Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Zusammenfassung

In Xenopus-Embryonen sind Zellen aus dem Dach des Blastocoels pluripotent und können so programmiert werden, dass sie verschiedene Gewebe erzeugen. Hier beschreiben wir Protokolle zur Verwendung von amphibischen Blastocoel-Dachexplantaten als Assay-System, um in vivo und in vitro wichtige Merkmale der frühen neuronalen Entwicklung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Das Verständnis der genetischen Programme, die der neuronalen Entwicklung zugrunde liegen, ist ein wichtiges Ziel der Entwicklungs- und Stammzellbiologie. In der amphibischen Blastula sind Zellen aus dem Dach des Blastocoels pluripotent. Diese Zellen können isoliert und so programmiert werden, dass sie durch Manipulation der Genexpression oder Induktion durch Morphogene verschiedene Gewebe erzeugen. In diesem Manuskript werden Protokolle für die Verwendung von Xenopus laevis Blastocoel-Dachexplantaten als Assay-System zur Untersuchung wichtiger in vivo und in vitro Merkmale der frühen neuronalen Entwicklung beschrieben. Diese Protokolle ermöglichen die Untersuchung des Schicksalserwerbs, des Zellmigrationsverhaltens sowie der zellautonomen und nicht-autonomen Eigenschaften. Die Blastocoel-Dachexplantate können in einem serumfreien, definierten Medium kultiviert und in Wirtsembryonen transplantiert werden. Diese Transplantation in einen Embryo ermöglicht die Untersuchung der langfristigen Abstammungsbindung, der induktiven Eigenschaften und des Verhaltens der transplantierten Zellen in vivo. Diese Assays können genutzt werden, um molekulare Mechanismen, zelluläre Prozesse und genregulatorische Netzwerke zu untersuchen, die der neuronalen Entwicklung zugrunde liegen. Im Rahmen der regenerativen Medizin bieten diese Assays die Möglichkeit, neuronale Zelltypen in vitro zu erzeugen, die im Wirkstoffscreening eingesetzt werden könnten.

Einleitung

Wirbelnervensystem geht aus dem neuronalen Platte als homogene Schicht von Neuroepithelzellen. Zu verstehen, wie Entwicklungsprogramme werden induziert, codiert, und gründete während Regionalisierung der Neuralplatte ist gegenwärtig eines der Hauptziele in der Entwicklungsbiologie. Im Vergleich zu anderen Systemen ist die experimentell zugänglich Xenopus Embryo ein Modell der Wahl für die Analyse von frühen Schritte der neuralen Entwicklung ^1,2. Es ist leicht, eine große Zahl von Embryonen zu erhalten, und externe Entwicklung ermöglicht den Zugang zu den ersten Schritten der Neurulation ^3. Viele Werkzeuge zur Verfügung, um experimentell zu manipulieren Xenopus laevis (X. laevis) Embryonalentwicklung. Mikroinjektion von mRNAs oder Morpholinos (MO), einschließlich der induzierbaren MOs zusammen mit biochemischen und pharmakologischen Werkzeugen ermöglicht kontrollierte gain of function (GOF) und Funktionsverlust (LOF) und spezifische Änderung der Signalwege ^4,5. Der blastocoel Dach Ektoderm, um das Tier Pol einer Blastula oder einem sehr frühen Gastrula Embryo entfernt und bezeichnet als "animal cap" (AC), eine Quelle von pluripotenten Zellen, die durch Manipulation der Genexpression vor programmiert werden kann, Explantaten Vorbereitung. In diesem Manuskript sind ausführliche Protokolle zu verwenden X. laevis AC Explantaten in vitro und in vivo molekularen und zellulären Prozesse zugrunde liegenden neuralen Entwicklung zu testen.

Es wird eine Technik vorgestellt, wobei eine feine Beobachtung von Genexpressionsmustern in einer Xenopus Kaulquappe Neuralrohr, einen vorläufigen Schritt bei der Identifizierung von Schicksal Bestimmung Cues. Während die Beobachtung der Flachgewebe angebracht wird allgemein bei der Untersuchung von Hühnerembryonen ⁶ verwendet wird, ist nicht korrekt in Xenopus beschrieben. Manipulation der Genexpression durch Einspritzen von Kunst mRNA oder MO in die Blastomeren von 2 oder 4 Zellen Embryonen ermöglicht die Programmierung ACExplantaten ^4. B. Inhibierung des Bone Morphogenetic Protein (BMP) Weg durch die Expression des anti-BMP Faktor Noggin, gibt ein neuronales Identität AC ^Zellen 3. Das Protokoll wird zum Ausführen von lokalen und zeitgesteuerte Belichtung AC Explantate auf extrinsische Cues durch direkten Kontakt mit einem Anionenaustauscherharz Wulst beschrieben. Schließlich wird eine Technik zur Prüfung von Entwicklungs Merkmale der neuralen Vorläuferzellen in vivo durch Transplantation von gemischten Explantaten aus verschiedenen programmierten Zellen dissoziiert und Wieder assoziiert beschrieben hergestellt.

Der Frosch Embryo ist ein leistungsfähiges Modell zu frühen Wirbeltiere neuralen Entwicklung zu studieren. Die Kombination Manipulation der Genexpression in vitro-Kulturen Explantation liefert wichtige Informationen in der Studie von Neuroepithel Regionalisierung, Proliferation und Morphogenese ^7-12. Die Programmierung der AC Explantate gestattet Entwicklung eines funktionellen Herz ex vivo ^13,14. Die VerwendungExplantatmedium Pfropfen ¹⁵ führte zur Identifizierung des minimalen Transkriptionsschalter Induzieren der Neuralleiste Differenzierungsprogramms ^16. Die Zona limitans intrathalamica (ZLI) ist ein Signalisierungszentrum, das Sonic Hedgehog (Shh), um das Wachstum und die Regionalisierung der Schwanzvorderhirn steuern absondert. Wenn kontinuierlich auf Shh ausgesetzt Neuroepithelzellen Koexpression der drei Genen für Transkriptionsfaktoren - Barh artigen homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (OTX2) und Iroquois-3 (irx3) - zu erwerben zwei Eigenschaften der ZLI Fach: die Kompetenz, shh auszudrücken, und die Fähigkeit, von anterior Neuralplatte Zellen zu trennen. Als Modellsystem wird die Induktion einer ZLI Schicksal in Neuroepithelzellen präsentiert ⁸ werden.

Diese Protokolle zielen darauf ab, einfach, billig und effiziente Werkzeuge für die Entwicklungsbiologen und andere Forscher, die fundamentale mec erkundenhanisms von Schlüssel neuronalen Zell Verhaltensweisen. Diese Protokolle sind sehr vielseitig und ermöglichen die Untersuchung einer großen Palette von extrinsischen und intrinsischen neuronalen Bestimmung Cues. Es ermöglicht langfristig in vivo Analyse neuronaler Abstammung Engagement, induktive Wechselwirkungen und Zell Verhaltensweisen.

Protokoll

Experimente mit nationalen und europäischen Verordnung über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke und mit international etablierten Prinzipien der Vermeidung, Verminderung und Verbesserung verwendet, entsprechen.

1. Flach Montage von Xenopus laevis Kaulquappen Anterior Neuralrohr Nach Whole-mount in situ Hybridisierung

1. Erhalten X. laevis Embryonen nach Standardverfahren ^{4 und} älter werden, bis sie Neurulastadium 26 und älter (nach Nieuwkoop und Faber ^{Entwicklungstabelle} 17 zu erreichen.
2. Fix X. laevis Kaulquappen durch Inkubation in einer Lösung von 4% Paraformaldehyd (PFA). Rock, drehen und die Embryonen in eine 2 ml-Glasampulle werden 1 bis 1,5 h bei RT Stufe 26 bis 38 Embryonen, 2 h bei RT für Embryos in einem späteren Stadium der Bühne.
   ACHTUNG: PFA ist durch Kontakt und möglicherweise krebs giftig. Es sollte unter einer Haube manipuliert werden.
   HINWEIS: One X. laevis Brutüblicherweise in einem 2 ml-Glasampulle fest, aber eine größere Glasfläschchen verwendet werden können.
3. Die Embryonen in der gleichen Ampulle mit 1x PBS mit 0,1% Tween (PBT), 3 min bei RT waschen, zweimal.
   HINWEIS: Sofern nicht anders angeben PBS verwendet wird, ist mit oder ohne Kalzium und Magnesium.
4. Dehydratisieren die Embryos in 100% Methanol (MeOH) für mindestens 12 Stunden bei Raumtemperatur in der gleichen Ampulle. Ändern Sie den MeOH 100% mindestens zweimal unter der Haube mit einem Kunststoff-Mikropipette.
   HINWEIS: Die MeOH leicht gelb gefärbt, wie Lipide darin gelöst. VORSICHT Das MeOH ist beim Einatmen giftig und sollte unter einer Haube manipuliert werden.
5. Rehydrieren die Embryonen mit der gleichen Ampulle durch eine abgestufte Reihe von MeOH Bäder: MeOH 75% in PBS, MeOH 50% in PBS, MeOH 25% in PBS, PBS zweimal, jedes Bad 5-10 min bei RT. Die MeOH-Lösungen werden unter der Haube mit einem Kunststoff-Mikropipette geändert.
6. Mit einem Kunststoff-Pipette der Embryo in einem 60 mm-Petrischale an die Spitze mit PBT gefüllten seziert werden. Mit Hilfe von zwei feinen Pinzette Pflegedie Augen, indem Sie einen feinen Pinzette zwischen den Augen und dem Neuralrohr, auf der Ebene der Optik Stiel vollständig entfernen. Lösen Sie die Augen aus dem Neuralrohr. Vorsichtig einführen die Zange unter dem Ektoderm über dem Neuralrohr. Mit Sorgfalt, ziehen Sie die Ektoderm ab hinter dem Kopf und entsorgen Sie sie.
7. Führen Sie ein Doppel- oder Einzel ISH unter Verwendung von Digoxigenin-markierten oder Fluorescein-markierten Sonden, wie oben beschrieben ^18,19.
8. Nachdem der ISH Übertragung der Embryonen in einem neuen 60 mm Petrischale an die Spitze mit PBT mit einer Plastikpipette gefüllt.
9. Verwenden feinen Pinzette vorsichtig lösen das Neuralrohr vom Rest des Embryos. In diesem Stadium löst sich die vordere Neuralrohr von posterior Neuralrohr. Vorsichtig lösen übrigen Teile des Ektoderms über dem Neuralrohr, Chorda, die lose unter dem Neuralrohr oticum Vesikeln und übrigen Teile des Mesoderms befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass das Neuralrohr ist frei von irgendwelchen Anlagenauf dieser Stufe.
   HINWEIS: Um eine Beschädigung des Neuralrohrs zu vermeiden führen alle Neuralrohr / Embryotransfer mit einem Kunststofftransferpipette oder einer Mikropipette bei Bedarf mit einer Spitze Schnitt an seinem Ende. Der Durchmesser des Spitzenendes an die Größe des Neuralrohrs eingestellt.
10. Übertragen Sie die seziert Neuralrohr (siehe Hinweis Schritt 1.9) in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 50% Glycerin in PBS gefüllt. Warten, bis die Neuralrohren haben zur Unterseite der Glycerinlösung gefallen ist, in der Regel O / N bei 4 ° C.
11. Entfernen Sie die Lösung von 50% Glycerin / PBS mit einer Mikropipette P1000 und fügen Sie in der gleichen 1,5-ml-Röhrchen mit einer Lösung von 90% Glycerin / PBS mit einer Mikropipette P1000. Warten Sie, bis die neuronalen Rohre an der Unterseite der 90% Glycerin / PBS-Lösung fallen, in der Regel O / N bei 4 ° C.
    Hinweis: für die langfristige Lagerung, verwenden 90% Glycerin / PBS plus Antibiotika, um bakterielle Entwicklung zu verhindern.
12. Übertragen Sie die neuronale Rohre auf einer Glasplatte oder einem Objektträger mit einer Kunststofftransferpipette.
13. DisSekte die neuronalen Rohre entlang der dorsalen und ventralen Mittellinien mit Wolfram-Nadeln. Während dieser Stufe werden die neuronalen Röhrchen werden in 90% Glycerin / PBS aufbewahrt.
14. Montieren Sie die beiden Seiten des Neuralrohrs in 90% Glycerin / PBS mit Verstärkungsringen mit einem Deckglas bedeckt.
15. Befestigen Sie die Deckgläser mit Lack und halten bei 4 ° C.

2. Tier Kappe Explantate Induction Mit Anionenaustauschharzkügelchen

1. Übertragen Sie 100 ul Anionenaustauschharzkügelchen in ein 2-ml-Röhrchen mit einer Mikropipette P1000. Mindestens fünf Mal mit sterilem destilliertem Wasser Waschen der Kügelchen. Lassen Sie die Perlen am Boden des Röhrchens sedimentieren und ersetzen Sie die sterilem destilliertem Wasser mit einer Mikropipette P1000. Berühren Sie nicht die Perlen.
2. Ließ die Perlen tränken O / N in einem 2 ml-Röhrchen mit sterilem destilliertem Wasser mit Rinderserumalbumin (BSA) (10 mg / ml) bei 4 ° C gefüllt.
3. Zwei Stunden vor dem Sammeln des ACs, statt die Hälfte der Perlen in ein neues 1,5 mlRohr mit einer Mikropipette P1000. Ersetzen den sterilem destilliertem Wasser mit 500 & mgr; l des Mediums, enthaltend das Molekül in seiner induktive Potential getestet werden oder bekanntermaßen eine spezifische Schicksal induzieren. Zu halten, die andere Hälfte der Perlen, wie sie als negative Kontrolle verwendet werden.
4. Die Perlen Inkubieren bei 4 ° C für mindestens 2 Std.
5. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte unter dem Stereomikroskop und führen alle AC Transfer mit einer Mikropipette.
6. Bringen Blastula oder sehr frühen Gastrula Embryonen in PBS mit Calcium und Magnesium mit 0,2% BSA mit einem Kunststofftransferpipette ergänzt.
   HINWEIS: Die Embryonen entwickeln bei 12 ° C Reichweite Blastula und Gastrula Stufen in 20 bis 24 Stunden.
7. Entfernen des Embryos Dotterhaut mit einer Pinzette, wie zuvor beschrieben ^20. Befestigen Sie den Embryo mit einer Pinzette. Klemmen die Dotterhaut mit der Seite der anderen Zange. Hält die Membran langsam abziehen den Embryo. Führen Sie dieses Verfahren auf dem ventrale (pflanzlichen) Seite des Embryos. Den Tier Seite des Embryos nicht beschädigen.
8. Isolieren kleiner ACs, wie zuvor beschrieben ^21. Das Tier Pol pigmentierte Teil des Embryos. Verwenden feinen Pinzette schneiden Sie ein kleines Quadrat von Gewebe aus der Tiermast. Die AC-Gewebe enthält nur die Ektodermzellen. Sicherzustellen, dass das Gewebe von gleichförmiger Dicke. Wenn nicht, entfernen Sie den AC aus der Analyse.
9. Platzieren Sie jede AC in einer Terasaki Multiwell-Platten in 0,5x Geändert Barths Saline (MBS) ^4. Setzen Sie den AC in den Brunnen mit pigmentierten Tierseite nach unten in Kontakt mit der runden Boden des Bohrlochs.
   HINWEIS: Beschichtungs Pipetten mit einer 0,1% BSA-Lösung verhindert das Anhaften von kleinen Stücken von Klebstoff mit dem Kunststoffgewebe.
10. Setzen Sie einen Wulst an jeder Kappe mit einer Mikropipette P20. Verwenden Sie bei Bedarf Pinzette vorsichtig die Perle in der Mitte der Kappe.
    HINWEIS: Wenn in einem konditionierten Medium getränkt werden die Perlen in rosa gefärbt. Wählen Sie die meisten Colored Perlen.
11. Inkubieren bei RT (18-22 ° C) für 6 Stunden ohne Bewegung der Terasaki Multiwellplatte. Der Wulst hält sich an die AC in weniger als 2 Stunden.
12. Legen Sie das Terasaki Multiwellplatte auf der Oberseite der Papiere in Wasser eingeweicht. Die Platte mit einem Kunststoffbehälter.
    HINWEIS: Diese "feuchte Kammer" verhindert ein vorzeitiges Verdampfen der Brunnen.
13. Kultur der ACS in 0,5x MBS oder 3/4 NAM (siehe Schritt 4.1) in der feuchten Kammer bei 15-20 ° C, bis die Geschwister-Embryonen die richtige Bühne, um die Wirkung Ihrer Faktor testen erreicht.
14. Befestigen Sie den ACs für 1 Stunde in frisch zubereiteten 4% PFA. Entwässern des ACS in 100% Methanol, wie zuvor beschrieben (Schritt 1.4).

3. Tier Cap Zelldissoziation und Reaggregation vor dem Pfropfen in einer Xenopus laevis Neurula

1. Mantel-Petrischalen (60 mm) oder 12 Loch-Platten mit 3% Agarose in sterilem Wasser oder in PBS ohne Calcium und Magnesium. Fügen Sie genug, um die Agarose b abdeckenottom der Petrischale oder den Brunnen. Pre-erwärmen Sie die Platten bei Raumtemperatur (18-22 ° C). Optional gespeichert die Platten für zwei Tage bei 4 ° C, um Austrocknung zu verhindern.
2. Vorbereitung calciumfreien HOLTFRETER der Kochsalzlösung (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) und HOLTFRETER der Kochsalzlösung (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM _CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,6) ^5. HINWEIS: die Lösung von CaCl _{2 kann nicht} autoklaviert werden.
3. Füllen Sie die Agarose-beschichteten auch an die Spitze mit Calcium-freien Holtfreter die Kochsalzlösung.
4. Vorbereitung Blastula oder sehr frühen Gastrula Embryonen ihre ACs isolieren, wie zuvor beschrieben (Schritte 2,5 bis 2,7).
5. Isolieren mindestens 15 oder bis zu 30, kleine ACs ^21. Verwenden feinen Pinzette schneiden Sie ein kleines Quadrat von Gewebe aus der Tiermast. Die AC-Gewebe enthält nur ektodermale Zellen und ist daher gleichmäßiger Dicke. Wenn nicht, entfernen Sie den AC aus der Analyse.
   HINWEIS: Das Tier Pol ist der Embryo Die pigmentierte Teil.
6. Übertragen Sie die ACs in einem Agarose-beschichteten auch an die Spitze mit Calcium-freien Holtfreter die Kochsalzlösung gefüllt. Legen Sie die ACs mit pigmentierten Seite nach oben.
   HINWEIS: Die Dissoziation Prozess startet schnell in calciumfreien Holtfreter die Kochsalzlösung.
7. Warten Sie ein paar Minuten für die Zellen zu starten distanziert. Beachten Sie dies durch Disaggregation der Gewebe. Verwenden feinen Pinzette, trennen Sie die pigmentierte Schicht von dem Rest des AC und entsorgen Sie sie mit einer Mikropipette P20. Vollständige Zelle Dissoziation angibt Trennung von Zellen voneinander.
   HINWEIS: Ein oder zwei pigmentierte Schichten können innerhalb der Rück aggregiert Explantat gelassen werden, um die Visualisierung während der Pfropfung zu helfen.
8. Zentrieren Sie die Zellen mit kreisenden Bewegungen der Platte. Mit einer Mikropipette P1000 vorsichtig so viel Medium wie möglich. Achten Sie darauf, um die Zellen zu berühren.
9. 1 ml HOLTFRETER die Salzlösung mit Calcium zu der Bohrung. Übertragen Sie die distanzierte ACsin ein 1,5-ml-Röhrchen.
   HINWEIS: 2-ml-Röhrchen kann nicht aufgrund ihrer Rund verwendet werden.
10. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation 5 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 2.000 rpm für eine Tischzentrifuge (500 xg). Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Mikropipette P1000.
11. Zu den dissoziierten Zellen 20 ul HOLTFRETER die Salzlösung mit Calcium (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM _CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (Sigma A-7888, pH 7,6) ^5.
12. Halten des dissoziierten ACs, 3-6 Stunden bei Raumtemperatur (18-22 ° C).
    Anmerkung: Dies ist notwendig, Zeit für die Zellen neu zu aggregieren. Die erneute Aggregation sichtbar ist, wenn die Zellen zu bilden, eine kleine Kugel an der Unterseite des Rohres.
13. Nehmen Sie das Explantat vorsichtig aus dem Boden des Röhrchens durch Zugabe von 1 ml 0,5x MBS oder von 1 ml 3/4 NAM (siehe Schritt 4.1). Übertragen Sie die Explantation in einer un-beschichtete Platte mit einem Kunststofftransferpipette.
14. Stufe werden die Explantate mit ihren Steuer Geschwister. Für Langzeitkultur Einsatz von Antibiotika: kanamycin (50 ug / ml), Ampicillin (50 ug / ml) und Gentamycin (50 ug / ml).

4. Pfropfen von Tier Caps Explantate in der Neuralplatte von X. laevis Embryo

1. Vorbereitung 3/4 NAM (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca _(NO 3) 2, 1 mM MgSO _4, 0,1 mM EDTA, 1 mM _NaHCO 3, 0,2 × PBS, 50 ug / ml Gentamycin). Nicht länger als 1 Woche zu halten für die Präparation und bei 4 ° C. Älteren NAM können zur Herstellung von Agarose-beschichteten Präparation Schalen (unten) verwendet werden.
2. Coat Petrischalen (60 mm) mit 3% Agarose in 3/4 NAM, in die kleinen Löcher wurden entweder mit einer Silikonform, oder die Abdeckung eines Tischtennisschläger gemacht.
   HINWEIS: Die Agarose den Boden der Petrischale bedeckt. Lassen Sie etwas Platz, so dass die Petrischale mit 3/4 NAM zu füllen. Alternativ machen Dissektion Gerichte mit nicht-trocknende Knetmasse. Innerhalb der Ton, drücken Sie die Embryonen leicht während der Präparation Verfahren. Graben kleine Löcher in derAgarose mit abgerundeten Pinzette dieser "Dissektion Gericht 'hilft, um die Embryonen während der Präparation Verfahren zu halten.
3. Sammeln Dissektion Werkzeuge: Kunststofftransferpipetten, ein "Augenbraue-Messer ^'22, zwei feinen Sezierung einer Pinzette, P1000 Mikropipette und Tipps, einem stereosmicroscope mit Vergrößerungs 8-40X (mit Augenbrauen Haare in Paraffin an der Spitze einer Glaspasteurpipette eingebettet ist), eine helle Lichtquelle mit Lichtwellenleiterführungen. Halten Sie alle Sezieren Werkzeuge sauber; Nach jedem Versuch, spülen Sie sie zweimal mit destilliertem Wasser, einmal mit 100% Ethanol und trocknen lassen. Lager weg von Staub und ggf. Autoklaven Metall Sezieren Werkzeuge.
4. Lassen Sie das dissoziiert und erneut aggregiert ACs (Protokoll 3) und ihre Geschwister X. laevis Embryonen entwickeln, bis sie Stufe 13 (Neurula) erreichen nach Nieuwkoop und Faber ^{Entwicklungstabelle} 17. Für die Transplantation in der Neuralplatte Stufe 13 bis 15 Embryonen der Bühne verwendet.
5. Führen Sie allenachfolgenden Schritte unter dem Stereomikroskop.
6. Mit einem Kunststofftransferpipette, übertragen Sie die Embryonen in PBS mit Calcium und Magnesium mit 0,2% BSA ergänzt. Entfernen des Embryos Dotterhaut, wie zuvor beschrieben ^20. Befestigen Sie den Embryo mit einer Pinzette. Klemmen die Dotterhaut mit der Seite der anderen Zange. Halten der Membran fest, langsam abziehen den Embryo.
   HINWEIS: Führen Sie diese Prozedur auf der ventralen (pflanzlichen) Seite des Embryos. Die Embryonen nicht beschädigen Neuralplatte. Wenn Embryonen während der Dotterhaut Entfernungsschritt beschädigt wurde, übertragen Sie die Embryonen in eine 60 mm Petrischale mit 3/4 NAM mit einem Kunststofftransferpipette und warten Sie 15 Minuten, eine ausreichende Zeit für die Heilung eintritt.
7. Füllen Sie das Sezieren Gericht an die Spitze mit frischen 3/4 NAM.
8. Mit einem Kunststofftransferpipette, übertragen Sie die Embryonen ohne ihre Dotterhaut in das Sezieren Gericht. Legen Sie die Embryonen Rückenseite nach oben indie Brunnen. Während der Übertragung nicht zulassen, dass der Embryo, in Kontakt mit der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, da X. geben laevis durch Oberflächenspannung lysiert.
9. Übertragen Sie die AC Explantat in das Sezierung Platte mit einem Kunststofftransferpipette oder einer Mikropipette P1000 gepfropft werden. Nachdem die Pipette innerhalb der Flüssigkeit, damit die Explantate langsam sinken durch Schwerkraft, oder drücken Sie ganz sanft.
10. Pflegen Sie die Embryonen mit abgerundeten Pinzette. Mit der Augenbraue Messer einen Einschnitt in das neuronale Platte, wo Sie beabsichtigen, Ihre Explantat piece pfropfen.
    HINWEIS: In der Stufe 14 die vordere Biegung der Neuralplatte kann Gebrauch als ein Wahrzeichen sein, das Zwischenhirn Gebiet (Abbildung 4) markiert.
11. Schneiden Sie ein kleines Stück Neuroepithel, mit abgerundeten Pinzette und eine Augenbraue Messer. Schneiden Sie ein kleines Stück von dem Explantat mit der Augenbraue Messer.
    HINWEIS: Das Stück Explantation sollte etwa die gleiche Größe und Form wie die Neuroepithel abgetragenen Bereich sein.
12. Legen Sie das Stück Explantat in die Neuroepithel Einschnitt mit der Augenbraue Messer und feinen Pinzette. Stellen Sie sicher, dass die Explantation schnell wird an der Embryo.
13. Alternativ legen Sie ein Stück Deckglas auf die aufgepfropften Embryo, um das Transplantat an Ort und Stelle zu halten. Um dies zu tun, machen eine gute Deckglas in sehr kleine Stücke mit grobem Pinzette. Sicherzustellen, dass die Größe etwa 1,5 mm ^2. Tauchen Sie die Stücke in eine Petrischale mit 3/4 NAM oder PBS mit einer Pinzette. Wählen Sie ein Stück Glas größer als der Embryo um Beschädigungen zu vermeiden. Der Embryo wird ein wenig abgeflacht.
14. Warten Sie mindestens 30 Minuten ohne Bewegung oder nur die Sektionsplatte bewegen sanft. Lassen Sie den Embryo zu erholen für 30 Minuten bis 2 Stunden und entfernen Sie vorsichtig das Deckglas, wenn nötig. Die gepfropft Embryonen vorsichtig Pipette in ein sauberes Geschirr mit 3/4 NAM gefüllt ist, mit Hilfe der Kunststofftransferpipette.
    HINWEIS: Gepfropfte Embryonen neigen dazu, Bakterien oder Pilze Kontamination zu entwickeln. Für langfristige culture verwenden Antibiotika: Kanamycin (50 ug / ml), Ampicillin (50 ug / ml) und Gentamycin (50 ug / ml).

Ergebnisse

Basis morphologischer Überlegungen in verschiedenen Arten, embryo Manipulationen und des Expressionsmusters von regulatorischen Genen, hält einem konzeptionellen Modell, daß das neuronale Platte in Längs- und Quersegmente, die einen Entwicklungsgittererzeugungs deutliche histogenic Felder definieren unterteilt. In der Neuralplatte, die Anlagen der Vorderhirn, Mittelhirn, Hinterhirn und Rückenmark sind alle bereits entlang der anteroposterioren (AP) Achse während der Gastrulation (in

Diskussion

Neuralen Entwicklung wird durch ein komplexes Wechselspiel zwischen zellulären Entwicklungsprogrammen und Signale von dem umgebenden Gewebe (Bewertet in ^3,31,32) instrumentiert. Eine Reihe von Protokollen, die in X verwendet werden kann Hier beschreiben wir laevis Embryonen extrinsischen und intrinsischen Faktoren in neuronalen Schicksal Entschlossenheit und neuronalen Morphogenese in vitro und in vivo beteiligt zu erkunden. Diese Protokolle können als solche auf X...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Paraformaldehyd	VWR	20909.290	Giftige
Anionenaustauscherharzkügelchen	Biorad	140- 1231
Rinderserumalbumin	SIGMA	A-7888	Für die Kultivierung von tierischen KapselnpH 7,6
Gentamycin	GIBCO	15751-045	Antibiotikum
Rinderserumalbumin	SIGMA	A7906	zur Raupenvorbereitung