Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Das Ziel des Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie fluoreszenzmarkierte Proteindynamik zu Pflanzenzelloberflächen mit variablem Winkel Epifluoreszenzmikroskopie, die blinkende Punkte von GFP-markiertem PATROL1 ein Membrantransportprotein zu überwachen, in der Zelle Kortex der Stomata Komplex in Arabidopsis thaliana.

Zusammenfassung

Die Zelloberfläche einer Pflanze ist ihre Schnittstelle für die Wahrnehmung von Umweltreizen; sie reagiert mit zellbiologischen Veränderungen wie Membrantransport und Umlagerung des Zytoskeletts. Die Echtzeit- und hochauflösende Bildanalyse solcher intrazellulärer Ereignisse wird das Verständnis der pflanzlichen Zellbiologie auf molekularer Ebene verbessern. Die Epifluoreszenzmikroskopie mit variablem Winkel (VAEM) ist eine aufstrebende Technik, die qualitativ hochwertige Zeitrafferbilder von fluoreszenzmarkierten Proteinen auf der Oberfläche von Pflanzenzellen liefert. In diesem Artikel werden praktische Vorgehensweisen für die Vorbereitung von VAEM-Proben, die Einstellung des optischen VAEM-Systems, die Filmaufnahme und die Bildanalyse beschrieben. Als Beispiel für die VAEM-Beobachtung werden repräsentative Ergebnisse zur Dynamik von PATROL1 vorgestellt. Es handelt sich um ein Protein, das für die Bewegung der Stomata essentiell ist und vermutlich an der Abgabe von Protonenpumpen an die Plasmamembranen im Stomatakomplex von Arabidopsis thaliana beteiligt ist. Die VAEM-Echtzeitbeobachtung von Schließzellen und Nebenzellen in A. thaliana-Keimblättern zeigte, dass fluoreszenzmarkierte PATROL1 für mehrere Sekunden als punktförmige Strukturen auf Plasmamembranen erschienen und dann verschwanden. Die Kymographenanalyse von VAEM-Filmdaten bestimmte die zeitliche Verteilung des Vorhandenseins (die sogenannte "Verweilzeit") der punktförmigen Strukturen. Die Verwendung von VAEM wird im Rahmen dieses Beispiels erläutert.

Einleitung

Die Oberfläche der Pflanzenzelle, einschließlich der Plasmamembran und ihres unmittelbar angrenzenden Zytoplasmas, ist die Hauptregion der Wahrnehmung und Integration biotischer und abiotischer Signale aus der extrazellulären Umgebung durch eine Pflanzenzelle. Als Reaktion auf diese Signale verändern sich die Komponenten der Zelloberfläche, einschließlich der Plasmamembranproteine und des kortikalen Zytoskeletts, dynamisch auf einer Zeitskala von Sekunden bis Minuten^1-4. So kann die hochauflösende Bildgebung von fluoreszierenden Proteinen auf der Zelloberfläche in Echtzeit die Reaktionen einer Pflanze auf Umweltreize auf molekularer Ebene beleuchten.

Protokoll

1. Herstellung von Jungpflanzen

1. Sterilisieren Sie die Samen.
   1. Vorbereitung der Sterilisationslösung durch Zugabe von 500 & mgr; l NaClO (verfügbares Chlor: 5,0%) und 1 ul 10% Triton X-100 und 500 & mgr; l sterilem Wasser.
   2. Platz ca. 10 transgenen A. thaliana Samen tragenden GFP-PATROL1 ⁸ in ein 1,5-ml-Tube.
   3. 1 ml 70% Ethanol-Lösung, und gut mischen durch Invertieren fünfmal. Lassen Sie für 1 min.
   4. Beobachten die Samen zu Boden sinken, der Röhre. In einem sauberen Sterilbank, entfernen Sie vorsichtig die 70% Ethanol mit einer Mikropipette, und fügen Sie 1 ml Sterilisationslösung. Gut mischen du....

Ergebnisse

In diesem Video-Artikel, der Protokolle für vaem Beobachtung der GFP-PATROL1 in A. thaliana cotyledon Stomata komplexen Zellen werden zur Verfügung gestellt. Sky Drop Montage ist ein einfaches Herstellungsverfahren, die dazu beitragen, das Auftreten von Luftblasen in vaem Zubereitungen von A. kann thaliana Cotyledonen (Abbildung 1). Hoher Neigungswinkel der Eintritts Laser und / oder z-Positionierung von Proben für vaem liefert ein unklares Bild. Wenn das geschieht, ist es emp.......

Diskussion

In diesem Video-Artikel werden Protokolle zur Überwachung und Messung des dynamischen Verhaltens des GFP-PATROL1 Punkte auf der Stomata Komplex aus Arabidopsis thaliana angegeben. Wie hier gezeigt, ist vaem Beobachtung ein leistungsfähiges Werkzeug für Live-Imaging von Pflanzenzelloberflächen. Unter den für die GFP-PATROL1 Überwachungs hier verwendeten experimentellen Bedingungen gab es sehr wenig Fluoreszenzphotobleichen in der Probe für 1 Minute zur Videoaufzeichnung verwendet wird, weil die hochsensiblen EM-.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Inverses Mikroskop	Olympus	IX-73
TIRF-Einheit	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF-Objektiv	Olympus	UAPON 100 & mal; OTIRF	NA = 1,49
Laserwinkel-Steuerbox	Chuo Seiki	QT-AK
Optisch gepumpter Halbleiterlaser	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510– 550 nm Bandpassfilter	Olympus	U-FBNA
EM CCD-Kamera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-Mount Kamera Vergrößerungswechseleinheit	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph Software	Molecular Devices	MetaMorph Version 7.7.11.0
TIRF-Mikroskopie-Handbuch	Olympus	AX7385	Anleitung: Total Internal Reflection Illumination System (Gedruckt in Japan am 24. August 2012)
Immersionsöl	Olympus	Immersionsöl Typr-F	ne = 1,518 (23 Grad)