Air-abgetastete Filteranalyse für Endotoxine und DNA-Gehalt

Zusammenfassung

Zwei komplementäre Analysen von atmosphärischen biologischen Partikeln aus Luftprobefiltern werden hier beschrieben: die Extraktion und der Nachweis von Endotoxin und von DNA.

Zusammenfassung

Außenaerosolforschung verwendet allgemein Partikel auf Filter abgetastet. Dieses Verfahren ermöglicht es, verschiedene Charakterisierungen der gesammelten Partikel in parallel durchgeführt werden. Der Zweck der hier vorgestellten Verfahren ist es, eine hochgenaue und zuverlässige Analyse des Endotoxin und DNA-Gehalt von Bio-Aerosole aus den Filtern extrahiert zu erhalten. Die Gewinnung von hochmolekularen organischen Moleküle, wie Lipopolysacchariden, aus abgetasteten Filter beinhaltet Schütteln der Probe in einer pyrogenfreien Medium auf Wasserbasis. Die nachfolgende Analyse basiert auf einer Enzymreaktion basiert, die unter Verwendung einer turbidimetrischen Messung erfasst werden können. Als Ergebnis des hohen organischen Anteils auf den abgetasteten Filter wird die Extraktion der DNA aus den Proben durchgeführt, eine kommerzielle DNA-Extraktions-Kits verwenden, die ursprünglich für Böden entworfen und modifiziert, um die DNA-Ausbeute verbessern. Der Nachweis und die Quantifizierung von spezifischen mikrobiellen Spezies unter Verwendung quantitative polymerase chain Reactiauf (q-PCR) Analyse mit anderen verfügbaren Methoden beschrieben und verglichen.

Einleitung

Air Probenahme auf Filter ist ein grundlegendes Instrument in atmosphärischen Aerosolen Forschung. ¹ Die abgetasteten Filter der Ausgangspunkt für verschiedene chemische, physikalische und biologische Charakterisierungen der gesammelten Umgebungspartikel sind. ^11.02 Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin , dass verschiedene Analysen sein kann off-line auf der gleichen Probe durchgeführt. Kompilieren der Daten aus den verschiedenen Analysen der Forscher ermöglicht bei der Lösung komplexer Fragestellungen in den atmosphärischen Wissenschaften ein gutes Verständnis für die Eigenschaften der gesammelten Partikel und Hilfsmittel zu erhalten. ^12,13 Zum Beispiel Meeres- und Binnenluftproben , die während der gleichen genommen Zeitraum kann in Bezug auf das abgetastete Partikel Toxizität und biologische Zusammensetzung verglichen. ¹⁴ Für diese Studie Lipopolysaccharide (LPS), Komponenten auf gram-negativen Bakterienzellwände, auch als Endotoxine bekannt sind , wurden von den Filtern on-shore abgetastete extrahiert und ein Binnenstelle und wurden unter Verwendung bewertet dieLimulusamöbocytenlysat (LAL-Test). Verwendung der quantitative Polymerase-Kettenreaktion (q-PCR) parallel wird eine genomische Auswertung des Bakteriengehalt (total Bakterien, gramnegative und Cyanobakterien) wurde an derselben Probe durchgeführt. Der LAL - Test basiert auf der Messung der Trübung nach der Zugabe eines wässrigen Extrakts aus Amöbozyten von dem Pfeilschwanzkrebs Limulus polyphemus gebildet, zu einer wässrigen Lösung , die Endotoxine enthält. Je höher die Endotoxin - Konzentration in der Probe entwickelt die schneller Trübung. ¹⁵ die q-PCR - Analyse auf einem Fluoreszenzsignal basiert , als ein spezifisches DNA - Fragment emittiert wird verstärkt. ¹⁶ durch Echtzeit - Überwachung des Signals während der exponentiellen Phase der PCR Reaktion und Kalibrierung mit einer Standardkurve, die anfängliche DNA-Menge quantifiziert werden kann. Die Kombination dieser beiden Analysen zusammen mit anderen, wie anderswo detailliert, ¹⁴ eine gute Schätzung des Gehalts an Endotoxin liefern kann und dasMenge der Quell Bakterien in den Proben.

Der Zweck der hier vorgestellten Verfahren ist es, eine hochgenaue und zuverlässige Analyse des Endotoxin und DNA-Gehalt von Bio-Aerosole aus den Filtern extrahiert zu erhalten. Während Verfahren die physikalischen und anorganischen chemischen Eigenschaften von Aerosolen zur Abtastung bekannt sind und in jüngster Zeit sind Verfahren entwickelt worden , dessen organischer Substanz Komponente zu untersuchen, ¹⁷ dort hat auf die biologische Komponente von Aerosolen wenig Forschung. ¹⁸ Der Grund für die aktuelle Methode ist , diese Lücke zu schließen, indem zum Extrahieren im Detail ein robustes Verfahren präsentiert, die Analyse und die biologische Fraktion in der Luft Aerosole zu identifizieren. ¹⁴

Die Methode , die hier detailliert wird erwartet , dass weit verbreitete Verwendung in der biologischen Innen- und Außenaerosolforschungsprojekte mit Filteranalyse zu finden. ^20-24

Protokoll

Hinweis: Eine detaillierte Liste aller Materialien und in diesem Protokoll verwendeten Instrumente ist im Abschnitt Materialien gezeigt.

1. Luftfilterprobenahme

1. Herstellung von Filter
   1. Für hohe Volumen Probenahme, 20,3 x 25,4 cm ² Filter verwenden. Wählen Sie die spezifische Art von Filter, der die Forschung Anforderungen am besten entspricht, sowie die Filtergrenzgröße, falls zutreffend. ¹ Hier Verwendung Quarz - Mikrofaserfilter.
   2. Pre-Bake-Filter für organische und biologische Verbindung Probenahme soll organische Rückstände zu zerstören. Um Pre-Bake die Filter, wickeln Sie sie einzeln in Aluminiumfolie und dann backen sie in einem Laborofen bei 450 ° C für mindestens 5 Stunden.
   3. Speichern Sie die gebackenen Filter bei -20 ° C bis hin zur Probenahme.
2. Instrument Handhabung und Air Sampling
   1. Saubere Reststaub aus dem Kopf des hohen Volumens Sampler. Wischen Sie die Teile mit sauberen Papiertüchern und lassen Sie sie an der Luft trocknen before sie auf dem Sampler wieder anschließen.
   2. Desinfizieren Sie die Filterkassette mit Ethanol, und die Arbeit mit Handschuhen und einem Laborkittel zu allen Zeiten.
   3. Legen Sie einen vorgebackenen Filter innerhalb des Reinfilterkassette und verfahren nach dem hohen Volumen Sampler Handbuch.
   4. Markieren Sie das Datum und ungewöhnliche Wetterbedingungen, wenn anwendbar sind (zB regen, Staubsturm) auf der Aluminiumfolie, und speichern Sie es an einem sauberen Ort bis zum Abschluss der Probenahme.
   5. Sammeln Sie die abgetastete Filter und falten Sie es in der Hälfte, mit der abgetasteten Seite nach innen gerichtet.
   6. Wickeln Sie den Filter in der ursprünglichen Aluminiumfolie und bei -20 ° C bis zur Analyse.
      Hinweis: Wenn die Zeitverzögerung zwischen Probenahme und Analyse ist länger als 2 Monate, speichern Sie die Probe bei -80 ° C Abbau des organischen und biologischen Materials zu vermeiden.

2. Endotoxin-Analyse

Hinweis: Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol eind Arbeit mit pyrogenfreiem Rohre, Tipps und Reagenzien nur. Wenn Glas verwendet werden, Vorheizen bei 250 ° C für 30 min oder 200 ° C für 60 min erforderlich ist. ²⁵ alle Reagenzien in einer Klasse II Biosicherheitsschrank vorbereiten und zu allen Zeiten mit Handschuhen und einem Laborkittel zu arbeiten.

1. Vorbereitung der Reagenzien
   1. Folgen Sie den LAL - Kit Protokoll des Herstellers das Lysat kurz vor der Verwendung zu rehydrieren. ²⁶ Tippen Sie sanft auf dem Fläschchen LAL zu entfernen verbleibende auf den Flaschenwänden. Heben Sie den Anschlag sanft um das Vakuum zu brechen. Mit einem Nadelvlies-Spritze, 5 ml pyrogenfreiem Wasser (PFW) in das Fläschchen alle Lysat Inhalt zu rehydrieren und sanft Schaumbildung zu vermeiden, mischen.
   2. Verschließen Sie die Fläschchen mit Kunststoff Paraffinfilm, wenn sie nicht in Gebrauch und lagern bei 4 ° C für bis zu zwei Tage. Bewahren Sie alle verbleibenden Lysat bei -20 ° C für bis zu drei Monaten.
      Hinweis: Dieses Reagenz kann nur einmal eingefroren werden.
   3. Rehydrieren die Steuer Standard-Endotoxin (CSE), die 0,5 μ enthält; g E. coli, in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers. ²⁷ die spezifische Wassermenge bestimmen , von der Website des Herstellers ²⁸ durch Eingabe der Chargennummer für das Kit , wo angegeben auf der Website der CSE Fläschchen gegeben werden. Die Endkonzentration von E. coli in der Ampulle wird in Endotoxin - Einheiten gemessen (EU, wo 10 EU = 1 ng). Beschriften Sie diese Fläschchen ed0.
   4. Verschließen Sie die CSE Fläschchen mit Kunststoff Paraffinfilm, wenn sie nicht in Gebrauch und lagern bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen.
2. Standardkurve und Spitz-Filter Vorbereitung
   1. In einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II, bereiten 22 pyrogenfreien 2 ml Zentrifugenröhrchen abnehmenden Mengen von CSE enthält (Röhren Ed1-ED11) oder ohne CSE (Blindrohr nur PFW enthält) eine doppelte Endotoxin - Verdünnungsreihe zu erzeugen, wie in der Tabelle dargestellt 1.
   2. In einem biologischen Schrank mit Kreislauf, schneiden 22 kreisförmige Stücke von sauberen, vorgebackenen Filter eine desinfizierte 1.1 unter Verwendung von 2 cm Durchmesser Korkbohrer.
   3. Legen Sie die Filterpaare in sterile Petrischalen.
   4. Spike 50 & mgr; l von jedem Mitglied von Endotoxin Verdünnungsreihe Ed2-ED11 und von dem Rohrrohling auf einem entsprechenden Paar von Filtern.
   5. Lassen Sie die Petrischalen, die mit Spikes Filter offen unter der Haube enthält, für 30 Minuten trocknen lassen.
   6. Legen Sie jedes Filterstück in einer pyrogenfreien 2-ml-Tube.

Tube	Endgültige Endotoxin - Konzentration (EU ml -1)	Standard - Endotoxin Volumen (ml)	Pyrogenfreiem Wasser Volumen (ml)	Gesamtvolumen (ml)
ed0	2500	Stammlösung *		5
Ed1	1000	80 (von ed0)	120	200
Ed2	100	20 (von Ed1)	180	200
Ed3	50	10 (von Ed1)	190	200
eD4	25	5 (von Ed1)	195	200
ED 5	12.5	2.5 (von Ed1)	197,5	200
ED6	6.25	1.25 (von Ed1)	198,75	200
ED7	3,125	6.25 (von Ed2)	193,75	200
ED8	1,563	6.25 (von Ed3)	193,75	200
ED9	0,781	6.25 (von eD4)	193,75	200
ED10	0,391	6.25 (von ED 5)	193,75	200
ED11	0,195	6.25 (von ED6)	193,75	200
Leer	0	0	200	200
* Bereiten Sie die Stammlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers.

">

Tabelle 1:. Endotoxin - Standardkurve Endotoxin - Konzentration, dem Volumen des Standard - Endotoxin und pyrogenfreiem Wasser zugegeben werden, und das Gesamtvolumen erhalten detaillierte für jedes Verdünnungsröhrchen in der Kalibrierungskurve.

3. Endotoxin-Extraktion aus der experimentellen und Spiked Filter
   1. In einem biologischen Schrank mit Kreislauf, schneiden Sie die Probenfilter (aus Schritt 1.2) in kreisförmige Stücke mit einer desinfizierten 1,12 cm Durchmesser Korkbohrer, und legen Sie sie zusammen mit den Stachelstandardfilter (aus Schritt 2.2), in pyrogenfreiem 2 ml - Röhrchen (dh die Probenröhrchen).
   2. 1 ml PFW zu den Rohren und schüttle sie für 60 min bei Raumtemperatur, unter Verwendung eines Laborschüttler.
   3. Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen in einer Mikro bei 375 × g für 10 min. ²⁹
   4. Übertragen the Überstand, der die Endotoxine, in eine neue pyrogenfreien 2-ml-Röhrchen enthält.
4. Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL) Test-
   1. Bestimmen Sie die Endotoxin-Konzentration in den Proben, die durch den LAL-Test in einer pyrogenfreien 96-well Mikrotiterplatten mit einem flachen Boden und einem Deckel durchführen.
   2. Planen Sie die Platte Array im Voraus, wie in Abbildung 1 gezeigt. Fügen Sie eine Standardkurve direkt von Endotoxin - Standardlösungen Ed2-ED11 vorbereitet (und damit für den Konzentrationsbereich von 100 bis 0,195 EU / ml (siehe Abschnitt 2.2)) in jeder Laufplatte . Die Standard-Kurve sollte Vertiefungen 1-10 der Zeilen A und B der Platte einnehmen. Stillgelegte Brunnen 11-12 in diesen Reihen für Leerproben (insgesamt vier Leerzeichen).
   3. Schalten Sie den Mikroplattenleser und programmieren es für eine kinetische Reaktion, die Inkubation der Mikrotiterplatten bei 37 ° C und Schütteln alle 5 min, gefolgt von Absorptionsmessungen bei 405 nm. Wiederholen Sie 18-mal für 1,5 Std.
   4. Bestimmen Sie die efficiency , mit dem die Endotoxine aus der Probe extrahiert Filter (dh., die Proben aus dem spiked Standardfiltern erhalten) über Teilung des berechneten Endotoxin Menge von der ursprünglichen Menge versetzt.
   5. Starten Sie den Test, indem 50 ul der Standard-Endotoxin-Lösungen (aus Schritt 2.4.2) oder des Stachel Filter-Extrakt und seine Zuschnitte (aus dem Abschnitt 2.3) oder der experimentellen Proben und deren Zuschnitte (auch aus dem Abschnitt 2.3), gemäß der geplanten Plattenarray (Abbildung 1) und die Abdeckung schließen.
   6. Zu jeder Vertiefung, fügen Sie schnell 50 ul LAL-Lösung und vorsichtig auf die Platte horizontal schütteln, während sie auf den Tisch gelegt wird, bevor es in den Leser zu heben.
   7. Die Platte wird in den Plattenleser und starten Sie den Versuchslauf.

Abb . 1: Endotoxin - Arrayplatte Exreichlich einer Endotoxin-Analyse-Array in einer 96-Well-Mikroplatte.

3. Genomic Analysis

Hinweis: Für die DNA-Extraktion, desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol und arbeiten mit sterilen Röhrchen, Tipps und Reagenzien nur. Für q-PCR-Analyse von DNA, desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit der Oberfläche DNA-Dekontaminationsmittel. Bereiten Sie alle Reagenzien, die in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank und die Arbeit mit Handschuhen und einem Laborkittel zu allen Zeiten.

1. Herstellung der DNA-Primer und Sonden
   1. Vor der DNA - Extraktion, entweder um eine im Handel erhältliche Satz von Primern und einer Sonde (wenn die Hydrolyse - Sonden - Verfahren angewendet wird) oder die Gestaltung eines neuen Satzes von Primern und einer Sonde , Primer entwerfen Rechentools. ³⁰
   2. Rehydrieren der Primer gemäß dem Protokoll des Herstellers entweder 10 mM Tris-0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (TE-Puffer) oder PCR-grade mit Wasser.
      Hinweis: Es wird empfohlen, die anfängliche PCR-Primer st aufzulösenock in TE-Puffer mit niedrigem EDTA (0,1%), wie es Primers Abbau verhindert, wenn für eine längere Zeit gehalten. Verwenden PCR-grade Wasser für die anschließende Verdünnungen EDTA Mengen zu reduzieren, die PCR-Reaktionen hemmen könnten.
   3. Bereiten Sie Teilmengen von 50 & mgr; l oder 100 & mgr; l des Primers und der Sonde in sterile 0,5 ml-Röhrchen und bei -20 ° C bis zur Analyse.
2. Standard-Zellkonzentration Bewertung vor der DNA-Extraktion
   1. In einem geeignet dimensionierten Zentrifugenröhrchen, bereiten eine Standardzelle Lösung der mikrobiellen Spezies von Interesse (Rohr OD0, Tabelle 2A). Mischen Sie die Zellsuspension durch Pipettieren nach oben und unten in der Röhre 7-10 mal mit einer Pipette mit einer kleinen Bohrung.
   2. Wenn die Zellen (zB bestimmte Pilzsporen) gefärbt sind, keine Färbeverfahren durchführen. Wenn Zellfärbung erforderlich ist, verdünnt die Zellsuspension in einem geeigneten Farbstoff zur mikroskopischen Nachweis der Zellen von Interesse. ³¹
   3. Reinigen Sie das Deckglas und hemocytometer mit Ethanol. Befeuchten Sie und bringen Sie das Deckglas auf die Zählkammer.
   4. Laden etwa 8 & mgr; l der Zellsuspension in die beiden Kammern durch Hämocytometer sorgfältig den Rand des Deckglases mit der Spitze der Pipette berührt und die Kammer durch Kapillarwirkung füllt. Sie nicht über / unter die Kammer zu füllen.
   5. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, indem sie unter einem Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung (40x in Objektiv und 10X in Augen) sehen. Neun Quadrate den Maßen 1 x 1 mm ² und in einem 3 x 3 Raster angeordnet sind, sollten gesehen werden. Konzentrieren Sie das Mikroskop auf einem der vier Eckquadrate des Gitters (eine höhere Vergrößerung kann verwendet werden). Das 1 x 1 mm ² Quadrat sollte 16 kleinere Quadrate enthalten.
   6. Zählen Sie alle Zellen in den vier 1 x 1 mm ² Eckquadrate, sowie in den mittleren Platz der 3 x 3 Raster. Wenn es zu viele oder zu wenige Zellen sind, das Verfahren zu zählen, zu wiederholen, entweder die Konzentration oder die ursprüngliche Zellsuspension als geeignete Verdünnung (15-50 Zellen sollten eine Vereinzelung 1 mm ² Fläche) überlagern.
   7. Berechnen Sie die Konzentration der Zellen (Zellen ml ^-1) in der Standard - Zellsuspension OD0 aus der Zelle über die fünf zählter Quadrate gemittelt Zählung wie folgt: Zellenzahl ml ^-1 = mittlere Zellzahl Quadrat ^-1 Verdünnungsfaktor 10 ^4.
3. Auswertung der DNA-Extraktion Effizienz
   1. Bereiten Sie neun sterile 0,5 ml - Röhrchen gemäß Tabelle 2A.
   2. Verdünnen Sie die Standard - Zell - Lösung (OD0) etwa 10 ⁷ Zellen ml enthalten ^-1 in einem Gesamtvolumen von 20 & mgr; l (Od1).
   3. In 18 ul sterilem Nuklease-freies PCR-grade Wasser (NFW) Od2-OD8 und 20 & mgr; l auf die leere Röhre, OD9 an Rohren.
   4. Transfer 2 ul der Zelllösung aus Od1 in Od2. Pipette vorsichtig zu mischen und zu übertragen 2 ul von Rohr Od2 zu Od3. Weiter, um die Zellen in der gleichen Art und Weise entlang der Rohre bis zur Verdünnung und einschließlich Rohr OD8 zu obtain eine serielle Verdünnung von 10 ⁷ -10 ⁰ Zellen ml ^-1.
   5. In einem biologischen Schrank mit Kreislauf, schneiden 18 kreisförmige Stücke von sauberen, vorgebackenen Filter, eine desinfizierte 1,12 cm Durchmesser Korkbohrer verwenden. Legen Sie die Filter in Paaren in sterile Petrischalen.
   6. Spike 10 ul von Verdünnungen Od1 zu OD8 und aus dem Rohling Rohr OD9 auf jede der gepaarte-Filter, so dass es ein Filterpaar auf jeder Standardzellenkonzentration entspricht.
   7. Lassen Sie die Petrischalen öffnen unter der Haube und lassen Sie sie für 30 Minuten trocknen lassen.
   8. Legen Sie jedes Filterstück in einem sterilen Schraubdeckel-2-ml-Röhrchen und extrahieren die DNA nach dem Verfahren gemäß Abschnitt 3.4.
4. DNA-Extraktion aus der experimentellen und Spiked Filter
   Hinweis: Für die DNA-Extraktion aus Filtern, verwenden kommerzielle Kits zur DNA-Extraktion aus dem Boden ausgelegt und nach dem Protokoll des Herstellers mit den folgenden Modifikationen.
   1. Für jede filter Probe (Od1-OD8), eine Mischung aus Säure-gewaschenen Glasperlen in einer 0,5 ml sterilen Röhrchen vorbereiten. Verwenden von 0,1 g Kügelchen mit einem Durchmesser von 425-600 um und 0,3 g Kügelchen mit mit einem Durchmesser von ≤106 um.
   2. In einem biologischen Schrank mit Kreislauf, schneiden drei kreisförmige Stücke aus zufällig ausgewählten Stellen auf jeder Filterprobe eine desinfizierte 1,12 cm Durchmesser Korkbohrer verwenden, und legen Sie sie in Schraubdeckel-2-ml-Röhrchen.
   3. Fügen Sie die Glasperlenmischung an den Rohren.
   4. Fügen Sie die Zell-Lyse-Puffer mit der Extraktions-Kits zu jedem Röhrchen in dem biologischen Schrank zugeführt wird, mit der angegebenen Menge in dem Protokoll des Herstellers.
   5. Bereiten Sie einen Eimer mit Eis und stören die Zellen mechanisch eine Perle Rührbesen verwenden.
   6. Schlagen Sie die Perlen für 1 min und dann auf Eis für 1 min. Versuch wird fünfmal wiederholt.
   7. Fahren Sie mit dem Protokoll des Ausrüster aus der nach der Lyse Schritt.
   8. Nach der Elution mit dem Elutionspuffer geliefert (enthält 10 mM Tris bUffer) oder NFW, laden Sie die eluierte Probe durch die Säule wieder DNA-Ausbeute zu verbessern.
      Anmerkung: Wenn nicht am selben Tag wie die DNA-Extraktion analysiert, können Proben bis zur Analyse bei -20 ° C gelagert werden.

A- Herstellung von Standardzellenverdünnungsreihe
Tube	Endzellkonzentration (Zell ml -1)	Standardzellen-Volumen (ml)	Nukleasefreiem Wasservolumen (ml)	Das Gesamtvolumen (ml)
OD0	bestimmen mit Hemocytometer Zählkammer
Od1	sollte auf den Bereich von 10 7 Zellen ml -1 eluiert werden			20
OD2	10 -1 Od1	2 von Od1	18	20
Od3	10 -2 Od1	2 von Od2	18	20
OD4	10 -3 Od1	2 von Od3	18	20
OD5	10 -4 Od1	2 von OD4	18	20
OD6	10 -5 Od1	2 von OD5	18	20
OD7	10 -6 Od1	2 von OD6	18	20
OD8	10 -7 Od1	2 von OD7	18	20
Leer	0	0	20	20
B- Herstellung von DNA - Standardkurve
Tube	DNA - Konzentration (mg ml -1)	Standard-DNA-Volumen (ml)	Nukleasefreiem Wasservolumen (ml)	Das Gesamtvolumen (ml)
bestimmen mit Nanodrop
Dd1	sollte auf den Bereich von 10 1 mg ml -1 eluiert werden			20
Dd2	10 -1 Dd1	2 von Dd1	18	20
Dd3	10 -2 Dd1	2 von Dd2	18	20
Dd4	10 -3 Dd1	2 von Dd3	18	20
DD5	10 -4 Dd1	2 von Dd4	18	20
Dd6	10 -5 Dd1	2 von DD5	18	20
DD7	10 -6 Dd1	2 von Dd6	18	20
DD8	10 -7 Dd1	2 von DD7	18	20
Leer	0	0	20	20

1 "style =" height: 21px; "> Dd0

Tabelle 2:. DNA Standardkurve Standard - Mikroorganismus Zellverdünnungsreihe (A) detailliert für die Standardzellvolumen, NFW Volumen und dem Gesamtvolumen in jedem Verdünnungsröhrchen. DNA - Standardkurve Zubereitung (B), detailliert für die Standard - DNA Volumen NFW Volumen und dem Gesamtvolumen in jedem Verdünnungsröhrchen.

5. DNA-Standardkurve Vorbereitung
   1. Extrahieren DNA direkt aus einer Standardprobe des Mikroorganismus von Interesse (Dd0) unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie für die experimentellen Filter in Schritt 3.4 beschrieben.
   2. Verwenden eines Spektrophotometers die DNA-Konzentration der Standard-DNA-Probe (Dd0) bei 260 nm zu bestimmen.
   3. Bereiten neun sterile 0,5 ml - Röhrchen , aus denen ein DNA - Standardkurve herzustellen, wie in Tabelle 2B gezeigt.
   4. Falls erforderlich, verdünnt die Standard - DNA - Lösung Dd0 innerhalb eines Konzentrationsbereich von 1-10 & mgr; g ml ^-1 in dem ersten Rohr (Dd1) in einem Gesamtvolumen von 20 ul.
   5. In 18 ul NFW Dd2-DD8 und 20 & mgr; l auf die leere Röhre zu Rohren.
   6. Transfer 2 ul der Standard-DNA-Lösung von Dd1 in Dd2. Pipettieren sanft zu mischen und dann übertragen 2 ul von Dd2 zu Dd3. Weiter die DNA in der gleichen Weise verdünnt wird entlang der Rohre eine serielle Verdünnung von 10 ⁰ -10 ^-7 in Röhren Dd2-DD8 zusammen mit einem leeren Rohr haltende zu erreichenng nur NFW.
      Anmerkung: Wenn nicht am selben Tag nach der Extraktion analysiert, Proben bei -20 ° C bis zur Analyse.
6. Quantitative PCR-Analyse
   1. Schalten Sie die q-PCR-Instrument im Voraus, um sich aufzuwärmen.
   2. In einer neuen Programmdatei, legen Sie die Details für den q-PCR im Gerät-Betriebssoftware laufen , wie in Tabelle 3 aufgeführt.
      Hinweis: Verschiedene Instrumente haben unterschiedliche optimale Timing für jeden Schritt Wärmezyklus. Dieser Eingang wird in der Instrumentenhandbuch festgelegt.
   3. Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit der Oberfläche DNA-Dekontaminationsmittel und arbeiten nur mit sterilen Röhrchen, Tipps und Reagenzien.
   4. Bereiten Sie einen Eimer mit Eis neben der Werkbank. Shop Taq-Polymerase-Mix auf Eis.
   5. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Reaktionsgefäße, die in der Platte belegt wird. Machen theoretischen Zulage für zusätzliche Reaktionen (5%) und multiplizieren Sie die vergrößerte Anzahl von Reaktionen durch das Volumen pro Reaktion die Gesamt reactio zu berechnenn Volumen.
   6. Bereiten Sie die Reaktion gemischt Pool, ausgehend von NFW, Primer, Sonde, und schließlich der Taq-Polymerase-Mix. Siehe Beispiel für die Volumenberechnungen für den gemischten Pool in Tabelle 4.
   7. Bewahren Sie die Reaktionsmischung im Dunkeln und auf Eis bis zum Gebrauch.
   8. Platzieren 1 ul Standard-DNA, DNA-Probe oder NFW (als Negativkontrolle) innerhalb der Vertiefungen in der q-PCR Mikrotiterplatten in Triplikaten.
   9. Stellen Sie sicher, dass die Platte in einem Plattenhalter ist es zu verhindern, dass die Arbeitsfläche zu berühren und sie sauber zu halten.
   10. In 9 ul des gemischten Pool (Tabelle 4) in jede Vertiefung Reaktion.
   11. Die Platte mit optischen Klebefolie und verschließen Sie diese sorgfältig von allen Seiten.
   12. Spin down die Platte in einer Zentrifuge mit Platten Eimer für 1 min bei 1000 × g, bevor es in der q-PCR-Gerät platzieren.
   13. Legen Sie die Platte in das Gerät und aktivieren das laufende Programm.

Parameter	Einzelheiten	Bemerkungen
Nachweisverfahren	Quantitative Hydrolyse-Sonde
Thermische Zyklusbedingungen
Anfängliche Denaturierung und Enzymaktivierung	95 ° C für 10 min
Denaturierung	95 ° C für 15 sec	wiederholen 45 mal
Glüh- und Erweiterung	60 ° C für 60 sec
Plattenarray
Standardkurve	Dd1 - DD8	3 Wiederholungen pro Verdünnung in 1-8 Vertiefungen bei den Top-3 Reihen
Nicht-Template-Steuerung (NTC)	Nuclease freies Wasser (NFW)	3 Wiederholungen in der 9. gut an der Spitze3 Reihen.
analysierte Proben	DNA aus den Filtern extrahiert	3 Wiederholungen pro Probe bei den restlichen Brunnen.
Primer-Set	pro jede Vertiefung
Probenvolumen	10 ml

Tabelle 3:. Details zum q-PCR - Betriebssoftware Details der Analyse Parameter in die Datei q-PCR - Programm eingegeben werden.

Reagens	Volumen pro Reaktion (ml)	Anzahl der Reaktionen	Ermäßigung für Fehler(5%)	Das Gesamtvolumen Mix (ml)
Taq-Polymerase-Mix	5	50	52.5	262,5
F-Primer (10 mM)	0,5	50	52.5	26,25
R Primer (10 mM)	0,5	50	52.5	26,25
Nuclease freies Wasser	3	50	52.5	157,5
DNA - 1 ml wird direkt in die Ziel Vertiefungen in der 96 Platte hinzugefügt werden.

Tabelle 4:. Quantitative-PCR - Reaktionsmischung Berechnung Volumen pro Reaktion, die Anzahl der Reaktionen, Zulage für Fehler, und die berechnete Gesamt Volumen werden sollen, hinzugefügt in der Reaktionsmischung pro Reagenz detailliert.

Ergebnisse

Es ist üblich , atmosphärischer Aerosole zu studieren "off-line" , analysiert der abgetasteten Filter verwenden (siehe Abbildung 2). ³² Chemische Analysen des abgetasteten Materie umfassen organische (zB Protein, Kohlenwasserstoffmoleküle, Saccharide) und anorganischen (zB Metalle, Salze) Gehalt . Biologische Analysen umfassen lebensfähigen und nicht lebensfähige Mikroorganismen Gehalt, Artbestimmung einer DNA-Ansatz oder Mikroskopi...

Diskussion

Diese Arbeit beschreibt Extraktion und Nachweismethoden für beide Endotoxinen und DNA, die in Aerosolproben auf Filtern gesammelt zu quantifizieren. Die Methoden erfordern eine genaue Routinen und kann leicht so lange durchgeführt werden, wie der Experimentator auf wenige wesentliche und wichtige Punkte hält sich hier diskutiert.

Für die Endotoxin-Nachweisschritt zu beachten, dass das Lysat Lösung ziemlich viskos und neigt dazu, Blasen beim Pipettieren zu erzeugen. Es ist schwierig, dich Bla...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Filter sampling
HiVol 3000 - High Volume Air Sampler	Ecotech
Quarz Mikrofaser Filter	Whatman	1851-865	203 mm x 254 mm
ELF - Labor-Kammeröfen	Carbolite	ELF 11series
Aluminiumfolie	Opal
< strong>Name	Unternehmen	>Katalognummer	Kommentare
Endotoxin
Ethanol	Sigma Aldrich	16368	Laborreagenz, 96%
Biologische Sicherheitswerkbank der Airstream-Klasse II AC-4E1	ESCO	10011712
Pyrotell -T	Associates of Cape Cod, Inc.	T0051
Control Standard Endotoxin	Associates von Cape Cod, Inc.	E0005-1	Escherichia coli  Ø113:H10, 0,5 &Mikro; g/Fläschchen 1 Packung
LAL Reagenz Water	Associates of Cape Cod, Inc.	W0051
10 ml sterile Spritze mit Luer-Lok Tip	Becton-Dickinson & Co.
BD Precisionglide Spritzennadel	Becton-Dickinson & Co.	305129	Steril
Parafilm-M Dichtband	Parafilm	P7543	Sigma Katalognummer
Microtubes	Axigen	MCT-200-C	2 ml, pyrogenfrei
1,12 cm Durchmesser Korkbohrer	Boekel Scientific	1601 BD Serie - Stahl	Teil eines Korkbohrer-Sets mit Bohrern mit verschiedenen Durchmessern.
50 mm Petrischale	Miniplast Ein-Shemer	72050-01	Aseptischer
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	SI-0297
Mikrozentrifuge 5415 D	Eppendorf	22621408
TC MicroWell 96 F SI mit Deckel	Nunc	167008	Vertiefungen mit flachem Boden (mit Deckel (einzeln verpackt)), steril, pyrogenfrei
Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader	Biotek	7091000
Name	Company	Katalognummer	Comments
DNA
DNA away	Sigma Aldrich	7010
Standard-DNA der mikrobiellen Spezies von Interesse	ATCC oder andere Kultursammlung		Entweder der geeignete mikrobielle Stamm für die DNA-Extraktion oder die extrahierte DNA
Neubauer-verbessertes	Marienfeld	640030	Hämozytometer
TE Puffer, Low EDTA	Life Technologies	12090-015	10 mM Tris-HCl (pH 8,0)  0,1 mM EDTA
Nukleasefreies Wasser in PCR-Qualität	Sigma Aldrich	3315959001 PCR-Primer
	Sigma Aldrich		zielt auf die mikrobiellen Spezies von Interesse
Dual-Markierte Sonden	Sigma Aldrich		zielt auf die mikrobiellen Spezies von Interesse
ab Schraubverschlussröhrchen	Axigen	ST-200-SS	2 ml
PowerSoil DNA-Extraktionskit	Mo Bio Laboratories	12888-100
Glasperlen, säuregewaschen 425-600 & Mikro; m	Sigma Aldrich	G8772-100G
Glasperlen, säuregewaschen < 106 &Mikro; m	Sigma Aldrich	G4649-100G
PowerSoil Solution C1	Mo Bio Laboratories	12888-100-1	Zelllysepuffer , Power soil Kit
Magic Touch Eiskübel	Bel-Art	18848-4001
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	607EUR
StepOnePlus Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376600
Schnell SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385612
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystems	4370048
MicroAmp Schnelle optische 96-Well-Reaktionsplatte mit Barcode, 0,1 ml	Applied Biosystems	4346906
MicroAmp Splash-Free 96-Well Base	Applied Biosystems	4312063
MicroAmp Optischer Klebefilm	Applied Biosystems	4311971
Zentrifuge 5810 R	Eppendorf	5811 000.010	Rotor A-4-62 mit MTP-Schaufeln