. Transfektion mit kommerziellen Kits
      1. Mischungs 20 ul Transfektionsreagenz (zB Lipofectamin) und 500 & mgr; l reduziert Serum Medien (zB Opti-MEM). In 10 ug des retroviralen Plasmid, um weitere 500 & mgr; l Serum-Medien reduziert. Inkubieren jeder Mischung bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
      2. Langsam die Plasmid-Mischung auf Transfektionsgemisch. Dieser Schritt kann 15-30 Sekunden dauern. Inkubieren Sie die Mischung für 20 min bei RT (Lösung kann eine Trübung).
      3. In Mischung tropfenweise zu den Zellen.
      4. Beimpft und über Nacht in einem 37 ° C Inkubator.
    2. Transfektion mit Calciumphosphat.
      1. Mix 40 ul 2,5 M CaCl 2 und 440 & mgr; l ddH 2 O, dann fügen Sie 20 ug des retroviralen Plasmid (stellen Sie die Menge ddH 2 O, so dass Gesamtvolumen von 500 & mgr; l).
      2. Gib 500 ul 2x HBS zu einem 15 ml konischen Röhrchen.
      3. Mischen Sie den HBS und in der Zwischenzeit fügen die Calcium-DNA-Gemisch zu der HBS tropfenweise. Dieser Schritt dauert etwa 30 Sekunden für jede Probe. So maximal 3-4 Proben gleichzeitig zu tun.
      4. Inkubation bei RT für 3 min Inkubation für längere Zeit führt zu größeren Niederschlag und weniger Zellen nehmen den Niederschlag.
      5. In die Mischung tropfenweise zu den Zellen und beobachten unter 20X Mikroskop. Feine Ausscheidungen (viele kleine sind gut, aber ein paar Großen sind nicht gut) gesehen werden sollte.
      6. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C Inkubator.
  5. Am Tag 2 ändern Medien auf Zellen mit 8 ml vorgewärmtem Kulturmedien. Inkubationszeit von 24 h.
  6. An Tag 3 und Tag 4, sammeln Kulturüberstand aus den Schalen unter Verwendung einer sterilen 10 ml-Einwegspritze, Filtrieren über eine 0,45 um Porengrße Celluloseacetat-Filter und Überführen in eine 50 ml Röhre. 2 ml Retrofällungslösung zu jedem 8 ml virushaltigen Überstands. Vorsichtig mischen und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
  7. Am Tag 5 zu drehen, die das virale Mischung bei 1.500 × g bei 4 ° C für 30 min. Die viralen Partikel sollten in weißes Pellet am Boden des Röhrchens angezeigt.
  8. Überstand verwerfen. Spin down Restlösung durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 5 min. Entfernen Sie alle Spuren von Flüssigkeit durch Absaugen, wobei große Sorgfalt nicht, um die ausgefällten retrovirale Partikel in Pellet stören.
  9. Resuspendieren retroviralen Pellets mit 100 ul DPBS-Puffer für jeweils 8 ml Virusüberstand. Aliquotdas Virus auf Eis. Verwenden Sie sofort oder bei -80 ° C.

4. Reprogrammierung von kardialen Fibroblasten

  1. In 4 ul 10 mg / ml Polybren Lösung in den 10 ml iCM Medium und vorsichtig mischen durch Auf-und Abpipettieren. Die Endkonzentration von Polybren 4 ug / ml.
  2. Fügen Sie 500 ul iCM Medien, die Polybren zu jeder Vertiefung der 24-Well-Platte mit Fibroblasten beimpft.
  3. Zugabe von 10 & mgr; l-Retrovirus in jede Vertiefung, die entweder von 2-3 × 10 4 Zellen von Explantatkultur oder 4-5 x 10 4 Zellen von Enzym-Aufschlußverfahren. Die Virusmenge, sollte proportional zu einer erhöhten Zellzahl in verschiedenen Kulturschalen oder Schalen erhöht werden. Legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator für 24-48 h, um die Virusinfektion zu ermöglichen. Die Zeitlinie für die Herz Neuprogrammierung wird in Abbildung 1 gezeigt.
  4. Nach virale Transduktion, ersetzen Virus haltigen Medien mit 500 ul regelmäßigen iCM Medien.
  5. Ändern Medien alle 2-3 Tage. Für die positive Selektion von viralen transduzierten Zellen, fügen iCM Medien mit Puromycin ergänzt mit 2 ug / ml an die Zielzellen. Halten Sie es für drei Tage. Danach halten Puromycin im ICM-Medium bei einer Konzentration von 1 ug / ml.
  6. Drei Tage nach der Virusinfektion, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop (20x), um die GFP-Expression zu beobachten.
    Anmerkung: Zehn Tage nach der Virusinfektion, könnte Zellen für die FACS-Analyse und ICC-Analyse, um die Umprogrammierung Effizienz bestimmen geerntet werden (in Schritt 5 und 6).
  7. Vierzehn Tage nach der Virusinfektion, ersetzen iCM Medien mit B27 Medien. Ändern Medien alle drei Tage. Spontane Schlagen Zell Loci kann aus drei (Zellen aus Enzym Verdauungsmethode) oder vier (Zellen aus Explantatkultur Methode) Wochen nach Virusübertragung angezeigt.

5. Immunzytochemische Analyse der Reprogrammierung Efficiency

  1. Rinse-Zellenmit eiskaltem PBS dreimal; Entfernen überschüssiger Lösung.
  2. 0,5 ml ICC Fixierungspuffer zu jeder Vertiefung der Platten mit 24 Vertiefungen. Befestigen Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 15-20 min.
  3. Spülen Zellen dreimal mit PBS.
  4. 0,5 ml ICC Permeabilisierung Puffer in jede Vertiefung der 24-Well-Platten. Permeabilisierung der Zellen bei RT für 15 min.
  5. Spülen Zellen dreimal mit PBS.
  6. 0,5 ml ICC Blocking-Puffer in jede Vertiefung der Platte mit 24 Vertiefungen, Inkubation bei RT für 1 h.
  7. Verdünnten primären Antikörper mit ICC Färbepuffer. Fügen Sie 200 ul Antikörperlösungen in jede Vertiefung beimpft und über Nacht bei 4 ° C. Die Antikörperverdünnungsfaktoren sind in Materialien aufgeführt.
  8. Am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
  9. Fügen Sie 200 ul sekundären Antikörperlösungen zu den Zellen und Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln.
  10. Wasche die Zellen mit PBS dreimal.
  11. Fügen Sie 150 ul Montagelösung, die DAPI in jede Vertiefung. Ermöglichen, Keime für 1 min färben. Dannauf jede Auftragsstelle runden Deckglas und drücken Sie vorsichtig den Schlupf gegen die Bodenfläche mit einer Pinzette, um Luftblasen zu entfernen.
  12. Absaugen überschüssige Lösung und die Proben sind bereit für Bildgebung. Die repräsentativen Bilder, welche die umprogrammiert Zellen, die zum Ausdruck bringen Herzmarker cTnT und αActinin bei d14 sind in 2B gezeigt.

6. FACS Analyse der Reprogrammierung Efficiency

  1. Gründlich waschen Zellen einmal mit DPBS. Zugabe von 0,3 ml Trypsin (0,05%) in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 5 min.
  2. Klopfen Sie leicht die Platte zu erleichtern, die Aufhebung der Zellen. Überprüfen Sie die Zellablösung unter Mikroskop. 1 ml FACS-Puffer in jede Vertiefung gegeben, wenn die meisten Zellen werden dissoziiert. Pipette nach oben und unten, um weiter mechanisch distanzieren die Zellen.
  3. Übertragen Sie Zellen in der 24-Well-Platte auf eine 96-Well Tiefbrunnenplatte auch gut. Schleudern bei 200 xg für 5 Minuten bei 4 ° C, um die Zellen zu sammeln.
  4. Wasche die Zellen einmal mitFACS-Puffer.
  5. 100 ul Fixierung / Permeabilisierung Lösungen um Zellen für 20 min bei 4 ° C zu suspendieren.
  6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x Waschlösung, Pellet und Überstand zu entfernen.
  7. Bereiten primären Antikörperlösung gegen GFP und cTnT in 1x Waschpuffer. Jede Probe mit 50 ul Antikörper-Lösung gründlich resuspendieren und Inkubieren bei 4 ° C für 30 min.
  8. Waschen Sie die Zellen einmal in 1x Waschlösung, Pellet und Überstand zu entfernen.
  9. Zugabe von 50 & mgr; l sekundärem Antikörper enthaltenden Lösung Alexa Fluor 488 konjugiert Esel-Anti-Kaninchen-IgG und Alexa Fluor 647 konjugiert Esel-anti-Maus-IgG zu jeder Probe. Inkubieren bei 4 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.
  10. Waschen Sie die Zellen einmal in 1x Waschlösung, Pellet und Überstand zu entfernen.
  11. Die Zellen in 400 ul Fixierungspuffer (DPBS mit 1% PFA). Bringen Zelle in FACS-Röhrchen mit Zellsieb Kappe. Die Proben sind bereit für die FACS-Detektion. Der Vertreter der FACS-Analyse von Umprogrammierung efficiency mit pMxs-Puromycin-MGT-Konstrukts mit oder ohne Puromycin-Selektion ist in 2A gezeigt.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Umprogrammierung Schritte werden von schematischen in Figur 1 zusammengefasst. Nach MGT Transduktion, konnte die GFP-Expression in Zellen Umprogrammierung bereits an Tag 3. Puromycin-Selektion von transduzierten Zellen ab Tag 3 und wird während der ersten zwei Wochen aufrechterhalten erkannt werden, wenn pMX-puro -MGT Konstrukt verwendet. Von Tag 10 bis Tag 14 konnte die Expression von herzspezifische Marker wie cTnT und αActinin sowohl ICC (2B, Schritt 5) und FACS (2A,

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Für erfolgreiche iCM Erzeugung bei der Verwendung dieses Protokoll gibt es mehrere wichtige Faktoren, die einen Einfluss auf den Gesamtwirkungsgrad zu haben. Insbesondere die Bedingungen für die Start Fibroblasten und die Qualität der Retrovirus-Codierung MGT kann großen Einfluss auf die Reprogrammierung Effizienz.

Es wichtig ist, Fibroblasten zu erzeugen, wie frisch und gesund wie möglich. Für Explantatkultur Verfahren können Fibroblasten verwendet werden, bevor sieben Tage nach der Explant...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir sind dankbar für die fachkundige technische Unterstützung durch den UNC Flow Cytometry Core und den UNC Microscopy Core. Wir danken den Mitgliedern des Qian-Labors und des Liu-Labors für hilfreiche Diskussionen und kritische Rezensionen des Manuskripts. Diese Studie wurde unterstützt durch den NIH/NHLBI R00 HL109079 Grant an Dr. Liu und den Scientist Development Grant 13SDG17060010 der American Heart Association (AHA) und den New Scholar Grant AG-NS-1064-13 der Ellison Medical Foundation (EMF) an Dr. Qian.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
antikardiales Troponin TThermo ScientificMS-295-PO1:200 für FACS und 1:400 für ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 für FACS und ICC
anti-aActininSigma-AldrichA78111:500 für FACS und ICC
anti-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 für  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1.000 für ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 für ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 für ICC
Alexa Fluor 488– konjugierter Esel Anti-Kaninchen IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 sowohl für FACS als auch ICC
Alexa Fluor 647– konjugiertes Esel-Anti-Maus-IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 für FACS und ICC
Cytofix/Cytoperm Kit für intrazelluläre FärbungBD Biosciences554722
Rhod-3 Calcium Imaging KitLife TechnologiesR10145
Thy1.2 MikrokügelchenMiltenyi Biotec130-049-101
Vectashield Lösung mit DAPIVector LabsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Trypsin-EDTA (0.05%)Corning25-052
PRMI1640 MediumLife Technologies11875-093
B27 ErgänzungLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Reduziertes Serum MediumLife Technologies31985-070
M199 MediumLife Technologies10-060
DMEM, hoher GlukosegehaltLife Technologies10-013
Penicillin-StreptomycinCorning30-002
Nicht-essentielle AminosäurenLife Technologies11130-050
Lipofectamine 2000Life Technologies11668500
BlasticidinLife TechnologiesA11139-03
PuromycinLife TechnologiesA11138-03
Kollagenase IIWorthingtonLS004176
PolybrenMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl< sub>2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlukoseSigma-AldrichG6152
RinderserumalbuminFisher9048-46-8
ParaformaldehydEMS15714
Retrovirus-FällungslösungALSTEMVC-200
0,4% Trypanblau-LösungSigma-AldrichT8154
GelatineSigma-AldrichG1393
Dulbecco's PBS ohne CaCl2 und MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Corning21022
LS SäuleMiltenyi Biotec130-042-401
0,45 μ M Celluloseacetat-Filter Thermo Scientific190-2545
24-Well-PlattenCorning3524
10 cm Gewebekulturschalen Thermo Scientific172958
60 mm Zentrierschale  Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylen Deep Well PlateDenville ScientificP9639
Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden und Zellsiebkappe BD Biosciences352235
ZentrifugeEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging SystemLife TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
Rundglas-DeckglasElektronenmikroskopie Sciences72195-15

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