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Methodenartikel

A Novel Mikromodell für Heterotope, En Bloc Brustwand, Thymus und Herz-Transplantation bei Mäusen

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DOI:

10.3791/53442

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23. Januar 2016

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1Johns Hopkins University School of Medicine, 2Burn and Complex Wound Center, 3Section of Plastic and Reconstructive Surgery, University of Chicago Medical Center, 4Division of Plastic, Reconstructive, and Maxillofacial Surgery, R Adams Cowley Shock Trauma Center, 5Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Lab, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um die kombinierte Allotransplantation von soliden Organen und vaskularisierten Kompositen zu untersuchen, beschreiben wir ein neuartiges heterotopes En-bloc-Modell für Brustwand-, Thymus- und Herztransplantationen bei Mäusen unter Verwendung einer zervikalen Non-Sewure-Manschettentechnik.

Zusammenfassung

Die Erforschung neuartiger Strategien bei der Organtransplantation zur Verlängerung des Überlebens von Allotransplantaten und zur Minimierung des Bedarfs an langfristiger Immunsuppression muss verfolgt werden. Der Einsatz einer vaskularisierten Knochenmarktransplantation und einer Co-Transplantation des Thymus haben sich in dieser Hinsicht in verschiedenen Tiermodellen als vielversprechend erwiesen. 1-11 Die vaskularisierte Knochenmarktransplantation ermöglicht den ununterbrochenen Transfer von Spenderknochenmarkzellen innerhalb der konservierten Spendermikroumgebung, und die Einbeziehung von Thymusgewebe in die vaskularisierte Knochenmarktransplantation hat gezeigt, dass sie den T-Zell-Chimärismus erhöht, was letztendlich eine unterstützende Rolle bei der Induktion der Immunregulation spielt. Die Kombination aus solider Organ- und vaskularisierter Komposit-Allotransplantation kann diese Strategien in Form eines neuartigen Transplantationsmodells auf einzigartige Weise kombinieren. Mausmodelle dienen als hervorragendes Paradigma zur Erforschung der Mechanismen der akuten und chronischen Abstoßung, des Chimärismus und der Toleranzinduktion und bilden damit die Grundlage für die Verbreitung überlegener Überlebensstrategien von Allotransplantaten für größere Tiermodelle und zukünftige klinische Anwendungen. In dieser Arbeit entwickelten wir ein neuartiges heterotopes En-bloc-Modell für Brustwand-, Thymus- und Herztransplantationen bei Mäusen unter Verwendung einer zervikalen Non-Seam-Manschettentechnik. Die Erfahrungen mit syngenen und allogenen Transplantationssettings werden für zukünftige breitere immunologische Untersuchungen in einem Lehrmanuskript und einer Videoergänzung beschrieben.

Einleitung

Herztransplantation ist die Behandlung der Wahl bei Herzinsuffizienz im Endstadium. Sowohl technische Fortschritte als auch pharmakologische Innovationen haben dazu geführt, dass das Feld frühzeitig Transplantatakzeptanzraten von über 90 % erreicht hat. 12,13 Trotzdem ist das 5-Jahres-Überleben des Transplantats von 60-80% zum Stillstand gekommen und eine chronische Abstoßung, die durch eine Transplantatvaskulopathie gekennzeichnet ist, bleibt unvermeidlich. 14-16 Darüber hinaus werden die Patienten mehreren chirurgischen Eingriffen und lebenslanger Immunsuppression unterzogen, die mit Brustwanddeformitäten bzw. medizinischen Folgeerscheinungen bzw. Toxizitäten verbunden sind. Der Bedarf an innovativen Ansätzen, um das Überleben von Allotransplantaten zu verlängern, den immunsuppressiven Bedarf zu minimieren und rekonstruktive Optionen für anatomische Deformitäten anzubieten, ist dringend.

Vaskularisierte Komposit-Allotransplantation bietet eine einzigartige Strategie zur Verbesserung der Ergebnisse von Herztransplantationen, sowohl aus immunologischer als auch aus rekonstruktiver Sicht. 17 Vaskularisierte Komposit-Allotransplantate sind auch insofern einzigartig, als sie eine inhärente Quelle für von Spendern stammende hämatopoetische Stammzellen aufweisen, die eine günstige Fähigkeit gezeigt haben, die Immunsuppression zu reduzieren und gemischten Chimärismus zu induzieren und aufrechtzuerhalten. 1-8 Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Co-Transplantation des Thymus das Überleben sowohl von soliden Organtransplantaten als auch von vaskularisierten Komposit-Allotransplantaten verlängert. 2,9-11 Die Kombination dieser Strategien mit einer Herztransplantation bietet eine neuartige Lösung für die oben genannten Herausforderungen bei der Herztransplantation. 18

Mausmodelle dienen aufgrund der Verfügbarkeit von Antikörpern und gut definierten Inzucht- und Knockout-Stämmen als hervorragende Plattformen für mechanistische in vivo-Untersuchungen. Obwohl die Herztransplantation bei Mäusen üblicherweise mit einem heterotopen intraabdominalen mikrochirurgischen Nahttransplantationsmodell22-25 untersucht wird, hat sich ein heterotopes, zervikales, nicht nahtes Manschettentechnikmodell als extrem replizierbar und zuverlässig erwiesen und weist weniger Thromboseraten auf. 19,26,27 Das Ziel dieser Studie ist es, eine heterotope en bloc osteomyokutane Brustwand-, Thymus- und Herztransplantationstechnik bei Mäusen zu entwickeln, um die immunologischen Mechanismen der kombinierten soliden Organ- und vaskularisierten Komposit-Allotransplantation unter Verwendung einer zervikalen Non-Seam-Cuff-Technik zu untersuchen. Dieses Cluster-Allotransplantat wird durch die Anastomose der Spenderin perfundiert, die Aorta descending zur rechten Arteria carotis communis und die Spenderpulmonalarterie zur rechten Vena jugularis externa. Der Erhalt der inneren Brustgefäße und der zugehörigen Thymusäste ist für die Perfusion der Brustwand (Brustbein, Rippen, Muskeln und Haut) und des Thymus von größter Bedeutung.

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Protokoll

Alle operativen Eingriffe wurden in Übereinstimmung mit der Johns Hopkins University und den Vereinigten Staaten Department of Agriculture and Public Health Service Anforderungen abgeschlossen ist. Dieses Protokoll folgt der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Ausschuss billigte Institutional Review Board Richtlinien (Protokollnummer M013M490). Endgültigen Überlebensdaten wurden für die unten beschriebenen chirurgischen Verfahren aufgezeichnet. Spender und Empfänger Tiere erhalten vorbeugende Anästhesie mit Buprenorphin bei 0,1 mg / kg sc eine Stunde vor der Operation und in der Empfängertier Buprenorphin in der gleichen Dosis nach der Transplantation erneut verabreicht und erneut dosiert, wie in den ersten 48 Stunden benötigten nach der Operation.

1. Donor Allograft Rettung

Hinweis: Beginnen Sie den Geberteil des Transplantates 40 Minuten früher als die Empfänger der Transplantation an Empfänger Anästhesiezeit zu minimieren und gleichzeitig eine Endzeit oder leicht Ohr zu erleichternlier Endzeit gegenüber dem Empfänger Vorbereitung.

  1. Verwenden Sie Standard-sterile mikrochirurgische Instrumente und sterile Handschuhe für das Verfahren. Unser Labor verwendet Autoklaven Sterilisation von mikrochirurgischen Instrumenten.
  2. Betäuben die Spendermaus (männlich) mit Isofluran Induktions Verdampfer bei 4%. Verwendung atraumatischer mechanische Knipser entfernen Sie die Haare von der Hals-, Brust- und Bauchbereich. Legen Sie das Tier in Rückenlage und zu pflegen Isofluran auf 1-2% durch einen Nasenkegel. Für ausreichende Anästhesie während des gesamten Verfahrens durch periodische Bewertung der Zehe Prise Rückzug Reflex.
  3. Vor der Hautschnitt, die weithin die operative Vorbereitung, indem Povidoniod antiseptische gefolgt von Isopropylalkohol mit einem sterilen Wattestäbchen.
  4. Beginnen Sie mit einer oberflächlichen Querhautschnitt mit einer Schere in der Hals- und Bauchhaut. Verbinden Sie die beiden Einschnitte bilateral entlang der mittleren Axillarlinie Linien.
  5. Mit Hilfe mikrochirurgischen Zangesezieren die Halsregion auf bilateraler Ebene zu identifizieren, zu ligieren, und teilen Sie die externen Jugularvenen mit 6-0 Seidennaht und Schere. Dann mit Elektrokauter teilen die sternocleidomastoideus, um die internen Jugularvenen und Arteria carotis communis bilateral freizulegen. Übergeben Sie einen 6-0 Seidennaht unter dem linksseitigen und dem rechtsseitigen A. carotis und Vena jugularis interna in Groß Mode.
    HINWEIS: Es wird gebunden und später in Schritt 1.9 aufgeteilt.
  6. Stark unterteilen die Halsmuskulatur und die damit verbundenen lockeren Zellgewebe, um die Luftröhre befindet vorderen, mit einer Schere, um die übrigen Anhänge der HWS zu befreien.
  7. Verwendung von bipolaren Elektrokauter und scharfe Dissektion, teilen Sie die großen Brustmuskeln und Schlüsselbeine, um die Schlüsselbeingefäße und Ligat (6-0 Seidennaht) freizulegen und teilen proximal.
  8. Als nächstes sanft, erfassen und das Tier Penis zurückzuziehen. Entlang des Rückens des Penis visualisieren die dorsale Vene des Penis, und desinfizieren Sie dieRegion mit Isopropylalkohol. Verwendung einer 30-G Nadel injiziert 30.000 Einheiten Heparin intravenös durch die dorsale Vene und erlauben den Penis wieder in seine ursprüngliche Position zurückweichen. Teil Leckage der Heparinlösung in das umgebende Gewebe auftreten.
  9. Mit den zuvor platzierten Groß Krawatten um Arteria carotis communis und V. jugularis interna, abzubinden und teilen die Strukturen, auf bilateraler Ebene.
  10. Nächste Verwendung einer Schere, um eine Quer intrabdominal Einschnitt zu machen. Ausweiden den Darm, um die infrahepatische unteren Hohlvene zu entlarven und zu injizieren 2 ml kaltem Euro-Collins-Kardioplegielösung in die infrahepatische unteren Hohlvene. Stellen Sie sicher, die richtige Injektions durch die Visualisierung der Leber Verfärbung und Aufhören der Herzschlag vor der vorrückenden zum folgenden Schritt.
    HINWEIS: Euro-Collins-Lösung wird in unserem Labor hergestellt, siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Instrumenten.
  11. Mit einer Schere Zugriff auf die intrathorakalen Hohlraum über eine bilaterale DIAPHragmatic Einschnitt von der exponierten Bauch. Verlängern Sie den Schnitt durch die Zwischenrippenmuskeln und Rippen kranial. Reflect Brustwand Aussetzen der Herz, Thymus, und der großen Gefäße bei gleichzeitig Erhaltung der Brustwandgefäße entlang der Brustwand.
  12. Spritzen Sie die suprahepatischen untere Hohlvene mit 4 ml kaltem Euro-Collins-Kardioplegielösung.
  13. Identifizieren Sie die Wurzel der Aorta und Spuren distal zu der absteigenden Aorta. Scharf geschnittenen der absteigenden Aorta (Erhaltung maximaler Länge).
  14. Identifizieren Sie den Truncus pulmonalis und teilen proximal ihrer Verzweigungspunkt (Erhaltung maximaler Länge). Dann mit 2 ml kaltem Euro-Collins-Kardioplegielösung, spülen Sie den Truncus pulmonalis und des Herzens, indem Sie einen weichen Kunststoffspitze Katheter in das Lumen des Lungenstamm.
  15. Unter Verwendung einer 6-0 Seidennaht, Ligat und teilen Sie die untere Hohlvene, Zusammenfluss der Lungenvenen und Zubehör Zweige der bilateralen oberen Hohlvene. Dann erhöhenund zu sezieren das Herz kopfwärts von den Anlagen entlang der Hauptstamm Bronchien und Luftröhre mit Sorgfalt die Atemwege nicht zu geben. Mit scharfen und bipolare Elektrokauter sezieren die Brustwand, Thymus, Herz und vollständig aus dem Spendermaus befreiend es.
  16. Schließlich schneiden Sie die Allograft Brustwand ex vivo auf eine kleinere Größe, mit einer Schere entlang des Brustbeins und Seiten costae, mit darauf, dass die Brustwandgefäße (Abbildung 1A) zu stören. Einer Blutung zu minimieren folgenden Revaskularisation zu verwenden bipolare Elektrokauterisierung entlang der Grenzen des osteomusculocutaneous Brustbeins.
  17. Legen Sie das Allograft in 10 ml kaltem (4 ° Celcius) Euro-Collins-Lösung, wenn der Empfänger nicht zu Einsatz vorbereitet. Allerdings, wenn der Empfänger bereit für Einsatz ist, übertragen Sie die Allograft direkt auf das Operationsfeld Empfänger.

2. Empfänger Vorbereitung

Hinweis: Um die Empfänger Anästhesie Zeit zu minimieren,beginnen den Empfänger Zubereitung in einer separaten Betriebsstation ca. 40 min vor der Fertigstellung des Spenders Allograft-Ernte.

  1. Verwenden Sie einen separaten Satz von Standard sterile mikrochirurgische Instrumente und sterile Handschuhe für das Verfahren.
  2. Betäuben den Empfänger-Maus (männlich oder weiblich) mit Isofluran Induktions Verdampfer bei 4%. Verwendung atraumatischer mechanische Knipser entfernen Sie die Haare von der rechten Hals- und Brustbereich.
  3. Platzieren Sie die Maus in der Rückenlage und den Winkel der rechten oberen Extremität leicht inferior Bildung einer 110-Grad-Winkel zwischen dem Kopf und der rechten oberen Extremität. Pflegen Narkose auf 1-2% Isofluran durch einen Nasenkegel.
  4. Zeigen Erdölaugensalbe auf den Mausaugen mit einem Wattestäbchen. Vor der Hautschnitt, weit bereiten die Operationsstelle mit Povidon-Jod antiseptisch, gefolgt von Isopropylalkohol.
  5. Mit einer Schere, einen Hautschnitt von der Mittellinie entlang der rechten unteren border des Unterkiefers und verlängern die Inzision infero-seitlich nach rechts Thoraxbereich. Verwendung stumpf mit mikrovaskulären Pinzetten, mobilisieren die äußere Jugularvene durch in Umfangsrichtung frei Schiffes von Weichgewebe und Adventitia. Teilen Sie Alle Branchen mit Elektrokauter, und entfernen Sie den rechten Lappen der Unterkieferspeicheldrüse mit scharfer Präparation und Elektrokauter, um Freiraum für die Allograft.
  6. Stellen Sie sicher, genug Länge des externen Halsschlagader, um eine Manschette umzustülpen über und ligieren die externe Halsschlagader mit einer 6-0 Seidennaht. Legen Sie die Vene durch das Lumen eines vorgeschnittenen Polyimid-Manschette und verwenden Sie eine Bulldogge mikrovaskulären Haken, um den Behälter-Manschette Komplex zu fixieren. Dann mit einer Schere, proximal unterteilen die äußere Jugularvene, Evert über der Manschette und fixieren mit einem 10-0 Nylonnaht. (1B)
  7. Teilen Sie den rechten M. sternocleidomastoideus mit bipolaren Elektrokauter, um die Arteria carotis communis freizulegen. Umfänglich mobilize die Arterie zum distalen esten Punkt innerhalb der Halsregion kranial. Dies wird unter Verwendung stumpf des Gefäßes mit einer Pinzette, um Weichgewebe und umgebende Adventitia entfernen bewerkstelligt.
  8. Verwenden 6-0 Seidennaht, Ligat und teilen Sie die Halsschlagader. Übergeben Sie die Arterie durch das Lumen eines vorgeschnittenen Polyimid-Manschette und fixieren Sie das Modul mit einer Bulldogge mikrovaskulären Klemme möglichst nahe an der Thoraxapertur wie möglich. Teilen Sie das Gefäß distal, sanft erweitern sich das Schiff mit Hilfe eines mikro Dilatator, Evert über der Manschette und fixieren mit einem 10-0 Nylonnaht. (1B)
    HINWEIS: Die spezifische mikro Dilatator ist in der Tabelle der spezifischen Reagenzien und Instrumente beschrieben.

3. Allograft Inset

  1. Pflegen Standard sterile Instrumente und sterile Handschuhe, um das Allograft im Empfängerhalsbereich in einem auf den Kopf und Schräglage zu platzieren.
  2. Als nächstes legen Sie die Geber absteigend aortic Lumen über den arteriellen Manschetten Konstrukt des Empfängers und fixieren Sie sie mit einem 10-0 Nylonfaden (Abbildung 1C und 1D).
  3. Mode die gleiche Anastomose, wie in Schritt 3.2 zwischen Spender Lungenarterie und umgestülpte äußere Jugularvene Tulpe Konstrukt der Empfängermaus (Abbildung 1C und 1D).
  4. Entfernen Sie zunächst venöse Mikrogefäßklemme (äußere Jugularvene Klemme) und lassen Sie die Arterienklemme (Arteria carotis communis Klemme). Während arterielle Reperfusion, inspizieren die Gesamtheit der Allograft, jede Blutung anzugehen. Wenn Blutungen visualisiert, erneut die Arterienklemme, um den Blutverlust zu minimieren und reduzieren die Blutungsquelle mit bipolaren Elektrokauter.
  5. Überprüfen Sie das Transplantat und sicherzustellen, Blutstillung. Freizugeben und den arteriellen Mikrogefäßklemme vollständig zu entfernen. Beachten Sie die Herzen, um Anzeichen von Reperfusion, die sofort erkennbar mit schnellen Volumenausdehnung der Herzkammern sein wird zeigen, und warten Sie, bEssen innerhalb von 0,5-1 min beginnen. Verwenden Sie warmes Salzlösung (35 ° Celsius), um das Herz zu befeuchten.
  6. Drapieren der Brustwand in eine anatomische Position, um nicht jegliche Quetschungen oder Spannungen an den Anastomosen induzieren. Schließen Sie die Haut des Operationswunde wird mit 6-0 kontinuierlichen Nylonnähten (1E).

4. Nachsorge

  1. Verwalten einer 0,3 ml physiologischer Kochsalzlösung intraperitoneal Flüssigkeit Bolus unmittelbar postoperativ zum Flüssigkeitsersatz.
  2. Dann subkutan injizieren Buprenorphin (0,1 mg / kg) und Enrofloxacin (5 mg / kg) für die Schmerzen und Infektionsprophylaxe sind.
  3. Legen Sie das Tier unter einer Wärmelampe bis zum Erwachen aus der Narkose und zum Brustlage. Während der Wiederherstellung überprüfen Sie den Hals, um den flimmernden Herzschlag der Allograft eine angemessene Allograft-Perfusion zu visualisieren.
  4. Einmal wach und in der Rückenlage, zurück mit der Maus auf einen separaten Käfig (ohne die Gesellschaft von anderen Mäusen), Wo sie Nahrung und Wasser ad libitum erhalten. Wegen einer temporären geringfügige einschränkende Bewegung des rechten oberen Extremität, hinterlassen Sie eine Gelatinenahrungsquelle auf dem Boden des Käfigs.
  5. Beachten Sie die Empfängermaus 1 h postoperativ und dann wieder in den Käfig Einrichtung, wo sie Nahrung und Wasser ad libitum erhalten und wird drei Mal pro Tag für die ersten 24 Stunden für die Aktivität und Nahrungsaufnahme untersucht. Überwachen Mäuse auf Zeichen von Schmerz und Leid und Wieder Dosis Buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutan zweimal am Tag für die ersten 72 Stunden benötigt werden. Untersuchen Sie die Tiere danach täglich und wiegen sie jede Woche.
  6. Beraten Sie sich mit einer tierärztlichen Mitarbeiter, wenn irgendwelche Mäuse zeigen Anzeichen von Schmerzen, Qualen, oder verminderte Futteraufnahme. Betrachten frühen Euthanasie (in unserem Protokoll der Euthanasie Technik verwendet CO 2 Dosierung für 7 min, gefolgt durch Genickbruch).
  7. Aufhören des Transplantatherzschlag wird als spezifische Endpunkt definiert Führung mit der Maus zu sein sacrificed.

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Ergebnisse

Syngenen C57BL / 6-Transplantationen erreicht langfristige Überleben. Das Design des Allotransplantat (Abbildung 1) als erfolgreich erwiesen, die von einem Tier Überleben Perspektive und die Fähigkeit zur kontinuierlichen Transplantatüberleben zu bewerten. Dies wurde durch darüber liegende Haut nachgewiesen verbleibenden lebensfähigen, aktiven laufenden Allograft Haarwachstum und Herzschläge konnten mit Visualisierung und Finger Palpation bewertet werden. Überlebensdaten werden in 2 für...

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Diskussion

Es gibt eine Vielzahl von Phänomenen, die in der immunologischen Untersuchung der Allotransplantation, die umfassen Faktor sind jedoch nicht auf Mechanismen von akuten und chronischen Abstoßung, direkte und indirekte Antigen-Präsentation, Empfänger Sensibilisierung oder die Induktion eines gemischten Chimärismus beschränkt. 19 Tiermodelle geworden der Goldstandard für die Untersuchung der Transplantationsimmunologie und Mausmodelle werden im Volksmund wegen ihrer geringen Kosten, Verfügbarkeit transgener und ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte oder finanzielle Angaben zu machen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den American Association of Plastic Surgeons 2014 Academic Scholar Award finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Euro-Collins Lösung: Die Lösung wird nicht kommerziell gekauft, sondern im Labor hergestellt. Um eine 500-ml-Lösung herzustellen, geben Sie die unten aufgeführte Zutat in ein 330 ml doppelt destilliertes Wasser. Gut mischen und dann den Rest der restlichen 170 ml doppelt destilliertes Wasser in die Lösung geben, bis ein Endvolumen von 500 ml erreicht
Zutaten: 1,02 g KH2PO4, 3,66 g K2HPO4, 0,56 g KCl, 0,42 g NaHCO3 und 17,52 g Glukose.
NahtEthilonMWI 726676-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies)
Polyimid-Manschettenvene (21G)Vention Medical141-0043http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Polyimid-Manschettenarterie (24G)Vention Medical141-0027http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Katheter mit weicher KunststoffspitzeTerumoSR*OX2419CA24G x 3/4"  
Mikrochirurgischer DilatatorS& TD-5a.1Dilatator, 11 cm, FH, 0,1 mm AT10d

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