Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in C. elegans Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Summary

Hier wird gezeigt, wie Entwicklungsprozesse in C. elegans verfolgt und quantifiziert werden können. Die vorgestellten Methoden basieren auf Open-Source-Tools, die einfach implementiert werden können. Es wird gezeigt, wie man 3D-Zellformmodelle rekonstruiert, wie man subzelluläre Strukturen manuell verfolgt und wie man die kortikale kontraktile Strömung analysiert.

Abstract

Quantitativen Erfassung von Entwicklungsprozessen ist entscheidend, um mechanistische Modelle und grundlegenden ableiten zu identifizieren und zu beschreiben Mutantenphänotypen. Hier Protokolle werden zur Herstellung von Embryonen und erwachsenen C. vorgestellt elegans Tiere für kurz- und langfristigen Zeitraffer-Mikroskopie und Methoden zur Überwachung und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen. Die vorgestellten Methoden werden alle auf C basiert elegans Stämme von der Caenorhabditis Genetics Center und auf Open-Source-Software, die leicht in jedem Labor unabhängig von dem Mikroskopiesystem verwendet, implementiert werden kann. Eine Rekonstruktion eines 3D-Zell-Formmodells mit Hilfe der Modellierungssoftware IMOD, manuelle Verfolgung von fluoreszenzmarkierten subzellulärer Strukturen unter Verwendung des Mehrzweck-Bildanalyseprogramm Endrov, und eine Analyse der kortikalen Kontraktionsströmung mit PIVlab (zeitaufgelöste digitale Particle Image Velocimetry Werkzeug für MATLAB) gezeigt. Es wird diskutiert, wie diese Methoden können auch eingesetzt werden to quantitativ erfassen andere Entwicklungsprozesse in verschiedenen Modellen, zum Beispiel Zell Tracking und Tracing Abstammung, Tracking der Vesikel-Flow.

Introduction

Mit den stetigen Verbesserungen der fluoreszierenden Proteine, Genomtechnik, Lichtmikroskopie und Computer Soft- und Hardware, ist es nun möglich, die Entwicklung von vielen Modellorganismen zu beispiellosen räumlich-zeitliche Auflösung aufzeichnen. Dies ermöglicht es den Forschern, um Fragen, die bisher nicht behandelt werden konnten bitten oder zu bekannten Entwicklungsprozesse, um für übersehene Aspekte zu suchen denken. Diese Fortschritte sind auf dem Gebiet der quantitativen Entwicklungsbiologie, die bei Umwandlung qualitative, informellen Modelle in quantitativen Modellen durch gründliche Messungen und statistische Analysen sollen entfacht.

Protocol

1. Herstellung der C. elegans Embryonen für Zeitraffer-Mikroskopie mit Mikroperlen

1. Bringen gravid erwachsenen Würmer mit Hilfe eines Schnecken Pick (Platindraht) in einen Tropfen M9-Puffer und sauber aus Bakterien durch erste kräftiges Rühren und dann Übertragen jeder Wurm zu einem benachbarten Tropfen M9 mit einem Wimpern auf einen Zahnstocher / Pipettenspitze montiert oder mit einem spitzen Glaskapillare.
2. Verdünne die Dispersion, die das 20 & mgr; m Durchmesser Polystyrolbeads 10fach in M9-Puffer (1 l M9-Puffer enthält 3 g KH _{2 PO 4,} 6 g _Na 2 _HPO 4, 5 g NaCl, und nach dem Autoklavieren (20 Mi....

Results

Durch die Verwendung von Protokollen 2, 3, und 4, Zeitraffer-Bildgebung der Gonaden in Wildtyp C. elegans Erwachsenen durchgeführt wird (Stamm OD58 (unc-119 (ED3) III; ltIs38 [PAA1; pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), ein Membranmarker exprimierenden von einem Keimbahn-Promotor ). Die Konzentration auf die Wende des Gonaden wird ein 3D-Modell der Keimzellen von den Mikroskopiedaten (Abbildung 2) erzeugt wird. Dieses Modell erlaubt es, Veränderungen in der Zellgröße zu analysieren, .......

Discussion

Durch Objektverfolgung in der Entwicklung, insbesondere Kern Tracking, ist es gelungen, den zentralen Mustermechanismen aufzuklären C. elegans Embryogenese ^1,23,24. Der Ausbau dieser Strategie um einen höheren Durchsatz, hat es vor kurzem gelungen, zusätzliche Strukturierungsregeln aufzudecken und schlagen eine Methode, wie man Strukturierungsregeln ableiten, ^De-novo-10. Für viele Mutanten sind jedoch die präzise Strukturierung Defekte noch unbekannt. Die hier beschriebenen Method.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomikroskop	Motic/VWR	OT4005S	Stereomikroskop zum Sezieren und Einbetten
von Mikrosphären aus Polybead-Polystyrol	Polysciences	18329	Embryo-Montage
20 & Mikro; m
Polybead-Polystyrol-Mikrosphären	Polysciences	876	Tierhaltung für adulte Tiere
0,1 µ m
Objektträger	VWR	631-0902	Halterung für erwachsene Tiere
Deckglas 18x18 mm	VWR	631-1331	Halterung für Embryonen/Erwachsene
Deckglas 24x60 mm	VWR	631-1339	Embryo-Halterung
Skalpell	VWR	233-5455	Embryo-Dissektion
Silikonschlauch	VWR	228-1501	Schlauch für Mundpipette
30 mm PTFE-Membranfilter	NeoLab	Jul-01	Filter für Mundpipette
Kapillarröhrchen	VWR	621-0003	Pipettenspitze für Mundpipette
Vaseline	Roth	E746.1	Einbettung für Embryo/Erwachsene
Agar	Roth	5210.5	Einbettung für erwachsene Tiere
Kalium-dihydrogenphosphat	Roth	P018.2	M9 Puffer
Di-Natrium-hydrogenphosphat	Roth	P030.2	M9 Puffer
Natriumchlorid	Roth	3957.1	M9 Puffer
VisiScope Spinning Disc Konfokales System	Visitron Systems	n/a	Konfokalmikroskopie