Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

Summary

Das Ziel des Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie fluoreszenzmarkierte Proteindynamik zu Pflanzenzelloberflächen mit variablem Winkel Epifluoreszenzmikroskopie, die blinkende Punkte von GFP-markiertem PATROL1 ein Membrantransportprotein zu überwachen, in der Zelle Kortex der Stomata Komplex in Arabidopsis thaliana.

Abstract

Die Zelloberfläche einer Pflanze ist ihre Schnittstelle für die Wahrnehmung von Umweltreizen; sie reagiert mit zellbiologischen Veränderungen wie Membrantransport und Umlagerung des Zytoskeletts. Die Echtzeit- und hochauflösende Bildanalyse solcher intrazellulärer Ereignisse wird das Verständnis der pflanzlichen Zellbiologie auf molekularer Ebene verbessern. Die Epifluoreszenzmikroskopie mit variablem Winkel (VAEM) ist eine aufstrebende Technik, die qualitativ hochwertige Zeitrafferbilder von fluoreszenzmarkierten Proteinen auf der Oberfläche von Pflanzenzellen liefert. In diesem Artikel werden praktische Vorgehensweisen für die Vorbereitung von VAEM-Proben, die Einstellung des optischen VAEM-Systems, die Filmaufnahme und die Bildanalyse beschrieben. Als Beispiel für die VAEM-Beobachtung werden repräsentative Ergebnisse zur Dynamik von PATROL1 vorgestellt. Es handelt sich um ein Protein, das für die Bewegung der Stomata essentiell ist und vermutlich an der Abgabe von Protonenpumpen an die Plasmamembranen im Stomatakomplex von Arabidopsis thaliana beteiligt ist. Die VAEM-Echtzeitbeobachtung von Schließzellen und Nebenzellen in A. thaliana-Keimblättern zeigte, dass fluoreszenzmarkierte PATROL1 für mehrere Sekunden als punktförmige Strukturen auf Plasmamembranen erschienen und dann verschwanden. Die Kymographenanalyse von VAEM-Filmdaten bestimmte die zeitliche Verteilung des Vorhandenseins (die sogenannte "Verweilzeit") der punktförmigen Strukturen. Die Verwendung von VAEM wird im Rahmen dieses Beispiels erläutert.

Introduction

Die Oberfläche der Pflanzenzelle, einschließlich der Plasmamembran und ihres unmittelbar angrenzenden Zytoplasmas, ist die Hauptregion der Wahrnehmung und Integration biotischer und abiotischer Signale aus der extrazellulären Umgebung durch eine Pflanzenzelle. Als Reaktion auf diese Signale verändern sich die Komponenten der Zelloberfläche, einschließlich der Plasmamembranproteine und des kortikalen Zytoskeletts, dynamisch auf einer Zeitskala von Sekunden bis Minuten^1-4. So kann die hochauflösende Bildgebung von fluoreszierenden Proteinen auf der Zelloberfläche in Echtzeit die Reaktionen einer Pflanze auf Umweltreize auf molekularer Ebene beleuchten.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bestimmung der Lokalisierung von fluoreszenzmarkierten Proteinen³, jedoch ist es oft schwierig, die Echtzeit-Proteindynamik aufgrund ihrer relativ langen Erfassungszeiten zu überwachen. Eine aufstrebende Technik zur Echtzeitüberwachung von Proteinen in der Pflanzenzelle ist die Epifluoreszenzmikroskopie mit variablem Winkel (VAEM), eine Anpassung von Geräten, die üblicherweise für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) verwendet werden. In der TIRF-Mikroskopie ist die Fluoreszenzanregungslichtquelle ein evaneszentes Lichtfeld, das erzeugt wird, wenn der Eintrittswinkel des Lasers flach genug ist, um das Licht an der Glas-Wasser-Grenzfläche vollständig intern zu reflektieren. Die Eindringtiefe des evaneszenten Lichtfeldes liegt bei etwa 100 nm. Die TIRF-Mikroskopie ist ein hervorragendes Werkzeug für die Einzelmolekül-Bildgebung, wie z. B. den Nachweis von Exozytose in tierischen Zellen⁵. Flüchtiges Licht kann jedoch weder die Plasmamembranen noch das kortikale Zytoplasma in Pflanzenzellen erreichen, da diese dicke Zellwände haben. Kürzlich wurden TIRF-Mikroskopiegeräte von Pflanzenzellbiologen angepasst, indem sie beobachteten, dass ein Laser, wenn er etwas tiefer abgewinkelt wird als bei der Verwendung zur Induktion von Totalreflexionsphänomenen, die Oberfläche von Pflanzenzellproben anregen kann, was zu einer qualitativ hochwertigen Bildgebung von Pflanzenzellen führt^6,7. Die Beleuchtungstiefe der Anregung wird durch Einstellen des Eintrittswinkels des Lasers variiert. Daher wird diese Technik als VAEM bezeichnet. Dieses optische System wird auch als TIRF-Mikroskopie mit variablem Winkel (VA-TIRFM) bezeichnet, da die Möglichkeit besteht, dass eine Totalreflexion an der Zellwand-Periplasma-Grenzfläche⁷ stattfinden kann, jedoch wird in diesem Artikel der Begriff VAEM verwendet, wie aus dem ersten Bericht in Pflanzen⁶ hervorgeht.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, praktische Verfahren zur Verwendung von VAEM zur Visualisierung der Dynamik fluoreszenzmarkierter Proteine auf pflanzlichen Zelloberflächen zu demonstrieren. Zusätzlich wird ein Bildanalyseprotokoll zur Quantifizierung der Verweilzeit (Anwesenheitsdauer) von Molekülen für die VAEM-Filmanalyse beschrieben. Als Beispiel wird der GFP-PATROL1 blinkende Punkt auf stomatalen Komplexzellen in Arabidopsis thaliana Keimblättern verwendet. PATROL1 wurde durch vorwärtsgenetische Ansätze als kausales Gen einer stomatalen Response-Defekt-Mutante in A. thaliana⁸ identifiziert. PATROL1 ist ein pflanzliches Homolog von MUNC-13, das ein Priming-Faktor bei der Synapsenvesikel-Exozytose⁸ ist. Es wird angenommen, dass PATROL1 als Reaktion auf Umwelteinflüsse wie Licht oder Feuchtigkeit die Abgabe einer Protonenpumpe an die Plasmamembranen im Stomatakomplex reversibel reguliert. Stomatakomplexe bestehen jeweils aus einem Paar Schließzellen⁸ und Nebenzellen⁹ und benötigen eine Protonenpumpe für die Bewegung der Stomata. In diesen Zellen lokalisiert GFP-markiertes PATROL1 an punktförmigen Strukturen, die weniger als 1 Minute auf der Plasmamembran verbleiben⁹.

Protocol

1. Herstellung von Jungpflanzen

1. Sterilisieren Sie die Samen.
   1. Vorbereitung der Sterilisationslösung durch Zugabe von 500 & mgr; l NaClO (verfügbares Chlor: 5,0%) und 1 ul 10% Triton X-100 und 500 & mgr; l sterilem Wasser.
   2. Platz ca. 10 transgenen A. thaliana Samen tragenden GFP-PATROL1 ⁸ in ein 1,5-ml-Tube.
   3. 1 ml 70% Ethanol-Lösung, und gut mischen durch Invertieren fünfmal. Lassen Sie für 1 min.
   4. Beobachten die Samen zu Boden sinken, der Röhre. In einem sauberen Sterilbank, entfernen Sie vorsichtig die 70% Ethanol mit einer Mikropipette, und fügen Sie 1 ml Sterilisationslösung. Gut mischen durch Invertieren fünf Mal und lassen Sie für 5 min.
   5. Die Samen zu waschen. Arbeiten noch unter aseptischen Bedingungen auf einer sauberen Werkbank, entfernen Sie vorsichtig die Lösung mit einer Mikropipette, und fügen Sie 1 ml sterilem Wasser. Wiederholen Sie dies fünf Mal. Die sterilisierten Samen können in sterilem Wasser bei 4 ° C für 2 Tage aufbewahrt werden.
2. Alsow den sterilisierten Samen auf einem 0,5% Gellangummi verfestigt 1/2 Murashige und Skoog Medium Platte (pH 5,8) ^9. Band der Deckel auf die Platte unter Verwendung von zwei Schichten von chirurgischem Band.
3. Inkubieren der Platte in der Dunkelheit bei 4 ° C mit einem kalten Speicherraum, O / N.
4. Übertragen Sie die Platte in eine Wachstumskammer bei 23,5 ° C mit einer 12-Stunden / 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus unter Verwendung von 100 & mgr; mol ^m -2 ^s -1 weiße Lichter gesetzt, und Inkubation für 7 Tage. Sämlinge mit Keimblättern von etwa 1 mm lang kann dann geerntet werden.

2. Sky Tropfen Montage der Cotyledon Proben

HINWEIS: Ein wichtiger Faktor bei der Probenvorbereitung für vaem Beobachtung wird die Vermeidung der Einschluss von Luftblasen zwischen der Probe und dem Deckglas. Bubbles die Bildqualität von vaem erheblich reduzieren, indem Unterschiede im Brechungsindex. Eine einfache Methode, die wir "Himmel Drop" genannt Montage kann verwendet werden, um Blasen zu vermeidenzwischen der A. thaliana Keimblätter und das Deckglas. Dieses ist unmittelbar vor der Beobachtung durchgeführt werden.

1. Werden 30 ul Basalpuffer [5 mM 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure-Tris (MES-Tris) bei pH 6,5, 50 mM KCl, 100 uM _CaCl & sub2;] auf dem Zentrum eines Glasobjektträgers (Größe: 76 × 26 mm, Dicke: 1,0 bis 1,2 mm).
2. Entfernen Sie ein Keimblatt aus einem 7-Tage-alten Keimling mit Präparierscheren. Schwimmer den Kotyledonen mit der Beobachtungsseite nach oben auf dem Basalpuffer Abfall (Abbildung 1, Schritt 1).
3. Werden 30 ul Basalpuffer auf der Mitte eines Deckglases (Größe: 18 × 18 mm, Dicke: 0,12-0,17 mm) (Abbildung 1, Schritt 2). Drehen Sie das Deckglas auf den Kopf sanft. Die Oberflächenspannung wird die Puffertropfen herunterfällt. Halten Sie das Deckglas mit einer Pinzette an einer Kante. Platzieren der gegenüberliegenden Kante auf dem Glasträger, so dass der Puffer Abfall ist etwa über dem Keimblatt.
4. Mit der Kante des Deckglases noch auf der Folie, und immer noch das gegenüberliegende Kante mit einer Pinzette, passen die Position des Pufferabfall unter dem Deckglas, so daß es unmittelbar oberhalb des Keimblattprobe (1, Schritt 3). Lassen Sie das Deckglas. Montieren Sie einen Tropfen auf die Probe, was zu einem Präparat ohne Luftblasen.
5. Wischen Sie überschüssiges Puffer mit fusselfreien Gewebe. Beobachten Sie sofort die Vorbereitung (siehe Schritt 3).
   HINWEIS: Es ist nicht notwendig, um die Proben zu versiegeln.

3. vaem Beobachtung und Film-Übernahme

HINWEIS: Ein invertiertes Mikroskop ist mit einem TIRF Einheit und einer TIRF Objektivlinse mit einer numerischen Apertur von 1,49 ausgestattet: Die TIRF Mikroskopsystem ^{9 in} der vorliegenden Studie verwendet wird wie folgt beschrieben. Für computergestützte Steuerung der Lasereintrittswinkel wird ein Steuerfeld verwendet. Grün fluoreszierendes Protein (GFP) erregt wird mit einer 488 nm optisch gepumpte Halbleiterlaser und ter Fluoreszenz wird durch einen 510-550 nm Bandpassfilters erfasst wird, um die Autofluoreszenz von Chloroplasten verhindern. Die gemessene Maximalwert des Faserausgangsleistung von 13,0 bis 13,5 mW. Für den Nachweis, eine Elektronenvervielfachungs charge-coupled device (EM-CCD) Kamera-Kopf-System und ein C-Mount-Kamera Vergrößerungsänderungseinheit verwendet.

1. Kalibrieren der Laser Zentrierung und Fokussierung entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für eine präzise vaem Beobachtungen. Es wird dringend empfohlen, dass regelmäßige Kontrollen der Laserpfad Bereinigungsverfahren, die zu Ihrem Mikroskop durchgeführt werden.
   1. Bestimmen Sie die zentrale Lage mit einer Objektivlinse freie Lichtpfad an der Decke der Mikroskopie Raum beleuchtet. Um die zentrale Position zu markieren, setzen Sie einen farbigen Kreis Dichtung an der Decke (Abbildung 2, Stufe 1, 2).
   2. Beleuchten die Decke mit einer Objektivlinse (Abbildung 2, Schritt 3, 4). Bewegen Sie den illuminated Region in die Mittelstellung (Abbildung 2, Schritt 5). Fokus des Lasers (Abbildung 2, Schritt 6). Feinabstimmung der Position des fokussierten Laserstrahls auf die Mitte (Abbildung 2, Schritt 7).
2. Legen Sie ein Objekt auf den Tisch des Mikroskops und wählen Sie Zellen für die Beobachtung mit Hellfeldbeleuchtung.
3. Überprüfen Sie, dass das fluoreszierende Protein in den Zellen beobachtet werden, und stellen Sie die z-Achse Position an der Zelloberfläche unter Verwendung von Epifluoreszenz-Beleuchtung (3A).
4. Führen vaem Beobachtungen.
   1. Neigen Sie den Eintrittswinkel des Laserstrahls allmählich mit der Controller-Box. Zur gleichen Zeit, zu überwachen das Live-Bild sorgfältig. Zunächst wird das Bild unscharf werden (3B).
   2. Da die Laserwinkel zunimmt, wird die vaem Bild weniger unscharf werden, was schließlich eine klare Bild (3C und D). An dieser Stelle aufhören Increasingen die Laserwinkel. Wenn das Fluoreszenz-Signal verloren gegangen ist, zu verringern, um einen flacheren Winkel.
   3. Feinabstimmung der Lasereintrittswinkel, um ein besseres Bild zu erhalten. Feinabstimmung der Z-Achsen-Position kann auch das Bild zu verbessern. Passen Sie bei Bedarf die optischen Parameter (Laserleistung, Wellenlänge und Filtersatz) und die Bildsensorparameter [Bildgröße, Belichtungszeit, Verstärkung, Digitizer und Elektronen-Multiplikation (EM) Verstärkung].
      HINWEIS: In dem oben beschriebenen Fall der TIRF Mikroskopausrüstung, sind wie folgt repräsentativen Parametern. Vergrößerung der Linse direkt vor der Kamera: 2X; Laserleistung: 1,0 mW; Bildgröße: 512 x 512 Pixel; Belichtungszeit: 100 ms; Gewinnen: 5 x; Digitizer: 11 MHz; und EM-Gewinn: 100.
5. Erwerben Sie einen Film als eine mehrseitige TIFF-Image-Datei mit der kommerziellen Mikroskop-Software. Hierbei ist von GFP-markierten Punkte blinkt auf der Oberfläche der Spaltöffnungszellen der Film.
   HINWEIS: Vertreter Bildaufnahme Bedingungen sind wie folTiefen. Erfassungsmodus: Strom in den RAM; Anzahl der Frames: 600; und mehrseitige TIFF-Dateigröße: ~ 302 MB.

4. Kymograph Analyse zur Quantifizierung von GFP-markierten Dot Verweilzeit Mit Fiji Software

1. Installieren Fidschi ("Fidschi ist nur ImageJ) Software ¹⁰ Verwendung der Autoren Anweisungen (http://fiji.sc/Fiji).
2. Führen Fiji und öffnen Sie die erworbenen mehrseitige TIFF-Datei mit Hilfe des Fidschi-Menü "Datei-Öffnen".
3. Platzieren Sie eine Linie auf der Stelle von Interesse, mit der Fidschi-Werkzeugleiste Menü "Straight Line Selection Tool". Optional können Sie die "Segmented Linie Selection Tool" oder "Freihandlinie Selection Tool". In den hier vorgestellten Ergebnisse, wurde eine gerade Linie von 100 Pixeln (entsprechend 8,0 & mgr; m) auf einer Tochterzelle (4A) platziert.
4. Einen kymograph Bildes im Menü Fiji "Bild-Stacks-Dynamische Reslice "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (4B). Optional "Vertikal spiegeln" und "Um 90 Degrees" in einem Kontrollkästchen Fenster sind ebenfalls verfügbar (nicht in den hier vorgestellten Ergebnisse verwendet). Die x- und y-Achse in der kymograph Bild zeigen die Linienposition (100 Pixeln entsprechend 8,0 & mgr; m) und Beobachtungszeit (600 Pixel entsprechend 60 sec) bezeichnet. Wenn die kymograph Bild nicht zufriedenstellend ist, die Position und die Art (gerade, segmentiert und Freihand) der Linie auf mehrseitige Bild der geändert werden kann. Als die Linie ändert, ändert dynamisch die kymograph Bild. Speichern Sie eine kymograph Bild als TIFF-Datei über das Menü Fiji "Datei-Speichern unter-Tiff".
5. Messen der Länge des Tropfens in der Ausrichtung der Zeitachse.
   1. Zur Geräuschreduzierung durchführen, tragen Sie eine Gauß-Filter auf die kymograph Bilder mit der Fidschi-Menü "Process-Filter-Gaußschen Weichzeichner". Die "Sigma (Radius) "Parameter abstimmbar (1 Pixel Radius wird für die vorgestellten Ergebnisse verwendet).
   2. Segment die Signalbereiche durch Schwellen, über das Menü Fiji "Bild-Adjust-Threshold".
      HINWEIS: Es gibt mehrere Schwellen Algorithmen zur Auswahl. Dargestellt Ergebnissen wurde die "Yen" Algorithmus ausgewählt (4C).
   3. Bereiten Sie, um die Zeit (y) messen -Achse Länge des Blobs über das Menü "Analysieren-Set Messungen". Überprüfen Sie die "Begrenzungsrechteck" im Fenster "Set Messungen". Im Idealfall sollte die Fläche so klein wie möglich sein, um Rauschen auszuschließen. Hier wurde die Mindestfläche auf 50 Pixel festgelegt. Messen Sie die Zeit (y) -Achse Länge des Blobs über das Menü "Analysieren Analysieren-Particles". Um die Ergebniswerte zu erhalten und zu beweisen, Glaubwürdigkeit der Messbereiche, überprüfen Sie die "Ergebnisse" und "In-Manager </ em> "Boxen.
   4. Werte in der Spalte "Größe" gibt die Zeit (y) -Achse Längen für die gemessene Blob (4D). Speichern Sie die Werte mit der Ergebnistabelle Menü "Datei-Speichern unter" und berechnen und zu verarbeiten, die Datenmenge der Bild blob Dauern unter Verwendung eines statistischen Verpackung und / oder Tabellenkalkulationsprogramm (4E).

Results

In diesem Video-Artikel, der Protokolle für vaem Beobachtung der GFP-PATROL1 in A. thaliana cotyledon Stomata komplexen Zellen werden zur Verfügung gestellt. Sky Drop Montage ist ein einfaches Herstellungsverfahren, die dazu beitragen, das Auftreten von Luftblasen in vaem Zubereitungen von A. kann thaliana Cotyledonen (Abbildung 1). Hoher Neigungswinkel der Eintritts Laser und / oder z-Positionierung von Proben für vaem liefert ein unklares Bild. Wenn das geschieht, ist es emp...

Discussion

In diesem Video-Artikel werden Protokolle zur Überwachung und Messung des dynamischen Verhaltens des GFP-PATROL1 Punkte auf der Stomata Komplex aus Arabidopsis thaliana angegeben. Wie hier gezeigt, ist vaem Beobachtung ein leistungsfähiges Werkzeug für Live-Imaging von Pflanzenzelloberflächen. Unter den für die GFP-PATROL1 Überwachungs hier verwendeten experimentellen Bedingungen gab es sehr wenig Fluoreszenzphotobleichen in der Probe für 1 Minute zur Videoaufzeichnung verwendet wird, weil die hochsensiblen EM-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverses Mikroskop	Olympus	IX-73
TIRF-Einheit	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF-Objektiv	Olympus	UAPON 100 & mal; OTIRF	NA = 1,49
Laserwinkel-Steuerbox	Chuo Seiki	QT-AK
Optisch gepumpter Halbleiterlaser	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510– 550 nm Bandpassfilter	Olympus	U-FBNA
EM CCD-Kamera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-Mount Kamera Vergrößerungswechseleinheit	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph Software	Molecular Devices	MetaMorph Version 7.7.11.0
TIRF-Mikroskopie-Handbuch	Olympus	AX7385	Anleitung: Total Internal Reflection Illumination System (Gedruckt in Japan am 24. August 2012)
Immersionsöl	Olympus	Immersionsöl Typr-F	ne = 1,518 (23 Grad)