Method Article

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

DOI:

10.3791/53445

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December 23rd, 2015

 ,  , 
1Molecular Microbiology and Microbial Pathogenesis Program, Washington University School of Medicine, 2Department of Internal Medicine, Washington University School of Medicine, 3Drug Discovery Program in Pulmonary and Critical Care Medicine, Washington University School of Medicine, 4Biochemistry Program, Washington University School of Medicine, 5Center for the Investigation of Membrane Excitability Diseases, Washington University School of Medicine, 6Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 7Department of Cell Biology and Physiology, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

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Dies ist ein schnelles, kosteneffizientes Protokoll für die Herstellung von sekretierten, glykosylierten Säugetierproteinen und die anschließende einstufige Aufreinigung mit ausreichenden Ausbeuten an homogenem Protein für die Röntgenkristallographie und andere biophysikalische Studien.

Abstract

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Die Produktion von sezernierten Säugetierproteinen für strukturelle und biophysikalische Studien kann herausfordernd, zeitintensiv und kostspielig sein. Hier wird ein zeit- und kosteneffizientes Protokoll für die sekretierte Proteinexpression in Säugetierzellen und eine einstufige Aufreinigung mittels Nickel-Affinitätschromatographie beschrieben. Das System basiert auf der großflächigen transienten Transfektion von Säugetierzellen in Suspension, wodurch die Zeit bis zur Proteinproduktion erheblich verkürzt wird, da Schritte wie die Entwicklung von Expressionsviren oder die Erzeugung stabiler exprimierender Zelllinien entfallen. Dieses Protokoll verwendet billige Transfektionsmittel, die leicht durch einfache chemische Modifikation hergestellt werden können, oder preisgünstige Transfektionsmittel, die die Ausbeute durch erhöhte Transfektionseffizienz und verringerte Zytotoxizität erhöhen. Die sorgfältige Überwachung und Aufrechterhaltung des Glukosespiegels in den Medien erhöht die Proteinausbeute. Die Kontrolle der Reifung nativer Glykane im Expressionsschritt erhöht die endgültige Ausbeute an richtig gefalteten und funktionellen Säugetierproteinen, was ideale Eigenschaften für die Röntgenkristallographie sind. In einigen Fällen wird durch die einstufige Aufreinigung ein Protein von ausreichender Reinheit für die Kristallisation erzeugt, was hier als Beispielfall demonstriert wird.

Introduction

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Das Verständnis von Proteinstrukturen auf atomarer Ebene ist der Schlüssel zur Aufdeckung der molekularen Grundlagen der biologischen Wege und Krankheiten. Röntgen Proteinkristallographie ist das am häufigsten verwendete / anwendbares Verfahren zur Bestimmung von hochmolekularen Strukturen. Die größte Herausforderung bei diesem Verfahren ist, ausreichende Mengen an korrekt gefalteten, reines Protein. Dies wird ein Problem besonders bei der Arbeit mit sezerniertes Säugerproteinen, die bestimmte post-translationale Modifikationen unterzogen werden.

Bakteriell exprimierten Proteine ​​sind die Hauptquelle für kristallisierte Proteine ​​in der....

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Protocol

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1. Herstellung von Milligramm-Mengen von Plasmid-DNA für eine groß angelegte Transiente Transfektion

  1. Klonierung des Proteins von Interesse in einer hohen Kopienzahl Säuger-Expressionsvektor unter Verwendung von Restriktionsstelle Klonierung oder andere geeignete Technik.
    1. Für optimale Ergebnisse verwenden pHLsec 7 Vektor, der hat einen eingebauten in C-terminal 6His-tag, ein starker Promotor Kozak-Sequenz und eine optimierte Sekretionssignal.
  2. Verwandeln Sie das Plasmid auf kompetente Zellen.
    1. Mit 20 ul kompetenter E. coli-Zellen auf 1 & mgr; g Plasmid-DNA und Inkubieren auf Eis für 30 min.
    2. Hitzeschoc....

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Results

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Hierin folgt die Ergebnisse dieser Expressionssystem zu einem sekretierten 13 kDa-Immunglobulin (Ig) -Domäne von menschlichem Protein Auslöse Rezeptor auf myeloide Zellen 2 (hTREM2, Reste 19 bis 132) angegeben angewendet wird. TREM2 ist ein Typ I Transmembranprotein, das eine einzelne extrazelluläre Ig-Domäne, die zwei Disulfidbrücken und zwei N-verknüpfte Glykosylierungsstellen aufweist. Im Gegensatz zu anderen Ig-Domänenproteine ​​8 wurde TREM2 nicht zugänglich Rückfaltung aus bakteriellen Einschlusskörpern.......

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Discussion

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HEK 293F-Zellen bieten robuste Produktion von Proteinen erfordert post-translationale Modifikationen. Dieses System ermöglicht eine schnelle und skalierbare Ausdruck der nativ gefalteten Proteine ​​enthalten, Disulfide, Glykosylierung und Phosphorylierung, die sonst mit mehr Routine Expression Tools abwesend sein würde. Darüber hinaus kann dieses System für die Expression und Reinigung von Multiproteinkomplexen einfach durch Co-Transfektion von mehreren Plasmiden verwendet werden. Neben TREM2 Dieses System wurde ausgieb.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R01-HL119813 (an T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (an T.J.B.), einem CIMED Pilot and Feasibility Grant (an T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (an Z.Y.) und 15PRE22110004 (an D.L.K.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
KulturflaschenGeneMateF-5909B
293 Freestyle MediaGibco/Life Technologies12338-018
GlutaMAXGibco/Life Technologies35050-061Verwendung anstelle von Glutamin
Hype 5 TransfektionsreagenzOz BiosciencesHY01500
293fectin TransfektionsreagenzLife Technologies
PEI-TransfektionsreagenzSigma-Aldrich408727
Maxiprep KitQiagen12162
Ni-NTA Superflow Qiagen30430
Endo HfNEBP0703L
AmyloseharzNEBE8021S
Cell Boost R05.2HyCloneSH30584.02Zellkulturergänzung
GlucCellCESCO BioengineeringDG2032Glukosemesssystem
Opti-MEMLife Technologies519850.91Serum Freies Medium für DNA-Transfektion
Luria Broth (LB Media)Life Technologies10855-001
GC10 Kompetente ZellenSigma-AldrichG2919
12347019

References

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  1. Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674(2013).
  2. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15

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Tags

Mammalian Cell ExpressionExtracellular GlycoproteinsNickel Affinity ChromatographyTransient TransfectionProtein PurificationGlycan MaturationCell Viability MonitoringMedia Glucose ControlSingle step PurificationProtein Crystallization

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