Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

Zusammenfassung

Die Identifizierung von Molekülen, die mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse assoziiert sind, ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation der Funktionen dieser Regionen zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Durchführung einer technischen DNA-bindenden Molekül-vermittelten Chromatin-Imunopräzipitation (enChIP) zur Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit einer bestimmten genomischen Region assoziiert sind.

Zusammenfassung

Die Identifizierung von Molekülen, die mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse assoziiert sind, ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation der Funktionen dieser Regionen zu verstehen. Um die unvoreingenommene Identifizierung von Molekülen zu ermöglichen, die mit einer bestimmten genomischen Region von Interesse interagieren, haben wir kürzlich die Technik der DNA-bindenden Molekül-vermittelten Chromatin-Immunpräzipitation (enChIP) entwickelt. Hier beschreiben wir, wie man mit enChIP spezifische genomische Regionen isoliert und die zugehörigen Proteine und RNAs identifiziert. Zunächst wird eine genomische Region von Interesse mit einem Transkriptionsaktivator-ähnlichen (TAL) Protein oder einem CRISPR-Komplex (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) markiert, der aus einer katalytisch inaktiven Form von Cas9 und einer Guide-RNA besteht. Anschließend wird das Chromatin durch Beschallung vernetzt und fragmentiert. Der markierte Locus wird dann immunpräzipitiert und die Vernetzung wird umgekehrt. Schließlich werden die Proteine oder RNAs, die mit dem isolierten Chromatin assoziiert sind, massenspektrometrischen bzw. RNA-Sequenzierungsanalysen unterzogen. Dieser Ansatz ermöglicht die erfolgreiche Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit einer genomischen Region von Interesse assoziiert sind.

Einleitung

Die Identifizierung von Molekülen mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse verbunden ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation von genomischer Funktionen wie Transkription und epigenetischen Regulation verstehen. Obwohl mehrere Techniken für die biochemische Analyse von spezifischen genomischen Regionen ^1-7 entwickelt wurden, werden sie nicht in großem Umfang zu diesem Zeitpunkt wegen ihrer inhärenten Probleme wie begrenzte Anwendung (beispielsweise nur für eine hohe Kopienzahl Loci oder Loci mit repeats) und gebrauchte zu viel Zeit und Anstrengungen erforderlich.

Um biochemische Analyse spezifischer Genomregionen leicht durchzuführen, haben wir zwei locusspezifische Chromatinimmunpräzipitation (Chip) Technologien, nämlich Insertions- Chip (Ichip) ^8-13 und ausgeführt, DNA-bindendes Molekül vermittelte Chip (enChIP) entwickelt ^14-17 . In Ichip wird eine Locus von Interesse durch Insertion Erkennungssequenzen eines exogenen DNA-bindendes Protein wie Lex taggedA. Die Ortskurve wird dann durch Affinitätsreinigung unter Verwendung der markierten DNA-bindenden Protein isoliert. In enChIP, konstruiert DNA-bindende Moleküle, wie Zinkfinger-Proteinen, Transkriptionsaktivator-like (TAL) Proteine ​​und gruppierten regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) -Komplexe verwendet werden, um einen Ort von Interesse zu markieren (Abbildung 1). Anschließend wird die Genomregion durch Affinitätsreinigung des markierten DNA-bindenden Moleküle isoliert.

Einer der Vorteile der enChIP über Ichip dass Insertion Erkennungssequenzen eines exogenen DNA-bindendes Protein ist nicht notwendig. Targeting von Loci unter Verwendung CRISPR-Komplexe, bestehend aus einer katalytisch inaktiven Form Cas9 (dCas9) und einer Führungs RNA (gRNA) ist viel einfacher als Targeting dieser Regionen durch Ichip oder enChIP Verwendung TAL und Zinkfinger-Proteine. Hier beschreiben wir einen Schritt-für-Schritt-Protokoll für enChIP kombiniert mit Massenspektrometrie und RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) locus-Assoziationen zu identifizierented Proteinen und RNAs, die jeweils.

Protokoll

1. Design von Engineered DNA-bindende Moleküle in Anerkennung der Target-Locus

1. Für enChIP Verwendung CRISPR Komplexe, verwenden Sie die CRISPRdirect Web-Tool (http://crispr.dbcls.jp) Kandidaten gRNA Zielsequenzen in der genomischen Region von Interesse, wie zuvor beschrieben ¹⁸ zu identifizieren. Dieses Web-Tool liefert 23 bp genomischer Websites der Form 5'-N ₂₀ NGG-3 'im Zielbereich.
2. Synthetisieren eine gBlock einschließlich der U6-Promotor-Sequenz und die Sequenz der 5'-N ₂₀ in 5'-N ₂₀ NGG-3 'unter Verwendung von kommerziellen Diensten (siehe 2), ^19,20. Zur Subklonierung Zwecke umfassen geeignete Restriktionsenzymstellen außerhalb des gBlock.
3. Legen Sie die gBlock in einen geeigneten Vektor, wie zuvor beschrieben ^16. Mehrere retrovirale Vektoren für gBlocks stehen zur Verfügung (siehe Materialien).
4. Für enChIP mit TAL-Proteinen, entwerfen TAL-Proteinen in Anerkennung der target loci. Generieren Plasmide TAL-Proteinen unter Verwendung von kommerziellen Dienstleistungen, kodiert. Generieren Expressionsvektoren, die TAL-Proteinen mit einem oder mehreren Tags wie 3 × FLAG verschmolzen, wie zuvor beschrieben ¹⁵ enthält.

2. Zeitpunkt der Gründung der Zellen für die Analyse enChIP

1. Ausdruck 3 × FLAG-dCas9 und der gRNA (CRISPR-basierte Verfahren) oder 3 × FLAG-TAL (TAL Proteinbasis Verfahren) in den Zellen, wie zuvor beschrieben, um ^14-17 analysiert.
   1. Verwenden transiente Transfektion, wenn die Transfektionseffizienz ist hoch. Ein Expressionsvektor, enthaltend 3 × FLAG-dCas9 und den CMV-Promotor ist verfügbar (siehe Materialien).
   2. In Erwägung ziehen, stabile Transformanten unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, wenn die transiente Transfektion Effizienz gering ist. Zusätzlich zu den oben genannten retroviralen Vektoren für gBlock, sind retrovirale Vektoren von 3 × FLAG-dCas9 verfügbar (siehe Materialien).
2. Bestätigen der Expression des 3xFLAG-dCas9 oder 3xFLAG-TAL-Proteins in den transfizierten Zellen durch Immunoblot-Analyse unter Verwendung eines Anti-FLAG-Antikörper (Ab), wie zuvor beschrieben, ^14-17.
   Anmerkung: Die Expression dieser markierten Proteine ​​können auch durch intrazelluläre Färbung mit anti-FLAG-FITC und anschließender FACS-Analyse bestätigt werden. Ein Protokoll für die intrazelluläre Färbung steht auf unserer Homepage (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html) heruntergeladen werden.
3. Ausdruck der gRNA durch Standard-RT-PCR-Technik zu bestätigen.
4. Für quantitative Identifizierung von Proteinen in Wechselwirkung mit der genomischen Region von Interesse, zu prüfen Verwendung eines Silac (SILAC) Analyse kombiniert mit enChIP (enChIP-SILAC).
   Hinweis: Medien für das SILAC Analyse kann von kommerziellen Anbietern erworben werden. SILAC ist mächtig im Nachweis von spezifischen Wechselwirkungen.
   1. Kulturzellen in SILAC schweren Medium. Bereiten Zellen culturot im SILAC Lichtmedium als negative Kontrolle. Verwenden Sie mindestens 5 ^x 10 7 Zellen pro SILAC Medium (schwer oder leicht). Für eine effiziente Markierung hinzufügen, sowohl L-Lysin-2 ^HCl, 13 C _{6 und} L-Arginin-HCl, ¹³ _C 6, ^{15 N} ₄ in den SILAC Schwere Medien. Hinweis: Mindestens fünf Zellteilungen erforderlich, Label-Proteine ​​sind.
      1. Beispielsweise Kultur menschlichen Fibrosarkom-HT1080-Zellen, die 3xFLAG-dCas9 und gRNA bei 37 ° C und 5% CO _{2 in} DMEM-Medium für SILAC und dialysiertem fötalem Rinderserum mit Lysin-2HCl plus L-Arginin-HCl (Light-Medium) oder ¹³ C _{6 L-Lysin-2} HCl ^plus 13 _C 6 ^{15 N} ₄ L-Arginin-HCl (Heavy-Medium) (siehe Materialien) ^16. Fügen Sie 50 mg von leichten oder schweren L-Lysin-2 HCl und L-Arginin-HCl in 500 ml Medium.
      2. Trypsinize und Ausstrich Zellen, bevor sie konfluent werden, so dass Zellen aufrechtzuerhalten exponentiellen growth.

3. Vernetzung der Zellen mit Formaldehyd

1. Für Zellen in Suspensionskultur, Transfer 2 x 10 ⁷ Zellen, 3xFLAG-TAL-Proteinen oder 3xFLAG-dCas9 zzgl gRNA und Aussetzung in 30 ml regelmäßigen Kulturmedium in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen. Wenn mehr Zellen verwendet werden, erhöhen Sie die Mengen und Mengen von Reagenzien proportional. Für SILAC Experimenten, mischen Sie die Zellen, die in schweren Medium oder eine Lichtmedium (5 x ¹⁰ 7 Zellen pro Stück) kultiviert und unterteilen die Gesamtzahl von 1 x ¹⁰ 8 Zellen in 5 Röhrchen mit 2 x ¹⁰ 7 Zellen.
2. Add 810 ul 37% Formaldehyd zu 30 ml der Zellsuspension (Endkonzentration 1%) und bei 37 ° C für 5 min. Für adhärente Zellen, direkt beheben Zellen in Kulturschalen durch Zugabe von 810 ul 37% Formaldehyd und 30 ml Kulturmedium.
3. Stoppen Sie die Vernetzung durch Zugabe von 3,1 ml von 1,25 M Glycin-Lösung (Endkonzentration 127 mM) undInkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
4. Sammeln Zellen durch Zentrifugation (300 × g für 5 min bei 4 ° C). Vorsichtig den Überstand verwerfen einschließlich Formaldehyd und speichern sie in einem geeigneten Abfallflasche.
   1. Für adhärente Zellen, lösen die Zellen mit einem Zellschaber und der Ernte in einem 50-ml-Tube, und sammeln Zellen, wie in diesem Schritt beschrieben.
   2. Für SILAC Experimenten, mischen Sie die abgelösten Zellen in schweren Medium oder eine Lichtmedium (5 x 10 ^{7 Zellen} je) kultiviert, teilen Sie die Gesamtzahl von 1 x ¹⁰ 8 Zellen in 5 Röhrchen mit 2 x ¹⁰ 7 Zellen, und sammeln Zellen, wie in diesem beschrieben Schritt.
5. Zweimaliges Waschen des Zellpellets mit 30 ml PBS pro Röhrchen. Vorsichtig den Überstand verwerfen einschließlich Formaldehyd und speichern Sie es in einen geeigneten Abfall bottle.Handle Formaldehyd Abfall nach chemischen Sicherheitsrichtlinien. Die fixierten Zellen können eingefroren und bei -80 ° C gelagert werden.

4. Herstellung von Chromatin (je 2 x 10^7-Zellen)

1. Aussetzung der fixierten Zellen in 10 ml Zelllysepuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630 und 1 × Protease-Inhibitoren) und Inkubation auf Eis für 10 min.
2. Zentrifugieren Sie die Probe (830 × g bei 4 ° C für 8 min) und den Überstand verwerfen sorgfältig.
3. Aussetzen des Pellets in 10 ml Atom Lysepuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,5% Lauroylsarkosin und 1x Proteaseinhibitoren). Inkubieren auf Eis für 10 min und Vortex alle 2-3 min.
4. Zentrifugieren Sie die Probe (830 × g bei 4 ° C für 8 min) und den Überstand verwerfen sorgfältig.
5. In 10 ml PBS Waschen des Pellets. Das Pellet (Chromatin-Anteil) kann bei -80 ° C nach der sofortigen Einfrieren in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

5. Beschallung Chromatin (pro 2 x ¹⁰ 7 Zellen)

1. Hängen Sie das Chromatin Fraktion in 800 & mgr; lmodifizierte Lysepuffer 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% Natriumdeoxycholat, 0,1% SDS und Proteaseinhibitoren 1x) aufnehmen und in ein 1,5 ml Röhrchen.
2. Beschallen das Chromatin mit einem Ultraschallgerät (siehe Materialien), und die folgenden Bedingungen: Ausgang: 3; Pflicht: 100% (Dauerbetrieb); und Zeit: kostenlos. Zuführen 10-18 Zyklen der Ultraschallbehandlung für 10 s und Abkühlen auf Eis für 20 Sekunden. Eine zu starke Erwärmung zu vermeiden, läßt man die Proben auf Eis für 2 Minuten alle 5-6 Zyklen. Schaumbildung zu vermeiden, halten die Position der Spitze des Beschallungssonde 0,5 cm über dem Boden des Röhrchens.
3. Zentrifuge die Probe bei (16000 × g bei 4 ° C für 10 min) und den Überstand in ein 1,5 ml Röhrchen. Die beschallt Chromatin kann bei -80 ° C nach der sofortigen Einfrieren in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

6. Auswertung der Chromatin Fragmentation

1. Mischen Sie 10 ul der fragmentierten Chromatin mit 85 ul destilliertem Wasser.
2. In 4 ul5 M NaCl und Inkubation bei 65 ° CO / N.
3. 1 ul 10 mg / ml RNase A und bei 37 ° C für 45 min.
4. Add 2 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 ul 1 M Tris (pH 6,8) und 1 ul 20 mg / ml Proteinase K, und dann bei 45 ° C inkubieren, für 1,5 Std.
5. Separate 10 ul der Probe durch Elektrophorese in einem 1% Agarose-Gel, das keine Verfärbung Farbstoffe wie SYBR Green enthält.
6. Fleck des Gels, um die Verteilung der Längen der fragmentierten Chromatin bewerten. Bedingungen, die eine mittlere Länge von 0,5 bis 2 kbp (Bereich von 0,2 bis 4 kbp) zu erzeugen, sind zu empfehlen.
7. Reinigen DNA von den verbleibenden Proben durch Phenol-Chloroform-Extraktion oder mit Hilfe eines DNA-Extraktions-Kits (siehe Materialien). Die gereinigte DNA kann als Eingabe-DNA verwendet werden, um die Ausbeuten an enChIP Analysen (siehe 8.11) zu schätzen.

7. Herstellung von Dynabeads Conjugated Antibodies mit (je 2 x ¹⁰ 7 Zellen)

1. Prepare zwei 1,5-ml-Röhrchen, eine für Pre-Clearing mit normalem Maus-IgG und die andere für die Inkubation mit dem Anti-FLAG-Ab. Zugabe von 150 & mgr; l Protein G-konjugierten magnetischen Beads (siehe Materialien) in jedes Röhrchen.
2. Die Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren.
3. Aussetzung der Kügelchen in 1 ml PBS, enthaltend 0,01% Tween-20 (PBS-T). Die Röhrchen auf einem Magnetständer und warten Sie 2 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren, und wiederholen Sie den Schritt.
4. Aussetzung der Kügelchen in 1 ml PBS-T, enthaltend 0,1% BSA.
5. In 15 & mgr; g normalem Maus-IgG oder anti-FLAG Ab und drehen bei 4 ° CO / N.
6. Spin down kurz, dann legen Sie die Rohre auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren.
7. Suspend die Perlen in 1 ml PBS-T. Kehren Sie die Probe mehrmals und Spin-down kurz. Die Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 Minuten, dann den Überstand verwerfen durch Pipettieren. Wiederholen Sie den Waschzwei weitere Male mit PBS-T (insgesamt drei Waschschritte).

8. Chromatin Immunopräzipitation (je 2 x ¹⁰ 7 Zellen)

1. Mischen das fragmentierte Chromatin in 5.3 hergestellten) (etwa 800 ul) mit einem Fünftel des Volumens (etwa 200 ul) von modifizierten Lysepuffer 3, enthaltend 5% Triton X-100 (Endkonzentration 1% Triton X-100).
2. Fügen Sie die Chromatin-Lösung für das Rohr, in dem Protein G-konjugierten mit normalem Maus-IgG, konjugiert magnetischen Kügelchen wurden hergestellt. Rotieren bei 4 ° C für 1 Stunde.
3. Das Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min.
4. Den Überstand in das Rohr, in dem G-Protein konjugiert mit anti-FLAG Ab konjugierten magnetischen Beads wurden hergestellt. Rotieren bei 4 ° CO / N.
5. Das Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren.
6. Aussetzung der Kügelchen in 1 ml salzarme Puffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS und Proteaseinhibitoren 1x) und drehen sich bei 4 ° C für 5 min. Das Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren und wiederholen Sie den Waschschritt.
7. Der Kügelchen mit Hochsalzpuffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS und Proteaseinhibitoren 1x) zweimal zu waschen.
8. Der Kügelchen mit LiCl-Puffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% Natriumdesoxycholat und 1x Proteaseinhibitoren) zweimal zu waschen.
9. Der Kügelchen mit TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630 und 1x Proteaseinhibitoren) einmal zu waschen.
10. Suspendieren die Kügelchen in 200 & mgr; l Elutionspuffer (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630, 1x Proteaseinhibitoren und 500 ug / ml 3 × FLAG-Peptid) und bei 37 ° C 20 min. Das Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Tube und wiederholen Sie den ElutIonenschritt.
11. Reinigen DNA von kleiner Teil (zB 5%) des Eluats durch Phenol-Chloroform-Extraktion oder mit Hilfe eines DNA-Extraktions-Kits (siehe Materialien). Die gereinigte DNA kann für die PCR verwendet werden, mit spezifischen Primer-Sets, um die Erträge zu schätzen von enChIP Analysen durch Vergleich mit in Schritt 6.7, hergestellt wie zuvor ^14,16 beschriebenen Eingangs DNA.

9. SDS-PAGE, Färbung und Massenspektrometrische Analyse

1. Mischen das Eluat (400 ul) mit 1 ml 2-Propanol wurden 50 ul 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 5 ul 20 mg / ml Glykogen. Fällt das Chromatin bei -20 ° CO / N.
2. Zentrifugieren Sie die Probe (16.000 × g bei 4 ° C für 30 Minuten) und den Überstand verwerfen. Spülen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und erneut abzentrifugiert (16000 × g bei 4 ° C für 10 min). Überstand verwerfen vollständig durch Pipettieren.
3. Aussetzen des Pellets in 40 ul 2x Probenpuffer (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% Saccharose und 0,004% Bromphenolblau). Wirbel für 5 Minuten, um das Pellet vollständig aufzulösen, und dann bei 100 ° C für 30 min inkubiert, um die Proteine ​​zu denaturieren, und umgekehrt die Vernetzung.
4. Für SDS-PAGE, führen 40 ul der Probe auf das Gel, bis der Farbstoff erreicht 1 cm unterhalb der Bohrung. Hinweis: Wir verwenden normalerweise 4-20% Gradienten-Gele, aber andere% Gele verwendet werden.
5. Fleck das Gel mit Coomassie Brilliant Blue oder Silberfärbung.
6. Schneiden Sie das Gel in fünf Stücke (2 mm Höhe).
7. Führen Sie in Gel-Verdauung und massenspektrometrische Analyse wie zuvor ^13-16 beschrieben.
8. Für SILAC Experimente mit 5 x ¹⁰ 7 Zellen jeweils (insgesamt 1 × 10 ^{8 Zellen),} auszusetzen Pellet aus den ersten fünf Rohre in 40 ul 2x Probenpuffer (es ist nicht notwendig zu skalieren).

10. Reinigung von RNA und RNA-Seq Analysis

1. Um die RNA nach enChIP reinigen, fügen Sie 5 U / ml RNase Inhibitor (see Materials), um alle Pufferlösungen, ausgenommen modifizierte Lysepuffer 3 und Elutionspuffer, an die 40 U / ml RNase-Inhibitor hinzuzufügen.
2. Mischen das Eluat (400 ul) mit 16 ul 5 M NaCl und Inkubation bei 65 ° C für 2 Std.
3. 1 ml säure Guanidinium-Phenol-Reagens (siehe Materialien) zur Probe. Vortex für 15 Sekunden und dann Inkubation bei Raumtemperatur für 5-15 min. Zentrifugieren Sie die Probe für 15 min bei 12000 g und RT.
4. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 5 ul p-Bromanisol. Vortex für 15 Sekunden und dann Inkubation bei Raumtemperatur für 3-5 min. Zentrifugieren Sie die Probe für 10 min bei 12000 g und RT.
5. Den Überstand (etwa 1 ml) in ein neues 2-ml-Tube und 1 ml 2-Propanol. Das Röhrchen und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. Laden Sie die Mischung auf eine Spalte in einer RNA-Reinigungskits (siehe Materialien). Zentrifugieren Sie die Säule für 1 min bei 12000 g und RT.
6. Waschendie Säule wurde mit 400 ul Waschpuffer RNA in einem RNA-Reinigungs-Kits (siehe Materialien).
7. Werden 80 & mgr; l DNase I-Cocktail (Mischung von 5 ul DNase I (1 U / ul), 8 & mgr; l von 10 × DNase I-Reaktionspuffer, 3 ul DNase / RNase-freies Wasser und 64 ul RNA Waschpuffer eine RNA-Reinigungs-Kits (siehe Materialien)) auf die Säule. Inkubieren der Probe bei 37 ° C für 15 min und dann zu zentrifugieren für 30 Sekunden bei 12.000 × g und RT.
8. Mit 400 & mgr; l RNA PreWash Puffer in einer RNA-Reinigungs-Kits (siehe Materialien), wasche zweimal die Spalte.
9. Elution der RNA mit 50 ul DNase / RNase-freies Wasser. Die eluierte RNA zur RNA-Sequenzierung verwendet werden.

Ergebnisse

Insgesamt kann 1-30% des Ziels genomischen Regionen mittels enChIP gereinigt werden. Figur 3 enthält repräsentative Daten, die die Ausbeuten an enChIP Analysen Targeting Telomeren und den Promotor der Interferon (IFN) regulatory factor-1 (IRF-1) -Gen. Als Beispiele für typische Ergebnisse, Tabelle 1 sind die Proteine ​​mit der IRF-1-Promotors in einer IFN-spezifischen Weise durch enChIP-SILAC Tabelle identifiziert zugeordnet 2 listet die Telomer-bindenden Proteinen durch enChIP kombiniert mit Massenspektrometrie identifiziert (enChIP-MS) und Tabelle 3 zeigt die RNAs mit Telomeren enChIP-RNA-Seq identifiziert verbunden.

Abbildung 1. Übersicht über enChIP. enChIP Verwendung CRISPR (A, B) und Elemente (C, D, E Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Reihenfolge der gBlock. Die U6-Promotor (in schwarz), die G-Nukleotid-bevor die Führungssequenz (in blau), die Führungssequenz (gRNA Spacer) (in rot), das Gerüst-Sequenz (in grün) und die Terminator-Sequenz (in orange) angezeigt.

Abbildung 3. Die Renditen von repräsentativen enChIP Analysen. (A) Prozentuale Eingänge für das Soll-IRF-1-Locus und dem Nicht-Ziel Sox2 Locus. (B) Prozentsatz Eingänge für die Ziel Telomere und Nichtziel-γ-Satelliten. Die Zahlen wurden angepasst und aus früheren Veröffentlichungen ^15,16 modifiziert.

Kategorien	Proteine
Transkription	DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo Homolog, PURβ, aktiviert RNA Polymerase II Transkriptionsaktivator p15, BTF3, Myb-bindendeProtein 1A
Histondeacetylierung, Corepressor Komponenten	RBBP4, PA2G4, TBL3
Acetyltransferase	Protein-Arginin-N-Methyltransferase 1
DNA-Topoisomerase	DNA-Topoisomerase 2α
Histone	Histone H2A.Z, Histon H3.2

Tabelle 1:. Beispiele für Proteine, die mit dem menschlichen IRF-1-Promotor-Region in einem IFN-spezifischen Weise durch enChIP-SILAC identifizierten zugehörigen Die Tabelle ist aus einer früheren Veröffentlichung ¹⁶ angepasst.

Kategorien	Proteine
Säugetier Telomer-bindenden Proteinen	PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1
Telomer-binden Proteine ​​in Hefe oder anderen Organismen	IMAP4
Proteine ​​interagieren mit Telomer-Binde Proteinen assoziiert [Telomer-bindenden Protein]	DNA-Polymerase α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CtBP1 [FoxP2-POT1], Exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1], Exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT]
Proteine ​​zu lokalisieren, um Heterochromatin	BEND3
Proteine ​​regulieren epigenetische Markierungen	KDM5C
Proteine, deren Mutationen betreffen Telomerfunktion	DNA-Polymerase α (POLA1), HAT1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, Glutamat-Cystein-Ligase Glutaredoxin SMRC1

Tabelle 2:. Beispiele für Proteine ​​mit Maus Telomeren enChIP-MS identifiziert, assoziiert Tabelle bereits adapted aus einer früheren Veröffentlichung ^15.

Kategorien	RNAs
Telomerase-Komponenten	Terc, rMRP
Telomer-RNAs	Terras
scaRNAs	Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2
H / ACA snoRNAs	Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a
C / D snoRNAs	Snord17, Snord15a, Snord118
lncRNA	Neat1

Tabelle 3: Beispiele für RNAs mit der Maus Telomere durch enChIP-RNA-Seq Die Tabelle hat sich von einer früheren Veröffentlichung ¹⁷ angepasst wurden identifiziert verbunden..

Diskussion

Hier beschreiben wir die Aufreinigung spezifischer genomischer Regionen mit Hilfe von gentechnisch veränderten DNA-bindenden Molekülen wie dem CRISPR-System und TAL-Proteinen sowie die Identifizierung von Proteinen und RNAs, die an diese genomischen Regionen gebunden sind. Die Bindung von gentechnisch hergestellten DNA-bindenden Molekülen an das Genom kann die Chromatinstruktur, einschließlich der Positionierung von Nukleosomen, beeinflussen und genomische Funktionen außer Kraft setzen, wie in CRISPR-Interferenzexperimenten^{beschrieben 21}. Um diese potenziell abweichenden Effekte zu vermeiden, schlagen wir spezifische Richtlinien für die Auswahl der genomischen Zielregionen vor. Erstens, um eine mögliche Hemmung der Rekrutierung von RNA-Polymerasen und Transkriptionsfaktoren sowie eine Störung der Nukleosomenpositionierung um die Transkriptionsstartstelle zu vermeiden, sollten die Zielregionen für die Analyse von Promotorregionen mehrere hundert Basenpaare stromaufwärts von (5' zu) der Transkriptionsstartstelle liegen. Im Gegensatz dazu können bei der Analyse genomischer Regionen mit unterschiedlichen Grenzen, wie z. B. Enhancern und Schalldämpfern, genomische Regionen, die diesen Regionen direkt gegenüberstehen, ins Visier genommen werden, da es weniger wahrscheinlich ist, dass die Bindung von manipulierten DNA-bindenden Molekülen deren Funktionen beeinflusst. Darüber hinaus ist es am besten, die Verwendung von Zielregionen zu vermeiden, die bei verschiedenen Spezies konserviert sind, da wichtige DNA-bindende Moleküle oft an evolutionär konservierte Regionen binden und eine Hemmung ihrer Bindung die Funktionen der genomischen Zielregionen stören könnte. In diesem Zusammenhang ist immer zu überprüfen, ob die Funktion der genomischen Zielregion in den etablierten Zellen, die für enChIP-Analysen verwendet werden, erhalten bleibt. Da mehrere gRNAs leicht getestet werden können und es mühsam und teuer ist, mehrere Versionen von TAL- oder Zinkfingerproteinen zu erzeugen, die verschiedene genomische Zielregionen erkennen, ist enChIP mit CRISPR vorteilhafter als enChIP mit anderen Proteinen.

Es wurde gezeigt, dass dCas9 an Off-Target-Sites bindet, obwohl die Affinität zu diesen Sites schwächer sein kann als die zu den Ziel-Sites^22-25. Es gibt mehrere Möglichkeiten, die Kontamination von Molekülen zu bewältigen, die an diese Off-Target-Stellen gebunden sind. Zunächst wird die Verwendung von mehreren, mindestens zwei verschiedenen gRNAs empfohlen. Die Moleküle, die häufig in enChIP mit unterschiedlichen gRNAs beobachtet werden, wären richtig positiv. Zweitens wäre der Vergleich verschiedener Bedingungen für enChIP wirksam, um die Kontamination von unspezifischen Molekülen und Molekülen, die an Off-Target-Stellen gebunden sind, aufzuheben. Beispiele für diese Vergleichssätze wären (i) Stimulation (-) und (+) oder (ii) verschiedene Zelltypen wie T-Zellen vs. B-Zellen. Schließlich sollte eine quantitative Analyse der Bindung von Kandidatenmolekülen durchgeführt werden, um ihre spezifische Bindung an die Zielstellen zu bestätigen. Es ist vorzuziehen, Zellen als Negativkontrolle herzustellen, die nur dCas9, aber keine gRNA exprimieren.

Mit Hilfe von enChIP-Analysen konnten wir erfolgreich eine Reihe von bekannten und neuen Molekülen identifizieren, die mit spezifischen genomischen Regionen interagieren (Tabellen 1-3)^14-17. Diese Technik konnte jedoch einige andere bekannte Proteine, die mit diesen Regionen interagieren, nicht nachweisen. Zum Beispiel assoziiert STAT1 Berichten zufolge mit dem IRF-1-Promotor bei IFNγ-Stimulation⁸, aber unsere enChIP-SILAC-Analyse wies STAT1 nicht als ein Protein nach, das induziert wird, um mit dieser genomischen Region zu interagieren¹⁶. Darüber hinaus konnten wir in der enChIP-MS-Analyse von Telomeren keine Shelterin-Proteine nachweisen, die aus TRF-1 und TRF-2^{bestehen 15}, von denen gezeigt wurde, dass sie mit den Telomeren^{interagieren 26}. Es gibt einige mögliche Gründe für diese Diskrepanzen. Erstens könnte die Stöchiometrie der Bindung von Stat1 an den IRF-1-Promotor sehr gering sein. Es ist vernünftig, dass enChIP-MS, einschließlich enChIP-SILAC, Proteine nachweist, die häufiger mit genomischen Zielregionen assoziiert sind; Daher könnte die Analyse von mehr Zellen notwendig sein, um diese Proteine nachzuweisen. Eine Erhöhung der Sensitivität von MS-Instrumenten würde auch zur effizienten Detektion von Proteinen mit geringer stöchiometrischer Bindung beitragen. Zweitens könnten einige Proteine, möglicherweise einschließlich Stat1 und Shelterine, schwierige Ziele für MS-Analysen sein. Drittens könnten in unserer Analyse der Telomere-bindenden Proteine¹⁵ die 3×FLAG-TAL-Proteine, die Telomere (3×FN-Tel-TAL) erkennen, die Bindung von Shelterinen an Telomere auf kompetitive Weise blockiert haben.

Im Gegensatz zu der relativen Schwierigkeit, Transkriptionsfaktoren, die an bestimmte genomische Regionen binden, mit enChIP nachzuweisen, konnten wir mit enChIP-Analysen erfolgreich epigenetische Regulatoren wie Histonmodifikationsenzyme identifizieren. Der Erfolg dieser Technik könnte auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass epigenetische Regulatoren an eine breite Palette von Genomregionen binden; Daher stehen für MS mehr Proteine pro Genomregion zur Verfügung. Da epigenetische Regulatoren zunehmend als wichtige Angriffspunkte für Medikamente gegen hartnäckige Krankheiten wie Krebs anerkannt werden, wäre enChIP ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung epigenetischer Wirkstoffziele.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
gBlock-Synthese-Service	Life Technologies	Gensynthese von GeneArt
gBlock-Synthese-Service	IDT (Integrated DNA Technologies)	gBlocks Genfragmente
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
TAL-Syntheseservice	Life Technologies	GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3&fach; FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3&fach; FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3&fach; FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3&fach; FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
anti-FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
FITC-konjugiertes anti-FLAG M2	Sigma-Aldrich	F4049
DMEM Medium für SILAC	Life Technologies	89985	Anderes Medium kann bei Life Technologies erworben
werden Dialysiertes FBS für SILAC	Life Technologies	89986
L-Lysin-2HCl für SILAC	Life Technologies	89987	für leichtes Medium
L-Arginin-HCl für SILAC	Life Technologies	89989	für leichtes Medium
L-Lysin-2HCl, 13C6 für SILAC	Life Technologies	89988	für schweres Medium
L-Arginin-HCl, 13C6, 15N4 für SILAC	Life Technologies	89990	für schweres Medium
Vollständig, mini, EDTA-freier	Diagnostics	4693159
Ultraschall-Disruptor UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Konzentrator	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gen	311-07361
Direct-Zol RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		Eine Komponente eines nanoLC-MS/MS-Systems für die MS-Analyse
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		Eine Komponente eines nanoLC-MS/MS-Systems für die MS-Analyse
HTC-PAL Autosampler	CTC Analytics		Eine Komponente eines nanoLC-MS/MS-Systems für die MS-Analyse